Eine experimentelle Studie zur Überwinterung des Kartoffelkäfers unter natürlichen Bedingungen

Zusammenfassung

Hier stellen wir eine Methode zur Untersuchung des Winterschlafs des Kartoffelkäfers unter den natürlichen Bedingungen der gemäßigten Zone sowie eine Technik zum Sammeln von Käfern im Winter vor. Diese Methode ermöglicht es, eine gewünschte Anzahl von überwinternden Individuen für verschiedene Analysen in jedem Stadium des Winterschlafs zu erhalten.

Zusammenfassung

Einer der Hauptschädlinge der Kartoffel Solanum tuberosum L. in der gemäßigten Zone ist das Schadinsfest Kartoffelkäfer (CPB). Die meisten Studien zur Immunität und zu Erkrankungen des CPB werden während der aktiven Fütterungsphasen durchgeführt. Dennoch gibt es weniger Studien zu Ruhestadien, obwohl diese Käfer den größten Teil ihres Lebenszyklus in einem Zustand der Winterpause (Winterschlaf) verbringen. In dieser Arbeit wurde eine Methode zur Untersuchung des CPB-Winterschlafs unter natürlichen Bedingungen entwickelt und getestet, die die Möglichkeit bietet, eine ausreichende Anzahl von Individuen im Winter zu sammeln. In diesem Artikel wurde das CPB-Überleben bewertet und Infektionserreger in verschiedenen Stadien des Winterschlafs identifiziert. Die CPB-Mortalität stieg während des Winterschlafs an und erreichte im April-Mai ein Maximum. Aus den toten Insekten wurden entomopathogene Pilze (Beauveria, Isaria und Lecanicillium) und die Bakterien Bacillus, Sphingobacterium, Peribacillus, Pseudomonas und Serratia isoliert. Die Überlebensrate der Käfer über den gesamten Winterschlaf lag bei 61%. Es wurden keine gefrorenen oder getrockneten Käfer gefunden, was auf den Erfolg der vorgestellten Methode hindeutet.

Einleitung

Der Kartoffelkäfer Leptinotarsa decemlineata Say (CPB) ist ein wichtiger Schädling von Solanaceae-Pflanzen, vorwiegend Kartoffel Solanum tuberosum L. Das geografische Verbreitungsgebiet dieser Art beträgt mehr als 16 Millionen^km2 und erweitert sich ständig¹. Das CPB hat fakultative Winterdiapause, und in der gemäßigten Zone ist der Winterschlaf obligatorisch. Die Diapause wird durch eine kurztägige Photoperiode induziert und durch Temperatur¹ moduliert. Diese Käfer überwintern im erwachsenen Stadium, indem sie sich in den Boden eingraben. Mit zunehmenden Breitengraden verlängert sich die Dauer des Winterschlafs. In der gemäßigten Zone, vor allem in den nördlichen Territorien ihres Verbreitungsgebietes, dauert die Überwinterung bis zu 9 Monate: von August-September bis Mai-Juni (Noskov et al., persönliche Beobachtungen). In dieser Zeit ist das CPB – wie jedes andere Insekt in der gemäßigten Zone auch – ungünstigen Winterbedingungen ausgesetzt und muss seine Kältetoleranz erhöhen. Gleichzeitig erhöht der Kontakt der Käfer mit dem Boden das Risiko einer Infektion durch verschiedene opportunistische und pathogene Mikroorganismen². Daher müssen diese Käfer während des Winterschlafs ein gewisses Maß an Aktivität des Immunsystems aufrechterhalten, was auch energetisch kostspielig ist. Doch selbst wenn das Insekt eine Infektion überlebt, kann die Krankheit seine Kältehärte verringern³. Es sollte beachtet werden, dass niedrige Temperaturen nicht der einzige Grund für die Wintersterblichkeit des CPB sind. Eine wichtige Rolle spielt auch der Sauerstoffmangel, der unter bestimmten Bedingungen der Hauptfaktor für die Wintersterblichkeit sein^{könnte 4,5}.

