غرسة DREAM: نظام زرع خفيف الوزن ومعياري وفعال من حيث التكلفة للفيزيولوجيا الكهربية المزمنة في الفئران الثابتة الرأس والتصرف بحرية

Summary

هنا ، نقدم نظام زرع مسبار خفيف الوزن وفعال من حيث التكلفة للفيزيولوجيا الكهربية المزمنة في القوارض محسن لسهولة الاستخدام ، واستعادة المسبار ، والتنوع التجريبي ، والتوافق مع السلوك.

Abstract

حسنت التسجيلات الكهربية المزمنة في القوارض بشكل كبير فهمنا لديناميكيات الخلايا العصبية وأهميتها السلوكية. ومع ذلك ، فإن الطرق الحالية لزرع المجسات بشكل مزمن تقدم مقايضات حادة بين التكلفة وسهولة الاستخدام والحجم والقدرة على التكيف والاستقرار على المدى الطويل.

يقدم هذا البروتوكول نظاما جديدا لزرع مسبار مزمن للفئران يسمى DREAM (ديناميكي ، قابل للاسترداد ، اقتصادي ، قابل للتكيف ، ومعياري) ، مصمم للتغلب على المقايضات المرتبطة بالخيارات المتاحة حاليا. يوفر النظام حلا خفيف الوزن ومعياريا وفعالا من حيث التكلفة مع عناصر أجهزة قياسية يمكن دمجها وزرعها في خطوات مباشرة وزرعها بأمان لاستعادتها وإعادة استخدامها عدة مجسات ، مما يقلل بشكل كبير من التكاليف التجريبية.

يدمج نظام الزرع DREAM ثلاث وحدات للأجهزة: (1) محرك أقراص صغير يمكنه حمل جميع مجسات السيليكون القياسية ، مما يسمح للمجربين بضبط عمق التسجيل عبر مسافة سفر تصل إلى 7 مم. (2) تصميم ثلاثي الأبعاد (ثلاثي الأبعاد) قابل للطباعة ومفتوح المصدر لقفص فاراداي يمكن ارتداؤه مغطى بشبكة نحاسية للتدريع الكهربائي وحماية الصدمات ووضع الموصل ، و (3) نظام تثبيت رأس مصغر لتحسين رفاهية وسهولة الاستخدام. تم تحسين بروتوكول الجراحة المقابل للسرعة (المدة الإجمالية: 2 ساعة) ، وسلامة المسبار ، ورعاية.

كان للغرسات تأثير ضئيل على الذخيرة السلوكية للحيوانات ، وكانت قابلة للتطبيق بسهولة في سياقات متحركة بحرية وثابتة الرأس ، وقدمت أشكالا موجية يمكن تحديدها بوضوح واستجابات عصبية صحية لأسابيع من جمع البيانات بعد الزرع. كانت العدوى ومضاعفات الجراحة الأخرى نادرة للغاية.

على هذا النحو ، يعد نظام زرع DREAM حلا متعدد الاستخدامات وفعالا من حيث التكلفة للفيزيولوجيا الكهربية المزمنة في الفئران ، مما يعزز رفاهية ، ويتيح المزيد من التجارب السليمة من الناحية الأخلاقية. يبسط تصميمه الإجراءات التجريبية عبر الاحتياجات البحثية المختلفة ، مما يزيد من إمكانية الوصول إلى الفيزيولوجيا الكهربية المزمنة في القوارض لمجموعة واسعة من مختبرات الأبحاث.

Introduction

برز الفيزيولوجيا الكهربية مع مجسات السيليكون المزروعة بشكل مزمن كتقنية قوية للتحقيق في النشاط العصبي والاتصال في التي تتصرف ، وخاصة في الفئران ، بسبب قابليتها للسحب الوراثية والتجريبية¹. أثبتت مجسات السيليكون الصفائحية ، على وجه الخصوص ، أنها أداة لا تقدر بثمن لتحديد العلاقات الوظيفية داخل الأعمدة القشرية² ولربط ديناميكيات المجموعات العصبية الكبيرة بالسلوك بطريقة كانت مستحيلة سابقا³.

هناك نهجان متكاملان هما المعايير الذهبية الحالية لتسجيل النشاط العصبي في الجسم الحي: المجهر ثنائي الفوتون ^4,5 والفيزيولوجيا الكهربية^{خارج الخلية 6}. يقيد اختيار منهجية التسجيل طبيعة القراءات التي يمكن الحصول عليها: الفحص المجهري ثنائي الفوتون مناسب بشكل خاص للدراسات الطولية للخلايا العصبية التي يمكن تحديدها بشكل فردي في مجموعات كبيرة عبر الوقت ولكنه يعاني من ارتفاع تكاليف المعدات ويقتصر على الطبقات السطحية من القشرة في الأدمغة السليمة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الدقة الزمنية النموذجية ~ 30 هرتز تحد من قدرتها على التقاط ديناميكيات الخلايا العصبية المستمرة ^7,8.

في المقابل ، توفر التسجيلات الفيزيولوجية الكهربية دقة زمنية عالية (تصل إلى 40 كيلو هرتز) لتتبع النشاط العصبي لحظة بلحظة ، ويمكن تطبيقها على نطاق واسع عبر الأنواع وكذلك عبر الأعماق القشرية ، ولها إعدادات منخفضة التكلفة نسبيا مقارنة بالمجهر ثنائي الفوتون. ومع ذلك ، من الصعب تحديد الخلايا العصبية الفردية ، وكذلك التتبع الطولي لمجموعات الخلايا العصبية. ينطبق هذا بشكل خاص على أقطاب الأسلاك ، على سبيل المثال ، رباعيات ، وعلى إدخالات القطب الحاد. إلى جانب الافتقار إلى القدرة على تتبع الخلايا العصبية عبر جلسات التسجيل⁹ ، تسبب عمليات الإدراج الحادة المتكررة صدمة محلية¹⁰ تؤدي إلى استجابة مناعية¹¹ ، مما يزيد من فرصة الإصابة بالعدوى والتسمم الغذائي. هذا يقلل في نهاية المطاف من استقرار النشاط العصبي المسجل ومتوسط العمر المتوقع لحيوانات التجارب ، مما يحد من نطاق الدراسات الطولية التي تعرض التسجيلات الكهربية الحادة إلى بضعة أيام فقط¹².

تهدف تسجيلات مسبار السيليكون المزمن عالي الكثافة إلى الجمع بين بعض أفضل سمات الفيزيولوجيا الكهربية الحادة والتصوير ثنائي الفوتون. يمكنهم تتبع ديناميكيات السكان العصبية عبر الجلسات مع قدرة منخفضة إلى حد ما على تحديد الخلايا العصبية الفردية مقارنة بالتصوير ثنائي^{الفوتون 13}. توفر هذه التسجيلات مرونة عالية في التنسيب المكاني والدقة الزمنية الدقيقة للإشارات المسجلة ، فضلا عن تحسين طول العمر ورفاهية التجارب مقارنة بالتسجيلات الحادة¹⁴. علاوة على ذلك ، على عكس التسجيلات الحادة ، لا يتطلب الفيزيولوجيا الكهربية المزمنة سوى حدث زرع واحد ، مما يقلل بشكل فعال من خطر العدوى وتلف الأنسجة ويقلل من الضغط على¹⁵. بشكل جماعي ، تجعل هذه المزايا الفيزيولوجيا الكهربية المزمنة أداة قوية للتحقيق في تنظيم ووظيفة الجهاز العصبي.

ومع ذلك ، فإن تقنيات الزرع المزمن شائعة الاستخدام للفئران تقيد الباحثين لإجراء مقايضات كبيرة بين التوافق مع التسجيلات السلوكية ، ووزن الزرع ، وتكرار الغرسات ، والتكاليف المالية ، وسهولة الاستخدام بشكل عام. لم يتم تصميم العديد من بروتوكولات الزرع لتسهيل إعادة استخدام المجسات¹⁶ ، مما يرفع بشكل حاد التكلفة الفعالة للتجارب الفردية وبالتالي يجعل من الصعب ماليا على بعض المختبرات استخدام الفيزيولوجيا الكهربية المزمنة. كما أنها غالبا ما تتطلب نماذج أولية داخلية واسعة النطاق وأعمال تصميم ، والتي قد لا تكون الخبرة والموارد موجودة لها.