Es ist bekannt, dass die natürliche Wintersterblichkeit des CPB sehr hoch sein kann und in tonigen Lehmböden 100 % erreicht⁶. Daher ist die Überwinterung eine der wichtigsten Phasen im CPB-Lebenszyklus. Dennoch sind die Daten über die Physiologie, die Aktivität des Immunsystems, das Überleben und andere Parameter des CPB-Winterschlafs unter natürlichen Bedingungen noch begrenzt. Es gibt Studien zur differentiellen Genexpression und verschiedenen physiologischen Parametern bei CPB-Erwachsenen während der Diapause und als Reaktion auf einen Kälteschock 7,8,9,10,11,12; Diese Analysen wurden jedoch hauptsächlich durch Induktion von Diapause oder Kältestress unter Laborbedingungen ohne natürliche Schwankungen von Temperatur, Luftfeuchtigkeit und nativer Erregerlast durchgeführt. Nichtsdestotrotz ist die Erforschung der Physiologie dieser Käfer, die durch Ausgrabung aus dem Boden unter natürlichen Bedingungen gesammelt wurden, wichtig. In den 1970er bis 1980er Jahren wurden verschiedene Aspekte der CPB-Überwinterung unter natürlichen Bedingungen aktiv untersucht 13,14,15,16,17,18. Andererseits wurde in diesen Studien kein CPB-Aushub aus dem Boden im Winter durchgeführt. Darüber hinaus werden eine Technik zur kontrollierten Überwinterung des CPB und eine Beschreibung der Käfige nicht im Detail bereitgestellt. Daher ist es notwendig, die Physiologie von CPBs zu untersuchen, die in natürlichen Umgebungen überwintern¹⁹.

Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur kontrollierten Überwinterung von CPB-Erwachsenen unter natürlichen Bedingungen zu entwickeln und zu testen. Die vorgeschlagene Methode ermöglicht es, eine gewünschte Anzahl von CPB-Individuen für mikrobiologische, immunologische und andere Assays während des Winterschlafs unter Feldbedingungen eines kontinentalen Klimas zu erhalten. Diese Methode kann angepasst und auf andere Insektenarten angewendet werden, die in Böden unter Schnee überwintern.

Protokoll

1. Beschreibung der Käfige für den Winterschlaf

HINWEIS: Je nach Ziel des Experiments variiert die Anzahl der Käfige. Verwenden Sie mindestens drei Käfige pro Probenahmedatum. Um die Anzahl der Käfer abzuschätzen, die schlüpfen werden, bereiten Sie mindestens drei zusätzliche Käfige vor, die erst im Frühjahr aus dem Boden geholt werden.

1. Verwenden Sie Käfige aus einem starren Holzrahmen mit einer Größe von 25 × 25 × 40 cm (L × B × H).
2. Um einen Rahmen für den Käfig zu bauen, verwenden Sie Holzlatten, die mindestens 2 cm dick und 4 cm breit sind.
3. Das Innere des Käfigs wird mit einem Edelstahlgitter mit einer Öffnungsgröße von nicht mehr als 5 mm × 3 mm abgedeckt. Verwende einen Holzhefter, um das Netz zu fixieren.
4. Befestigen Sie das Edelstahlgitter mit dem Hefter an der Außenseite des Bodens.
5. Die Innenseite des Käfigs mit einem schwarzen synthetischen Geotextil mit einer Dichte von 60 g/m² auskleiden.
   HINWEIS: Das Geotextil dient als zusätzliche Barriere, um das Entweichen der Käfer zu verhindern. Verwenden Sie es nicht in Experimenten, die sich auf aktiv bewegende Entomopathogene und Parasitoide beziehen.
6. Befestigen Sie einen ca. 60 cm hohen Schlauch aus synthetischem, durchscheinendem, atmungsaktivem Stoff fest an der Oberseite des Käfigs.
7. Kreuzen Sie zwei starke Seile und befestigen Sie sie am Boden des Käfigs, um ihn bei Bedarf aus dem Boden zu ziehen.