من ناحية أخرى ، توفر أنظمة الزرع المتكاملة¹⁷ حلا يمكن الوصول إليه على نطاق أوسع للفيزيولوجيا الكهربية المزمنة في القوارض. تم تصميم هذه الأنظمة لدمج محرك ميكرودرايف يحمل المسبار مع بقية الغرسة لتبسيط التعامل مع الغرسة والإجراءات الجراحية. ومع ذلك ، بمجرد زرعها ، يمكن أن تكون هذه الأنظمة ثقيلة للغاية وتحد من قدرة المجرب على تكييف التجربة بمرونة مع إحداثيات الهدف المختلفة. في كثير من الأحيان ، يمنع وزنهم الغرسات في الصغيرة ، ويحتمل أن يضعف حركة ويحفز الإجهاد¹⁸. يمكن أن يؤثر هذا بشكل غير متناسب على الأبحاث على مجموعات الأحداث والإناث ، حيث من المرجح أن تؤثر قيود الوزن على هذه المجموعات.

بالإضافة إلى ذلك ، لا تسمح جميع الأنظمة المتكاملة بتعديل مواضع الأقطاب الكهربائية بعد الزرع. هذا أمر مهم ، لأن التسمم أو التندب بسبب إدخال المسبار¹⁹ ، خاصة في ال 48 ساعة الأولى بعد الزرع²⁰ ، يمكن أن يقلل من جودة النشاط العصبي المسجل. يمكن أن تحد التعديلات الدقيقة على عمق إدخال المسبار من هذه الآثار السلبية على سلامة الإشارة. لذلك ، يمكن أن تكون آليات تحديد المواقع الدقيقة ، التي تسمى عادة محركات الأقراص الصغيرة ، مفيدة حتى في المجسات التي تحتوي على عدد كبير من الأقطاب الكهربائية الموزعة على طولها.

للتغلب على مثل هذه المقايضات ، نقدم نظاما جديدا للفسيولوجيا الكهربية المزمنة للفئران يعالج قيود التصميمات السابقة من خلال تقديم حل خفيف الوزن وفعال من حيث التكلفة ومعياري. تم تصميم نظام غرسة DREAM ليزن أقل من 10٪ (~ 2.1 جم) من وزن جسم الفأر النموذجي ، مما يضمن رفاهية والحد الأدنى من التأثير على السلوك. يظهر التحقق من صحة تصميم غرسة DREAM تأثيرا ضئيلا على المقاييس السلوكية الرئيسية مثل الحركة - والتي يمكن أن تتأثر بشكل كبير في القوارض عند وضع الأحمال على الجمجمة. يمكن أن يفيد ذلك النماذج التجريبية التي تستخدم المتحركة بحرية وكذلك الثابتة الرأس من خلال تعزيز رفاهية والسماح بإجراء تجارب أكثر صحة من الناحية الأخلاقية.

يشتمل النظام على محرك ميكرودرايف للضبط المرن لعمق التسجيل حتى 7 مم ويمكن تكييفه مع أنواع مختلفة من المجسات وأجهزة التسجيل ، مما يوفر للباحثين أداة فعالة من حيث التكلفة ومتعددة الاستخدامات لمختلف التطبيقات التجريبية. يتم دمج النظام بشكل روتيني مع محرك ميكرودرايف معدني²¹ ، والذي يوفر استردادا ثابتا للمسبار مقارنة بالأنظمة الأخرى (متوسط معدل الاسترداد المتوقع: حوالي ثلاث عمليات إعادة استخدام موثوقة لكل مسبار) ويقلل بشكل كبير من تكلفة التجارب الفردية.

يتميز التصميم بقفص فاراداي الواقي المطبوع بتقنية 3D ، مما يسمح بحماية رخيصة ولكنها قوية من الضوضاء الكهربية والتأثيرات الميكانيكية والمواد المعدية ، مما يتيح تسجيلات مستقرة وخالية من الضوضاء تعاني من الحد الأدنى من معدلات الإصابة. يتكون هذا القفص القابل للزرع مما يسمى ب "التاج" ، المصمم للحماية من الصدمات ولتوفير هيكل للطلاء الشبكي المعدني الموصل لقفص فاراداي ، وحلقة التاج ، التي تعمل كحامل لمكبر صوت قابل للزرع و / أو موصل مسبار (انظر الشكل 1).

أخيرا ، تم تصميم ألواح الرأس المضمنة في نظام الغرسة المعياري لتكون متوافقة مع نظام تثبيت الرأس الجديد والفعال دون إضافة كتلة إضافية إلى الغرسة. على عكس الأنظمة الأخرى الموجودة ، فإنه لا يتطلب شد مسامير صغيرة بالقرب من الغرسة ، وتسريع تثبيت الفئران في الإعداد التجريبي ، وتحسين العلاقة بين المجرب ، وكذلك الالتزام السلوكي. في الوقت نفسه ، يتم استخدام صفيحة الرأس كقاعدة لبناء الوحدات الأخرى لنظام الفيزيولوجيا الكهربية المزمن DREAM.

يتم نشر ملفات التصميم الخاصة بغرسة DREAM كأجهزة مفتوحة المصدر في https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/. في الأقسام التالية ، سيتم وصف تصميم وتصنيع نظام زرع DREAM ، وسيتم إثبات تنفيذه الناجح في نموذج الماوس ، وسيتم مناقشة تطبيقاته ومزاياه المحتملة مقارنة بالأنظمة الحالية.

Protocol

أجريت جميع الإجراءات التجريبية وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لجمعية ماكس بلانك ووافقت عليها اللجنة الأخلاقية للحكومة المحلية (Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz, Regierungspräsidium Hessen, Project approval code: F149-2000).

الشكل 1: تصميم الزرع. (أ) عرض 3D للزرع متراكب على جمجمة فأر مع مسبار سيليكون متصل بموصل مسبار. تبلغ الفتحة المركزية للوحة الرأس حوالي 10 مم للمقياس. يبلغ ارتفاع محرك الأقراص حوالي 17 ملم. لا تظهر الشبكة النحاسية التي تشكل الجزء الخارجي من تاج فاراداي ، وكذلك الأسلاك الأرضية / المرجع. (ب) مثل (أ) مع اتصال بلوحة مكبر للصوت بدلا من موصل مسبار. (ج) انفجار رسم فني للغرسة يوضح مكوناتها. (د) تقديم فاصل بزاوية يمكن زرعه أسفل محرك أقراص صغير ، مما يسمح بزرع محرك الأقراص الصغير باستمرار بزاوية محددة مسبقا (هنا: 20 درجة). (ه) تقديم آلية تثبيت الرأس المتكاملة ، تظهر صفيحة الرأس المزروعة مع تاج فاراداي مع مشبك تثبيت الرأس المحيط ووصلة ذيل الحمامة بالإعداد. (F) صورة لرأس فأر مثبت على جهاز المشي باستخدام آلية تثبيت الرأس المدمجة في الغرسة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ملاحظة: يناقش القسمان 1 و 2 الاستعدادات قبل الجراحة

1. إعداد مسبار السيليكون

1. في حالة إعادة استخدام المسبار ، قم بتنظيف مسبار السيليكون وفقا لتوصيات مورد المسبار. انقع المسبار في منظف إنزيمي (انظر جدول المواد) لمدة 5-10 دقائق ، ثم اشطفه بالماء منزوع المعادن. افعل ذلك في أسرع وقت ممكن بعد الزرع. قبل يوم واحد من (إعادة) الزرع ، انقع المسبار في 70٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة على الأقل للتطهير.
2. قياس مقاومات القناة للتأكد من أنها ضمن مواصفات الإشارة المسجلة. اتبع بروتوكول اختبار مستويات الضوضاء من دليل مستخدم Neuropixels²² ، وقم بقياس المقاومة عبر برنامج التسجيل المطلوب (على سبيل المثال ، https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing) واتبع معاوقة القناة المستهدفة من الشركة المصنعة لمسبار السيليكون أو ورقة البيانات. إذا كانت المعاوقة عالية جدا ، ففكر في إعادة طلاء مواقع القطب²³.
3. لحام مقبس ذيل لحام 0.05 بوصة (انظر جدول المواد) إلى سلك الأرض (GND) للمسبار. قم بتوصيل المقبس بدبوس GND (الخطوة التالية) أثناء الجراحة.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول ، لا يتم استخدام دبوس مرجعي منفصل (REF) ، حيث يتم تقصير GND و REF على الكواليس المستخدمة. لذلك ، سيتم ذكر دبوس GND فقط في بقية البروتوكول. إذا تم استخدام REF منفصل، كرر الخطوة التالية لدبوس REF.
4. لتحضير دبوس GND ، أدخل جانب الدبوس بشكل متكرر لمقبس ذيل اللحام مقاس 0.05 بوصة (انظر جدول المواد) في مقبس ذيل اللحام GND 0.05 بوصة حتى يصبح الإدخال سهلا إلى حد كبير. يمكن أن يقلل استخدام الدبابيس المطلية بالذهب من الحاجة إلى خطوة التنعيم هذه. هذا يضمن أنه يمكن توصيل دبوس GND والمقبس بسهولة أثناء الجراحة دون الحاجة إلى ممارسة ضغط مفرط ، مما يقلل من خطر إصابة وتلف المسبار.
5. إذا تم استخدام مضخم أولي قابل للزرع لمسبار السيليكون ، فقم بإعداده للزرع المزمن باتباع إجراءات المورد. ثم قم بتوصيل مكبر الصوت / الموصل بحلقة قفص فاراداي باستخدام جص السيليكون للصقه بمنطقة حلقة فاراداي المصممة لحمل مكبر الصوت (انظر الشكل 1).
   ملاحظة: قد يتضمن تحضير المضخم الأولي القابل للزرع لمسبار السيليكون للزرع المزمن باتباع إجراءات المورد طلاءها بالسيليكون أو الإيبوكسي لتجنب إتلاف الرطوبة للإلكترونيات ، بالإضافة إلى تزاوج موصل مكبر الصوت بشكل متكرر لتقليل قوة التزاوج عند توصيل مكبر الصوت بنظام التسجيل أثناء التسجيلات. هذا مفيد بشكل خاص لمستخدمي Omnetics.

2. إعداد microdrive وأغطية الرأس

1. أدر المسمار الموجود على جسم محرك الأقراص الصغير بحيث يتم سحب مكوك microdrive بالكامل تقريبا لأعلى.
2. اختياريا ، قم بتوصيل فاصل بزاوية (انظر الشكل 1 د) بالجزء السفلي من محرك الأقراص الصغير باستخدام غراء cyanoacrylate أو الأسمنت السني ، والذي يمكن استخدامه للسماح باستخدام درجة معينة من الميل ، على سبيل المثال ، عند التسجيل من خلال الطبقات القشرية في منطقة داخل التلم المركزي ، أو داخل الهياكل العميقة التي قد تتطلب نهجا غير عمودي (للفاصل بزاوية ، انظر جدول المواد).
3. ضع محرك الأقراص الصغير أفقيا على حامل محرك الأقراص الصغير (الشكل التكميلي 1).
4. ضع قطعة صغيرة من المعجون اللاصق (انظر جدول المواد) على حامل محرك الأقراص الصغير على مسافة أعلى من محرك الأقراص الصغير الذي سيتم وضع موصل مرحلة الرأس فيه. تعتمد هذه المسافة على طول الكبل المرن الذي يربط مسبار السيليكون بموصل مرحلة الرأس.
5. ضع قطرة صغيرة من جص السيليكون (انظر جدول المواد) على المكوك.
6. أخرج مسبار السيليكون من عبوته بمساعدة ملقط حاد ناعم الرأس. اصنعها عن طريق طلاء ملقط الأنف القياسي بأنابيب الانكماش الحراري بقطر 3 مم (انظر جدول المواد). ضع المسبار باستخدام الكبل المرن أولا على مكوك محرك الأقراص الصغير بحيث تتدلى الحافة السفلية للكابل المرن قليلا فوق الحافة السفلية لمكوك محرك الأقراص الصغيرة.
7. اسحب الكبل المرن برفق نحو الجزء العلوي من محرك الأقراص الصغير حتى تلتقي الحافة السفلية للكابل المرن بالحافة السفلية لمكوك محرك الأقراص الصغير. تأكد من دفع الكبل المرن مقابل الحافة اليسرى لمكوك microdrive أثناء هذه الخطوة بحيث يتم وضعه عموديا تماما على محرك الأقراص الصغير في النهاية. في هذه المرحلة ، تأكد من أن سيقان مسبار السيليكون لا تبرز (أو الحد الأدنى فقط) بعد الحافة السفلية للمحرك الصغير (اعتمادا على الطول الدقيق لسيقان المسبار وعمق منطقة الدماغ المستهدفة).
8. ضع موصل مرحلة الرأس للمسبار على المعجون اللاصق أعلى الحامل لحماية المسبار من السقوط.
9. استخدم إبرة حقنة 27 جم لوضع قطرة صغيرة من غراء cyanoacrylate (انظر جدول المواد) بين الكابل المرن والمكوك لتثبيت المسبار في مكانه. تأكد من عدم تشغيل الغراء على محرك الأقراص الصغير أو على طول الكابل المرن خارج المكوك (هذا مهم جدا)
10. بمجرد لصق الكبل المرن في موضعه ، قم بتوصيل مكبر الصوت بحلقة التاج (انظر جدول المواد) باستخدام جص السيليكون. بعد ذلك ، قم بتوصيل الكبل المرن بمكبر الصوت وقم بتغطية التوصيل والكابل بطبقة رقيقة من جص السيليكون.
11. بعد 5 دقائق ، عندما يتم ضبط الجص ، قم بتخزين محرك الأقراص الصغير والتحقيق بأمان حتى الاستخدام مرة أخرى.
12. قطع قطع من شبكة النحاس (انظر جدول المواد) في شكل دونات مفتوح (انظر نمط القطع في الشكل التكميلي 2) لتغطية قفص فاراداي.
13. اربط فتحة الشبكة النحاسية على قفص فاراداي بقطرات صغيرة من راتنجات الايبوكسي (انظر جدول المواد). في هذه الخطوة ، يمكن للمرء أيضا استبدال الايبوكسي بأسمنت الأسنان.
    ملاحظة: يحتوي قفص فاراداي على مساحة لإيواء موصل مسبار أو مكبر للصوت. تم تمييز هذه المساحة بعلامة X في ملف التصميم ، وتحتوي على قاعدة داعمة لمكبر الصوت / الموصل ، بالإضافة إلى مسافة أكبر بين المتحدثين المتجاورين للقفص. لإنشاء مساحة كافية حول مكبر الصوت / الموصل ، قم بتثبيت كمية صغيرة من الشبكة الإضافية بين المتحدثين المتجاورين ، مما يؤدي إلى إنشاء نتوء. هذا يضمن أنه يمكن وضع مكبر الصوت / الموصل لاحقا في هذا "الجيب" دون لمس قفص فاراداي. لضمان التصاق آمن مع الحد الأدنى من الالتواء ، استخدم حلقة التاج الموضوعة مباشرة على التاج للحفاظ على الشكل ولدعم المتحدث الرفيع للتاج. علاوة على ذلك ، استخدم أيدي مساعدة اللحام لتأمين التاج والشبكة أثناء التجفيف. إذا كان المرء يكافح للحفاظ على شكل التاج عند الخضوع لهذا الإجراء ، فحاول الإيبوكسي اثنين فقط من أذرع التاج في وقت واحد لمنع الالتواء.
14. إذا كانت هناك رغبة في تأريض منفصل لقفص فاراداي ، فقم بلحام دبوس رأس صغير على سلك تأريض 30 مم (انظر جدول المواد) ، ثم استخدم الإيبوكسي الموصل للصق السلك بقطع الشبكة النحاسية.
    ملاحظة: لا يتم الالتزام بهذه الخطوة في المختبر.
15. في هذه المرحلة ، قم بتخزين الأجزاء المعدة بأمان ، وقم بإجراء الجراحة في مرحلة لاحقة.
    ملاحظة: تناقش الأقسام 3-6 زرع محرك الأقراص الصغير وأغطية الرأس.