2. Einbau der Käfige

1. Graben Sie ein 40 cm tiefes Loch in die Erde und stellen Sie den Käfig hinein.
2. Lege trockenes Gras oder Heu auf das Loch.
3. Stellen Sie den Käfig so hinein, dass sich das Heu oder das trockene Gras zwischen den Wänden des Käfigs und der Erde befindet.
4. Füllen Sie die Käfige mit Erde aus demselben Kartoffelfeld, auf dem die Insekten gesammelt werden.
5. Installieren Sie wasserdichte Temperatur- und Feuchtigkeits-Datenlogger in den Käfigen in den erforderlichen Tiefen.
   HINWEIS: Datenlogger beliebiger Hersteller können verwendet werden und müssen bei niedrigen Temperaturen betrieben werden können.
6. Pflanzen Sie die Kartoffelsetzlinge 3-4 Wochen vor der Einführung der Käfer in jeden Käfig und gießen Sie sie mäßig.
7. Befestigen Sie einen Schlauch aus synthetischem Gewebe senkrecht an einem Stab aus einem beliebigen Material, der an der Außenseite des Käfigs angebracht ist.

3. Aufzucht von Insekten vor der Überwinterung

1. Sammeln Sie erwachsene Käfer gegen Ende der Kartoffelvegetation manuell auf pestizidfreien Kartoffelfeldern.
   HINWEIS: Ausgewachsene Käfer unterscheiden sich wesentlich von Larven und zeichnen sich durch gestreifte Flügeldecken aus, während die Larven rot sind.
2. Bewahren Sie die gesammelten Käfer in 15-20 l Plastikeimern (max. 200 Individuen pro Eimer) mit Kartoffelspitzen auf, um die Insekten zu füttern, bevor Sie sie in die Käfige setzen.
3. Decken Sie die Eimer mit atmungsaktivem Stoff ab.
   HINWEIS: Halten Sie Insekten nicht länger als 12 Stunden in Eimern. Verwenden Sie Kartoffelspitzen, die groß genug sind, um die Ansammlung von Käfern am Boden der Eimer zu verhindern.
4. Setzen Sie nicht mehr als 200 CPB-Individuen auf die Kartoffelpflanzen, die mit dem synthetischen Gewebe abgedeckt sind.
5. Wenn die Kartoffelspitzen verzehrt sind, geben Sie frische Kartoffeln in ein Plastikglas mit Wasser und wechseln Sie die Kartoffelspitzen danach täglich.
   HINWEIS: Um Stiele in einem Glas zu fixieren, verwenden Sie Watte und Parafilm. Kontrollieren Sie alte Stängel sorgfältig auf die Käfer, wenn Sie sie entfernen.
6. Sobald alle Käfer zum Überwintern in die Erde eingegraben sind, lösen Sie den Schlauch mit dem synthetischen Stoff vom Stock und legen Sie den Stoff ab.

4. Sammeln von Insekten während der Wintersaison

1. Entfernen Sie den Schnee über der Oberfläche des Käfigs.
2. Lockern Sie den Käfig auf jeder Seite mit einer starken Schaufel.
3. Ziehe den Käfig mit den Seilen aus der Erde.
4. Bringen Sie den Käfig ins Labor.
   HINWEIS: Abhängig von den Zielen des Experiments müssen überwinternde Käfer vor der Analyse inaktiv sein. In diesem Fall sollte die Temperatur im Labor während der Isolierung der Käfer aus dem Boden ~2-5 °C betragen.
5. Entferne die Erde in kleinen Portionen aus der Box, zerkleinere vorsichtig große Erdstücke und isoliere Käfer mit einer Pinzette.
6. Trennen Sie lebende Käfer von Kadavern. Lebende, gesunde Käfer bilden einen kompakten Boden um sich herum, bilden einen Lufthohlraum (eine sogenannte Wiege) und lassen sich daher leicht vom Boden trennen. Käfer, die von Pilzen getötet wurden, sind mumifiziert oder haben sichtbares Myzel auf der Oberfläche. Bakteriell zersetzende Insekten sind dunkel.
7. Siebe die Erde durch ein Sieb, um sicherzustellen, dass alle Käfer isoliert und nicht beschädigt sind.
8. Leichen mit Symptomen einer Pilzinfektion oder bakterieller Zersetzung zur späteren Identifizierung in ein einzelnes steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen legen.
9. Lebende Käfer bis zur Analyse im Kühlschrank bei einer Temperatur von 0-2 °C in einem geschlossenen, belüfteten Behälter mit einem feuchten Wattebausch lagern.