3. الجراحة: إعداد المسبار ومساحة العمل

1. تعقيم ووضع الأدوات الجراحية في مساحة العمل الجراحية بعد إجراء معتمد.
   ملاحظة: يمكن أن يشمل ذلك استخدام معقم الخرز أو أدوات التعقيم أو الشطف بنسبة 30٪ بيروكسيد أو 90٪ إيثانول ، اعتمادا على البروتوكول التجريبي المعتمد.
2. ضع طبق السيراميك المستخدم لتحضير الأسمنت السني في صندوق ثلج أو ثلاجة أو فريزر ، باتباع التعليمات الموجودة في مجموعة الأسمنت السنية (انظر جدول المواد). استخدم طبق السيراميك المبرد أثناء خلط الأسمنت لزيادة الوقت الذي يصبح فيه الأسمنت مرنا. استخدم طبقا مبردا كلما كانت هناك حاجة إلى خطوات تدعيم أطول.
3. إذا كان التحقق النسيجي من وضع المسبار في نهاية التجربة مطلوبا ، فقم بتمديد مسبار السيليكون قبل الجراحة مباشرة عن طريق تدوير المسمار على محرك الأقراص الصغير عكس اتجاه عقارب الساعة وتطبيق صبغة محبة للدهون (انظر جدول المواد) على المسبار عن طريق غمسه في قطرة صغيرة من الصبغة. قم بإعداد الصبغة المحبة للدهون من محلول مخزون مخفف ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) أو إيثانول (EtOH) تم شراؤه تجاريا (انظر جدول المواد) عن طريق تخفيفه في مخزن مؤقت مناسب مثل PBS بتركيز 1-5 ميكرومتر.

4. الجراحة: تحضير

1. اتبع بروتوكول التخدير المعتمد لجراحة القوارض لمدة 2-4 ساعات في ظل ظروف معقمة. يمكن أن يشمل ذلك التخدير العام والموضعي ، وتسكين الألم ، وتطبيق مراهم العين ، وحقن المياه المالحة. هنا ، استخدم التخدير عن طريق الحقن (الكيتامين 100 [مجم / كجم] / ميديتوميدين 0.5 [مجم / كجم]) مع كريم التسكين الموضعي ومرهم العين (انظر جدول المواد) ، وضع على وسادة تدفئة لتنظيم درجة حرارة الجسم.
2. عندما يتم تخدير بالكامل ، انقله إلى منطقة حلاقة منفصلة غير معقمة.
   1. تأكد من أن دافئ بما فيه الكفاية ؛ على سبيل المثال ، ضعه على وسادة تدفئة. إزالة الشعر على الجزء العلوي من الجمجمة. افعل ذلك باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية أو كريم إزالة الشعر (انظر جدول المواد) أو عن طريق حلق الجزء العلوي من الرأس بشكل متكرر بمشرط مغطى بالإيثانول بنسبة 70٪.
   2. قم بإزالة الشعر المتساقط بعناية للتأكد من عدم ملامسته للأنسجة المكشوفة لاحقا. لإزالة الشعر ، استخدم ، على سبيل المثال ، الأنسجة المبللة بنسبة 70٪ من الإيثانول و / أو مضخة كرة الضغط. في حالة استخدام كريم إزالة الشعر ، تأكد من إزالته باستخدام مسحات القطن والمالحة جيدا.
3. قم بتطهير المنطقة المحلوقة عدة مرات بمطهر يحتوي على اليود (انظر جدول المواد) والكحول باستخدام مسحات القطن ، والانتقال من وسط الرأس إلى الجانبين لتنظيف أي شعر سائب متبقي بعيدا عن موقع الشق.
4. تطهير الفراء على وحول الرأس باستخدام betadine. هذا يضمن منطقة عمل معقمة ويحمي الأدوات والمواد الجراحية من ملامسة الفراء غير المعقم.
5. ضع في إطار تجسيمي باستخدام قضبان الأذن وحامل الأنف (انظر جدول المواد).
6. باستخدام مقص جراحي صغير (انظر جدول المواد) ، قم بقطع فتحة على شكل لوز في الجلد أعلى الجمجمة ، وتصل من الجزء الخلفي فقط من خياطة لامدا إلى ما بين العينين.
7. قم بإزالة الغشاء تحت الجلد والسمحاق عن طريق القطع بينما لا يزال رطبا ، ثم خدش الجمجمة بشفرة مشرط لإزالة أنسجة الغشاء الرخوة على سطح الجمجمة التي قد تعيق التصاق الأسمنت السني.
8. اختياري: بمجرد تطهير الجمجمة من أنسجة الغشاء ، ضع لفترة وجيزة طبقة رقيقة من بيروكسيد 0.5٪ واغسلها بمطهر اليود المائي (على سبيل المثال ، Betadine) قبل تخشين سطح الجمجمة لتحسين التصاق التمهيدي بالجمجمة.
9. خشونة سطح الجمجمة بعناية عن طريق خدش نمط متقاطع مع طرف المشرط مقلوبا رأسا على عقب. هذا يساعد الأسمنت السني على الالتصاق بالجمجمة لاحقا.
   ملاحظة: لا تخدش بقوة فوق الغرز لأن هذا يمكن أن يتسبب في تمزق الغرز وتسرب السائل داخل الجمجمة ، مما يضعف التصاق الأسمنت السني.
10. قم بالتبديل بين شفرة المشرط وبراعم القطن المعقمة لحك / دفع عضلات الرقبة برفق إلى جوانب خياطة لامدا حتى يتم دفع العضلات مرة أخرى إلى "حافة" الجمجمة أعلى المخيخ. هذا يساعد على تقليل ضوضاء العضلات في التسجيلات العصبية.
11. املأ حقنة سعة 1 مل بإبرة 27 جم (انظر جدول المواد) بكميات صغيرة من غراء cyanoacrylate الجراحي (انظر جدول المواد). بعد ذلك ، قم بلصق الجلد على حواف الجمجمة باستخدام المحقنة لتشويه قطرات صغيرة من الغراء الفائق عبرها. قم بغراء الأنسجة بشكل مسطح قدر الإمكان على الجمجمة لترك مساحة للزرع. يضمن هذا الإجراء عدم ملامسة الجلد والعضلات مباشرة لأجزاء من الغرسة ، مما يتجنب ضوضاء العضلات في التسجيلات ويحسن التصاق الأسمنت السني.
12. ضع برايمر الأسمنت السني عبر الجمجمة لمزيد من الالتصاق وتصلب بضوء الأشعة فوق البنفسجية (انظر جدول المواد). هذا يحسن التصاق الأسمنت السني ويمنع الغرز القحفية من التسرب وإضعاف رابطة الأسمنت القحفي بمرور الوقت.
13. ابحث عن الموقع المستهدف لزرع المسبار بالنسبة إلى bregma أو lambda وحدد حج القحف حوله بعلامة جراحية. ضع صفيحة الرأس على الجمجمة بحيث تقع حج القحف بداخلها ، مع وجود مساحة للمحرك الصغير على جانب واحد من حج القحف ، وكذلك ل 1-2 دبابيس تأريض.
14. زرع لوح الرأس باستخدام الأسمنت السني. امزج الأسمنت السني في طبق السيراميك المبرد المخصص (انظر الخطوة 3.2). تأكد من التصاق صفيحة الرأس بالجمجمة من جميع الجوانب ، مما يشكل "بئرا" مانعا لتسرب الماء.
15. باستخدام مثقاب الأسنان (مقاس US 1/2 HP) ، قم بحفر ثقب صغير بعرض دبابيس الرأس المعدة في الخطوة 1.4 فوق منطقة (مناطق) الدماغ لاستخدامها ك GND / REF. إذا كان تأريض قفص فاراداي مطلوبا ، فقم بحفر ثقب صغير آخر بالقرب من حافة قفص فاراداي لدبوس رأس Faraday-GND.
    ملاحظة: بالنسبة لدبابيس (دبابيس) رأس GND / REF ، ضع حج القحف على مسافة كافية من حافة القفص بحيث يمكن وضع دبوس الرأس نفسه بداخله لاحقا دون لمس قفص فاراداي.
16. نظف حج القحف عن طريق تقطير محلول ملحي معقم برفق عليه باستخدام حقنة وإزالته بمناديل غير متساقطة (انظر جدول المواد). كرر حتى تتم إزالة كل الدم والأنسجة الرخوة.
17. قم بإعداد محلول أجار 0.7٪ (انظر جدول المواد) في محلول ملحي ، وقم بتبريده قليلا ، وأدخله في حج القحف باستخدام إبرة 27 جم على حقنة سعة 1 مل.
18. أدخل دبوس GND برفق (انظر الخطوة 1.3) في كل حج قحف تم حفره في الخطوة السابقة. سيكون الدبوس (الدبابيس) محاطا بأجار من جميع الجوانب (انظر الخطوة 4.17). ضع الأسمنت حول دبابيس الرأس لتثبيتها وتوفير العزل الكهربائي.
19. نظف طبق السيراميك وضعه مرة أخرى في الثلاجة / الفريزر.
20. باستخدام مثقاب الأسنان ، قم بحفر الخطوط العريضة لحج القحف الأكبر (دائري أو مربع) عن طريق التحرك حول الحافة بحركات ثابتة. تأكد من أن حج القحف هو 1 مم × 1 مم إلى 2 مم × 2 مم للسماح بإجراء تعديلات صغيرة على موضع المسبار لتجنب الأوعية الدموية دون تعريض الكثير من القشرة. إذا أمكن ، تجنب وضع حج القحف على الغرز. حفر في جولات من 20-30 ثانية ، وتبريد الجمجمة مع المياه المالحة بين جولات الحفر.
    ملاحظة: عند بدء الحفر ، من المفيد تحديد الحافة الأمامية لمحرك الأقراص الصغير بعلامة ، وبالتالي التأكد من أنه عند الحفر ، يمكن تشكيل حافة مستقيمة بالتوازي مع الحافة الأمامية لمحرك الأقراص الصغير. يعمل هذا على تحسين فرص تجنب الأسمنت في حج القحف عند تثبيت محرك الأقراص الصغير في مكانه ، بالإضافة إلى تحسين الالتصاق ، ومنع تراكم محرك الأقراص الصغير فوق حج القحف والسماح بمزيد من القدرة على المناورة الجانبية عند وضع محرك الأقراص الصغير فيما يتعلق بموضع موقع التسجيل النهائي.
21. بعد بضع جولات أولية من الحفر ، اختبر مقاومة الجزء المحفور من العظم عن طريق الضغط عليه برفق باستخدام ملقط دقيق (مقاس 5 أو أدق ؛ انظر جدول المواد).
    1. استمر في الاختبار بين جولات الحفر حتى يبدأ العظم في "الارتداد" تحت الملقط عند دفعه. عندما تكون هذه هي الحالة ، أضف قطرة من المحلول الملحي فوق حج القحف لتليين العظم ، ثم استخدم الملقط لإزالة قطعة العظم المحفورة برفق.
    2. إذا تعذر إزالة العظم برفق ، فقم بإجراء جولة أخرى من الحفر ، مع التركيز على النقاط التي لا يزال فيها العظم ملتصقا بقوة أكبر. بشكل عام ، تهدف إلى إزالة الجمجمة بضغط لطيف من الملقط قبل أن يتم حفرها بالكامل لأن هذا عادة ما يقلل من تلف الأنسجة.
       ملاحظة: تأكد من ترطيب سطح الجافية بانتظام ، سواء أثناء الحفر لتقليل درجات الحرارة أو بعد إزالة رفرف العظام. هذا يحسن فرص إدخال المسبار بسهولة عن طريق منع الجافية من الجفاف وتصبح أكثر صعوبة في الاختراق. إذا ثبت أن الجافية صعبة للغاية بحيث لا يمكن اختراقها ، أو يتم استخدام مجسات حادة أو متعددة السيقان ، يتم إجراء بضع التجويف عن طريق رفع الجافية بإبرة 27 جم وإجراء شق صغير تحت الغمر الملحي لمنع الجافية من الالتصاق بسطح الدماغ.
22. قم بتغطية حج القحف بإسفنجة مرقئ (انظر جدول المواد) مبللة بمحلول ملحي بارد ومعقم لحماية الجافية والدماغ.

5. الجراحة: زرع المسبار

1. قم بتوصيل حامل محرك الأقراص الصغير المخصص (انظر جدول المواد) بذراع جهاز التوجيه التجسيمي. إذا تمت إزالة محرك الأقراص الصغير من حامل محرك الأقراص الصغير بعد تحضير المسبار ، فضع محرك الأقراص الصغير مع مسبار السيليكون المرفق في حامل محرك الأقراص الصغير. قم بزاوية ذراع التركيب المجسم كما هو مطلوب للوصول إلى منطقة الدماغ المستهدفة المطلوبة. ضع حلقة التاج مع مكبر الصوت المرفق على المسامير الرأسية الثلاثة في الجزء الخلفي من حامل microdrive (انظر الشكل التكميلي 1).
2. اخفض محرك الأقراص الصغير إلى حدود ~ 0.5 مم من حج القحف ، ثم استخدم الملقط لتوصيل دبوس (دبابيس) رأس GND / REF المرفقة بالمسبار بدبابيس GND / REF المقابلة المزروعة على الجمجمة (انظر الخطوات 4.14-4.15). انظر الشكل التكميلي 3 والشكل التكميلي 4 للحصول على أمثلة على محرك الأقراص وحج القحف ووضع دبوس GND / REF.
3. بمجرد وضعه في مكانه ، قم اختياريا بتأمين الدبوس (الدبابيس) بقطرة من الإيبوكسي الفضي الموصل (انظر جدول المواد) للحصول على اتصال أكثر قوة. بمجرد معالجة الإيبوكسي الفضي ، قم بتغطية المسامير المتصلة بكمية صغيرة من الأسمنت السني (انظر جدول المواد) لضمان بقاء الاتصال مستقرا لفترات طويلة وعدم وجود اتصال كهربائي مع الأنسجة المحيطة و / أو عناصر الزرع.
4. قم بإزالة الإسفنجة المرقئ من حج القحف (انظر الخطوة 4.22).
5. ضع ذراع التوضيع التجسيمي مع محرك الأقراص الصغير فوق حج القحف.
   ملاحظة: إذا تم سحب المسبار ، فتأكد من وضع محرك الأقراص الصغير بطريقة تهبط المسبار على جزء من حج القحف لا يحتوي على أوعية دموية كبيرة.
6. قم بخفض محرك الأقراص الصغير ، إذا لزم الأمر ، عن طريق ضبط الموقع والزاوية حتى تلامس ساق المسبار الجافية أو سطح الدماغ (انظر الخطوة 4.21) في المنطقة المستهدفة.
7. امزج الأسمنت السني في طبق السيراميك المخصص (انظر الخطوة 3.2) ، وقم بتثبيت قاعدة محرك الأقراص الصغير في مكانه ، مع التركيز على الجوانب الثلاثة لقاعدة محرك الأقراص الصغير التي لا تواجه القطب. تأكد من أن الأسمنت لا يلمس محرك الأقراص الصغير فوق "القاعدة" القابلة للإزالة (انظر الشكل 1 د).
   1. تأكد من أن أي مسافة بين القاعدة والجمجمة مغطاة بالكامل بأسمنت الأسنان. نظف طبق السيراميك وضعه مرة أخرى في الثلاجة / الفريزر. انتظر حتى يعالج الأسمنت ، حوالي 10-15 دقيقة.
      ملاحظة: يتم ترك فجوة صغيرة بين قاعدة microdrive والجمجمة ، ويتم استخدام الأسمنت في شكله الأكثر سلاسة لملئه. بمجرد أن يصبح الأسمنت سميكا قليلا ، يتم بناء الأسمنت بين جدران قاعدة microdrive والجمجمة. يتم استخدام كميات صغيرة جدا من الأسمنت دائما ، حيث يمكن أن يكون تدفق المادة غير متوقع ، وقد تتدفق كميات أكبر إلى مناطق غير مرغوب فيها. يمكن استخدام كميات صغيرة من الإسفنج المرقئ المغموس في محلول ملحي لتغطية أجزاء من حج القحف. إذا كان يجب أن يتدفق الأسمنت عن طريق الخطأ إلى حج القحف ، فقم بإزالة الأسمنت بالملقط بمجرد دخوله في قوام يشبه الفيلم.
8. اخفض مسبار السيليكون على الدماغ ، وراقب بعناية موضع المسبار من خلال المجهر. عندما تلمس سيقان المسبار الدماغ ، قم بخفض المسبار بسرعة بمقدار ~ 250 ميكرومتر (دورة واحدة كاملة من المسمار هي 282 ميكرومتر) للتأكد من أن المسبار يخترق مقاومة السطح الجافية / القشري.
   1. تحقق من هذا بصريا. إذا لم يقتحم المسبار القشرة ، فانتظر لمدة 5 دقائق ، ثم حاول الحفر عبر الجافية بطرف الساق عن طريق رفع المسبار وخفضه بشكل متكرر ببضع عشرات من الميكرومترات بينما تكون الجافية / القشرة تحت التوتر من طرف المسبار.
9. بمجرد اختراق المسبار لسطح القشرة ، قم بخفضه تدريجيا بوتيرة أبطأ (100-200 ميكرومتر / دقيقة) حتى يتم الوصول إلى الإحداثيات المستهدفة أو تحرك المسبار بأكثر من 1000 ميكرومتر. إذا تطلب الهدف أن يتحرك المسبار بأكثر من 1000 ميكرومتر ، فقم بدفع المسبار بخطوات بحد أقصى 1000 ميكرومتر / جلسة خلال جلسات التسجيل التالية حتى يتم الوصول إلى إحداثيات الهدف.
   ملاحظة: تخطي هذه الخطوة إذا كان يفضل مراقبة الإشارات العصبية أثناء خفض مسبار السيليكون. ويرد وصف لخطوات ذلك في القسم 7.
10. قم بإعداد المطاط الصناعي السيليكوني وفقا للتعليمات (انظر جدول المواد) وقم بتوزيع قطرة صغيرة في حج القحف باستخدام حقنة سعة 1 مل (انظر جدول المواد).
11. بمجرد أن يجف ، قم بتغطية المطاط الصناعي السيليكوني بمزيج 50/50 من شمع العظام والزيوت المعدنية. تحمي هذه الخطوة المسبار وتمنع تراكم الحطام والبلازما الجافة فوق حج القحف ، مما يجعل الاستخراج أبسط وأكثر أمانا. توخ الحذر ، لأن العمل حول المسبار أثناء خفضه يمكن أن يؤدي إلى الكسر.