5. Aufbereitung von Organ- und Gewebeproben

1. Um die Hämolymphe zu sammeln, machen Sie mit einer Insulinnadel eine Punktion im seitlichen Teil des Bauches unter den Flügeldecken.
   HINWEIS: Während der Überwinterung wird die Menge der Hämolymphe deutlich reduziert, was das Auffangen dieser Flüssigkeit erschwert.
2. Um den Darm zu isolieren, schneiden Sie die Kopfkapsel ab, drücken Sie den gesamten Inhalt in eine Petrischale mit Phosphatpuffer, trennen Sie den Darm und reinigen Sie ihn von Fett und Malpighischen Gefäßen.
3. Trennen Sie einen gewünschten Abschnitt des Darms ab, z. B. den Vorderdarm, Mitteldarm oder Hinterdarm.
4. Um den Fettkörper zu isolieren, trennen Sie ihn nach der Isolierung des Darms von anderen Geweben.
   HINWEIS: Die isolierten Gewebe können zur Messung der Aktivität von antioxidativen und entgiftenden Enzymen (ein Beispiel: Ergänzende Abbildung 1), zur Analyse der Regulation von Genen des Immunsignalwegs (ein Beispiel: Ergänzende Abbildung 2) oder zur Metabarcodierung von Insektendarminhalten usw. verwendet werden.

6. Isolierung von Mikroorganismen aus den Kadavern

1. Um entomopathogene Pilze aus den Kadavern zu isolieren, legen Sie die mumifizierten Insekten in eine sterile Feuchtigkeitskammer.
2. Verwenden Sie Luftkonidien (falls vorhanden) oder Sklerotien aus dem Inneren der Käfer zum Auftragen von Sabouraud-Dextrose-Agar mit 0,4%iger Milchsäure.
   HINWEIS: Verwenden Sie Käfer mit Myzel und Konidien sofort zum Plattieren (ohne sie in Feuchtigkeitskammern zu stellen).
3. Isolieren Sie Bakterien aus den Kadavern mit Symptomen einer bakteriellen Zersetzung.
4. Schneiden Sie einem Käfer den Kopf ab, drücken Sie den inneren Inhalt aus und sammeln Sie ihn in Röhrchen, um ihn anschließend auf Medien für Bakterien (Luria-Bertani-Agar, Endo-Agar und Gallen-Esculin-Agar) aufzutragen.
   HINWEIS: Verwenden Sie Mikroskopie und molekulare Methoden, um Gattungen und Arten der Krankheitserreger zu identifizieren. Bei Bedarf kann eine Analyse auf das Vorhandensein anderer Parasiten durchgeführt werden.

Ergebnisse

Die folgenden Ergebnisse zu überwinternden CPBs zeigen die Bodentemperatur, das Überleben und die Infektionen.

Dynamik der Bodentemperatur.
Von Ende November bis Anfang April wurden Minustemperaturen in den Käfigen in 30 cm Tiefe registriert (Abbildung 1). Die Durchschnittstemperatur lag in diesem Zeitraum bei minus 3,3 ± 0,1 °C (Mittelwert ± Standardfehler). Die niedrigste gemessene Temperatur lag Mitte Februar bei minus 7,9 °C.

Diskussion

Diese Studie zeigt, dass die vorgeschlagene Methode zur Untersuchung der Überwinterung von CPBs es uns ermöglicht, eine ausreichende Anzahl von Insekten in verschiedenen Perioden des Winterschlafs zu erhalten. Der Erfolg der vorgestellten Technik hängt von mehreren unabhängigen Faktoren ab, von denen der wichtigste die Wetterbedingungen sind. In einem kalten, schneelosen Winter kann der Boden bis zur gesamten Tiefe des Käfigs gefrieren. In diesem Fall steigt das Sterberisiko aller Käfer deutlich an

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar-agar bacteriological purified	diaGene	1806.5000
Bile Esculin Agar	HiMedia	M972
Endo Agar	HiMedia	M029
Glucose monohydrate-D	PanReac Applichem	143140.1000Φ
Lactic acid	PanReac Applichem	141034.1211
Luria-Bertani liquid medium	HiMedia	G009
15 ml conical centrifuge tubes	Axygen	SCT-15ML-25-S
Peptone	FBIS SRCAMB	M030/O61
Phosphate buffered saline	Medigen	PBS500
Temperatutre and humidity datalogger Ecklerk-M-11	Relsib		Waterproof datalogger