6. الجراحة: زرع قفص فاراداي

1. عندما يتجمد الأسمنت السني تماما ، قم بفك حامل محرك الأقراص الصغير عن طريق فك المسمار الجانبي الذي يثبت محرك الأقراص بمفتاح Allen (انظر الشكل التكميلي 1). اسحب الحامل برفق بمقدار ~ 1 سم بحيث يكون محرك الأقراص الصغير قائما بذاته ، لكن مكبر الصوت / الموصل يظل مثبتا على حامل الغرسة دون تمديد الكابل المرن.
2. ضع التاج المصنوع مسبقا وشبكة فاراداي حول صفيحة الرأس عن طريق تمديد القفص عند الفتحة وفتحه فوق محرك الأقراص الصغير وكابل Flex أفقيا ، ثم ثبته على لوح الرأس بأسمنت الأسنان.
   ملاحظة: تأكد من إغلاق جميع الفراغات بين قفص فاراداي والجمجمة بأسمنت الأسنان لحماية الغرسة من التلوث.
3. ضع حلقة تاج فاراداي (انظر جدول المواد) مع موصل / مسرح المسبار فوق التاج ، وقم بمحاذاة الحامل المدمج لمضخم / موصل المسبار مع المنطقة المميزة بمسافة بادئة "X" على تاج فاراداي (انظر الخطوة 2.13).
4. قم بتثبيت الحلقة في قفص فاراداي بقطرة صغيرة من غراء cyanoacrylate أو الأسمنت السني عند كل تقاطع حلقة متكلم.
5. بمجرد تثبيت حلقة فاراداي مع مضخم / موصل مسبار مدمج في مكانه ، اسحب ذراع التوجيه التجسيمي بالكامل باستخدام حامل محرك الأقراص الصغير. انظر الشكل التكميلي 3 للحصول على دليل تفصيلي حول تجميع هذه المكونات.

7. تسجيل اختبار ما بعد الجراحة

1. قم بتوصيل مضخم / موصل المسبار بأجهزة التسجيل وابدأ التسجيل.
2. إذا لم يصل المسبار بعد إلى موقعه المستهدف أثناء الإدخال الأولي (انظر الخطوة 5.9) ، أدر برغي محرك الأقراص الصغير ببطء عكس اتجاه عقارب الساعة لخفض المسبار أثناء مراقبة الإشارات العصبية.
   ملاحظة: يجب أن تتغير الإشارات أ) عندما تلمس الأقطاب الكهربائية طبقة المطاط الصناعي السيليكوني فوق حج القحف ، و ب) عندما تبدأ الأقطاب الكهربائية في الانتقال إلى الدماغ (انظر الخطوة 7.2). سيتم تسجيل النشاط العصبي عالي التردد بواسطة أقطاب كهربائية يتم إدخالها بالكامل في الدماغ ، في حين أن الأقطاب الكهربائية الملامسة ل CSF على سطح الدماغ ستظهر عادة إشارة سكانية عصبية منخفضة الترشيح دون نشاط ارتفاع (أقرب إلى تتبع EEG) ، وستسجل مواقع التسجيل في الهواء ضوضاء كهربائية متزايدة. من الممكن أيضا التحقق من عمق إدخال المسبار عن طريق قياس مقاومة القنوات الفردية بعد تسجيل الاختبار. يجب أن تظهر القنوات الملامسة للهواء مقاومة عالية (تشير إلى دائرة مفتوحة) ومقاومة مثل تلك التي تم قياسها قبل الجراحة للقنوات التي تلامس السائل الدماغي النخاعي أو الموجودة بالفعل في الدماغ. تقدم مسبار السيليكون بمسافة إجمالية قصوى تبلغ حوالي 1000 ميكرومتر لكل جلسة ، مع سرعة قصوى تبلغ حوالي 75 ميكرومتر / دقيقة (انظر الخطوة 5.5).
3. عندما تكون إمكانات المجال المحلي العصبي مرئية عبر المسبار و / أو يتقدم المسبار بحد أقصى 1000 ميكرومتر ، قم بإنهاء تسجيل الاختبار وافصل موصل مرحلة الرأس.

8. الانتعاش

1. قم بتغطية قفص فاراداي بغلاف بيطري ملتصق ذاتيا (انظر جدول المواد).
2. قم بإنهاء التخدير واترك يتعافى لبضعة أيام باتباع الإرشادات التجريبية المعتمدة.
3. إذا لم تكن الأقطاب الكهربائية الموجودة على مسبار السيليكون في الموقع المستهدف المطلوب بعد ، فقم بتدوير برغي محرك الأقراص الصغير بخطوات صغيرة بحد أقصى أربع لفات كاملة (أو ~ 1000 ميكرومتر) لكل جلسة. إذا لزم الأمر ، كرر هذا الإجراء على مدى عدة أيام حتى يتم الوصول إلى الهدف. يوصى بدمج حركة المسبار مع التسجيلات المتزامنة لتقييم النشاط الفيزيولوجي الكهربي في المناطق المستعرضة.

9. التجارب السلوكية والتسجيلات المزمنة

1. بالنسبة للتسجيلات المزمنة المثبتة على الرأس أثناء أداء المهمة ، قم بتوصيل صفيحة الرأس الموجودة في قاعدة قفص فاراداي بمشبك تثبيت الرأس عن طريق فتح المشبك يدويا وتثبيت صفيحة الرأس المزروعة (انظر الشكل 1C ، E ، F).
   ملاحظة: إذا لم تكن هناك حاجة لتثبيت الرأس ، فيمكن أيضا استخدام نظام الزرع هذا للتسجيلات المتحركة بحرية. للتسجيلات المتحركة بحرية ، تخطي الخطوتين 9.1 و 9.7.
2. إزالة التفاف البيطرية الملتصقة ذاتيا من الزرع.
   ملاحظة: لتقليل الانزعاج للحيوان ، يقترح أن تبدأ مهمة سلوكية بسيطة ومجزية قبل هذه الخطوة كإلهاء بينما يعمل المجرب مع الغرسة.
3. قم بتوصيل مكبر الصوت / الموصل بمعدات التسجيل.
4. إجراء تسجيلات عصبية أثناء أداء للمهمة.
   ملاحظة: إذا كان الهدف هو زيادة عدد الوحدات خارج الخلية المسجلة إلى أقصى حد ، فقم بتحريك المكوك ببضع عشرات من الميكرومترات كلما انخفض العائد العصبي في موقع ما. لاحظ أنه بعد تحريك المسبار ، يمكن أن تستغرق الإشارة من دقائق إلى ساعات حتى تستقر. لذلك ، قد يكون من المفيد تحريك المسبار في نهاية الجلسة حتى تتمكن الإشارة من التعافي حتى بداية الجلسة التالية.
5. افصل جهاز التسجيل وقم بتغطية الغرسة في غلاف بيطري جديد في نهاية التسجيل السلوكي.
6. افتح مشبك تثبيت الرأس لفصل عن تثبيت الرأس.

10. التحقيق في الانتعاش

1. في نهاية التسجيل النهائي ، اسحب مسبار السيليكون قدر الإمكان على محرك الأقراص الصغير عن طريق تدوير المسمار في اتجاه عقارب الساعة. افعل ذلك بينما يكون ثابتا على رأسه ويتصرف أو مع تخدير في الإعداد الجراحي. رسم خريطة لخروج المسبار من الدماغ عن طريق مراقبة الإشارات العصبية في وقت واحد والتحقق من توقيع الأقطاب الكهربائية المغمورة في الدماغ أو لمس سطح الدماغ أو ملامستها للهواء (انظر الخطوة 7.3).
   ملاحظة: اعتمادا على بروتوكول الأنسجة والمسبار ، يتم إجراء آفات التحليل الكهربائي قبل سحب المسبار لتحديد الموقع الدقيق لبعض الأقطاب الكهربائية على المسبار. إذا لم تكن مراقبة خروج المسبار عبر التسجيل العصبي ضرورية ، فمن الممكن أيضا سحب المسبار بمجرد إنهاء.
2. إنهاء باتباع الإرشادات المعتمدة (وهذا يشمل تعطير إذا تم التخطيط لتثبيت الدماغ للأنسجة اللاحقة).
3. انتظر ~ 10 دقيقة بعد وفاة. بعد ذلك ، قم بتثبيت رأس في التركيب النمطي ، مع التأكد من أن رأس لا يمكن أن يتحرك أثناء الزرع لمنع كسر المسبار.
4. ضع قطرة من المحلول الملحي فوق حج القحف واتركها تنقع لبضع دقائق لتليين الأنسجة البيولوجية المجففة على ساق المسبار وتقليل فرصة كسر الساق.
5. ضع حامل التو3 التجسيمي على ارتفاع 0.5 سم تقريبا فوق محرك الأقراص الصغير. ثم قم بقص الطرف العلوي من مكابح قفص فاراداي بمقص جراحي صغير (انظر جدول المواد) لتحرير حلقة فاراداي التي تحمل مكبر الصوت / الموصل ونقل الحلقة مرة أخرى إلى المسامير الرأسية في الجزء العلوي من حامل التوضيع التجسيمي (انظر الخطوة 5.1 والشكل التكميلي 1).
6. قم بقطع الشبكة النحاسية بعناية بنفس المقص الجراحي عن طريق قطع مناطق شبكية على شكل حرف U بين مكابح تاج فاراداي. ثم اقطع المتحدث البلاستيكي للتاج في القاعدة.
   ملاحظة: تجنب ثني السماعات البلاستيكية المطبوعة أثناء قطعها ، لأنها قد تنفجر وترسل حطاما بلاستيكيا يتطاير نحو المسبار.
7. اخفض حامل التوضيع التجسيمي حتى يمكن تثبيت محرك الأقراص الصغير في الحامل باستخدام المسمار اللولبي الجانبي للحامل، وقم بتثبيت محرك الأقراص المصغر، ثم قم بفك برغي T1 الذي يربط جسم محرك الأقراص الصغير بقاعدة محرك الأقراص الصغيرة.
8. اسحب ذراع التوضيع التجسيمي ببطء باستخدام حامل الغرسة لرفع محرك الأقراص الصغير عن قاعدته. تأكد من أن محرك الأقراص الصغير ينفصل عن القاعدة بزاوية عمودية (أي "عموديا" عن القاعدة).
   ملاحظة: إذا لم ينفصل جسم محرك الأقراص الصغير وقاعدته بسهولة، فتحقق من أن حركة ذراع التوضيع التجسيمي ليست بزاوية مقارنة باتجاه محرك الأقراص الصغير. إذا لزم الأمر ، يتم إعادة محاذاة الحامل ومحرك الأقراص الصغير مع بعضهما البعض عن طريق تخفيف تثبيت رأس قليلا وإعادة وضعه وفقا لذلك. تعد المحاذاة الصحيحة أحد الجوانب الحاسمة لسهولة استرداد محرك الأقراص المصغر. تحقق أيضا مما إذا كان هناك أي أسمنت أسنان متبقي يربط محرك الأقراص الصغير وقاعدة محرك الأقراص الصغير (انظر الخطوة 5.5). إذا كان الأمر كذلك ، يتم كشط الأسمنت بعناية باستخدام مشرط و / أو مثقاب أسنان اعتمادا على كمية الأسمنت المستخدمة.
9. ارفع ذراع التوضيع التجسيمي باستخدام المسبار المرفق لتوفير مساحة كافية تحته.
10. إزالة من التجسيم ، وإعداد الدماغ باتباع بروتوكول الأنسجة المعتمدة إذا رغبت في ذلك. استرجع قاعدة microdrive المزروعة وقم بتنظيفه عن طريق نقعها في الأسيتون لعدة ساعات لإعادة استخدامها لاحقا.
11. ضع قاعدة microdrive نظيفة على معجون لاصق (انظر جدول المواد) ، ثم اخفض محرك الأقراص الصغير على القاعدة وشد المسمار. لمنع الكسر ، راقب موضع المسبار تحت المجهر طوال العملية. يمكن إكمال هذه الخطوة في وقت لاحق إذا كانت قاعدة محرك الأقراص الصغيرة المزروعة بحاجة إلى التنظيف لإعادة استخدامها أولا.
    ملاحظة: يدعو هذا البروتوكول إلى استخدام المعجون اللاصق كمنصة للقاعدة ، وهو أمر حيوي لأنه يؤمن القاعدة مع وجود درجة من العطاء ، مما يضمن عدم انزلاق القاعدة واصطدامها بالمسبار. يجب تشكيل المعجون في "وجه منحدر" عمودي على جانب قاعدة microdrive حيث سيتم خفض المسبار. هذا يضمن أنه إذا تم خفض المسبار بعد القاعدة ، فإنه لا يتلامس مع المعجون تحته. يجب أن يكون "برج" المعجون طويلا بما يكفي بحيث إذا تم خفضه بعد قاعدة microdrive ، فإن المسبار لا يتلامس مع سطح الطاولة الذي يوضع عليه المعجون. أخيرا ، ثبت المعجون جيدا على السطح لمنعه من الانزلاق أو السقوط. عند خفض محرك الأقراص الصغير على قاعدة محرك الأقراص الصغير الذي يحمله المعجون ، تأكد من عرض ملف تعريف جانبي من المجهر لمراقبة التقدم بحيث لا يصطدم بالقاعدة أو المعجون عند خفض المسبار.
12. قم بتنظيف وتعقيم المسبار باتباع تعليمات الشركة المصنعة. بالنسبة للمجسات الأكثر شيوعا ، انقعها في منظف إنزيمي (انظر جدول المواد) لمدة 12 ساعة ، ثم اشطفها بالماء منزوع المعادن وعقمها بالكحول. قم بذلك عن طريق خفض المسبار إلى دورق كبير يحتوي على المنظف الأنزيمي بينما لا يزال متصلا بحامل محرك الأقراص الصغير على ذراع التوضيع التجسيمي.
    ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، قم بقياس مقاومة الأقطاب الكهربائية على المسبار بعد التنظيف لمراقبة التدهور المحتمل للأقطاب الكهربائية الفردية.
13. قم بتخزين محرك الأقراص الصغير باستخدام المسبار الذي تم تنظيفه بأمان حتى التجربة التالية.

النتائج

يقدم هذا البروتوكول نظام زرع مزمن يمكن الباحثين من تنفيذ تسجيلات الفيزيولوجيا الكهربية المزمنة خفيفة الوزن وفعالة من حيث التكلفة وآمنة في الفئران التي تتصرف (الشكل 1). تشمل العوامل الرئيسية التي تحدد التطبيق الناجح لهذا النهج ما يلي: تغطية كاملة للأسمنت للجمجمة ، وحج القحف الأقل بضعا ومحميا بشكل صحيح ، والربط الآمن للمحرك الصغير والأسلاك بالجمجمة والاستمرارية الكاملة لمواد فاراداي الواقية. عندما يتم حساب هذه النقاط ، يمكن الوصول إلى تسجيلات عالية الجودة باستمرار. هنا يتم عرض النتائج التمثيلية المتعلقة بالجوانب الرئيسية التالية لنجاح الجراحة:

1) هل تتداخل الغرسة مع سلوك أو رفاهيته؟
2) هل جودة الإشارة عالية ، وهل يمكن الحفاظ على الإشارات على مدى فترات طويلة من الزمن؟
3) هل يمكن دمج التسجيلات بسهولة مع أداء المهمة؟

لتقييم تأثير الزرع على سلوك ، قمنا بتحليل أنماط الحركة المتعقبة في خمسة مزروعة. يوضح الشكل 2 أ مثالا لحيوان يتحرك بحرية داخل قفص اللعب لمدة 10 دقائق قبل الزرع وأسبوع واحد بعده. يمكن للمرء أن يرى أن أنماط الحركة لم تتغير. تم تأكيد هذه الملاحظة من خلال الشكل 2B ، C الذي يوضح توزيعات سرعات الحركة واتجاهات الرأس عبر. لم تتغير كل من سرعة الجري واتجاهات الرأس إلى حد كبير قبل وبعد الزرع ، وإذا كان هناك أي شيء ، فقد بدا أن سرعات الجري مرتفعة قليلا بعد الجراحة. يعرض الفيديو التكميلي 1 تسجيل فيديو قصير لحيوان بعد 6 أيام من جراحة الزرع. سلوكيات الأقفاص المنزلية النموذجية مثل الحركة والاستمالة والتربية والبحث عن الطعام في البيئة المنزلية كلها مرئية وتشير إلى الشفاء الناجح من الجراحة ، وكذلك الصحة العامة. من المرجح أن يكون التأثير السلوكي المنخفض للزرع بسبب وزنها المنخفض وطولها الذي يمكن التحكم فيه.

الشكل 2: الحركة قبل الجراحة وبعدها. (أ) مثال على حركة قبل (اللوحة اليسرى) وبعد زرع (اللوحة اليمنى). إحداثيات x/y بالسنتيمتر، والنقاط توضح موضع في كل نقطة زمنية خلال فترة 10 دقائق. (ب) توزيع سرعات الحركة بالسنتيمتر/ثانية لمدة 5 جلسات قبل الزرع و3 جلسات بعد الزرع في 5. (ج) كثافة النواة لاحتمال الحركة في اتجاهات مختلفة، لنفس الجلسات التي تم تحليلها في (B). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد ذلك ، يتم تقييم جودة الإشارة في إمكانات المجال المحلي (LFP) والنشاط المتزايد عبر مواقع التسجيل. هنا ، نعرض بيانات تمثيلية من التسجيلات القشرية في القشرة البصرية الأولية (V1). للتحقق من الصحة ، تم استخراج نشاط وحدة واحدة مفترضة من الإشارات العصبية عريضة النطاق المسجلة في V1 لفأر مستيقظ باستخدام Kilosort 3 (انظر الشكل 3). يوضح الشكل 3 أ موقع الوحدات المفردة المستخرجة على ساق المسبار ، ويوضح الشكل 3 ب الأشكال الموجية السنبلة المقابلة ، ويوضح الشكل 3 ج الاستجابات المتزايدة لنفس الخلايا العصبية لبروتوكول كثافة المصدر الحالي (CSD). في هذا النموذج ، تم تقديم ومضات واسعة المجال لمدة 300 مللي ثانية بتردد 1 هرتز (أي 300 مللي ثانية تشغيل ، 700 مللي ثانية إيقاف) على مدار 200 تجربة. أخيرا ، يوضح الشكل 3D استجابات نفس الوحدات لبروتوكول رسم خرائط المجال المستقبلي البصري ، والذي يتكون من 2000 إطار من المربعات السوداء والبيضاء المختارة عشوائيا على خلفية رمادية ، ويتم تقديم كل منها لمدة 16.6 مللي ثانية. غطت المربعات 12 درجة من الزاوية البصرية لكل منها وتم اختيارها من حقل من 15 × 5 مواقع محتملة بحيث يغطي نموذج رسم الخرائط مساحة بصرية من -90 إلى +90 درجة سمت و -30 إلى +40 درجة ارتفاع في المجموع. تم استخراج استجابات معدل إطلاق النار لكل إطار تحفيز من خلال تحليل الحد الأقصى لمعدل إطلاق النار عبر نافذة 16.6 مللي ثانية ، مع مراعاة تأخير يتراوح بين 40-140 مللي ثانية ، تم تحديده على أنه الأمثل لكل قناة بناء على الحد الأقصى للنشاط في كل نافذة. يمكن استخدام هذا النوع من التسجيل لتوجيه ضبط عمق إدخال كل قطب كهربائي ولتقييم جودة الإشارة بعد جراحة الزرع.

الشكل 3: الإشارات العصبية المسجلة. (أ) الموقع المستنبط للوحدات الفردية التي تم فرزها بواسطة حزمة فرز السنبلة Kilosort 3 على طول ملامسات قطب المسبار. (ب) الأشكال الموجية السنبلة لنفس الوحدات الموضحة بالوحدة A عبر 5 مللي ثانية. الخطوط الرفيعة: أشكال موجات سبايك الفردية. خطوط سميكة: متوسط شكل موجة سبايك. (C) مخطط نقطي للطفرات استجابة لنموذج كثافة المصدر الحالي (CSD) الذي يقدم ومضات واسعة المجال تبلغ 300 مللي ثانية متبوعة بشاشة سوداء تبلغ 700 مللي ثانية. يتم عرض الاستجابات لنفس الوحدات كما في A و B. تمثل الخطوط الملونة المتراكبة الرسوم البيانية لوقت التحفيز (PSTHs) لنفس الاستجابات. تم حساب معدلات إطلاق النار ل PSTHs في صناديق 10 مللي ثانية ثم تطبيعها بالحد الأقصى لمعدل إطلاق النار عبر PSTH بأكمله. يتمحور الوقت 0 حول تحفيز فلاش واسع النطاق. (د) الحقول المستقبلة المقدرة لنفس الوحدات كما في A-C ، مقاسة بنموذج رسم خرائط المجال المستقبلي للضوضاء المتفرقة. يظهر كل مخطط متوسط نشاط معدل إطلاق النار عبر نافذة تحليل تبلغ 16.6 مللي ثانية استجابة لبداية (اللوحة اليسرى) أو الإزاحة (اللوحة اليمنى) للمحفزات المربعة البيضاء والسوداء. تم تقديم المحفزات لمدة 16.6 مللي ثانية ، وتقع بشكل عشوائي عبر شبكة مربعة 5 × 15 تمتد 180 درجة من زاوية الرؤية أفقيا و 70 درجة من زاوية الرؤية عموديا. تم تسجيل نشاط معدل إطلاق النار عبر شبكة المجال المستقبلي بالكامل (انظر شريط الألوان). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ظلت جودة التسجيل عالية عبر التسجيلات المتكررة لأسابيع إلى شهور. يوضح الشكل 4 أ تسجيلات LFP الطولية من واحد على مدار 15 أسبوعا. تم تسجيل LFPs استجابة لنموذج CSD الموصوف أعلاه (انظر الشكل 3A-C). يوضح الشكل 4A متوسط استجابات LFP 500 مللي ثانية بعد بداية الفلاش. في هذا المثال ، استخدمنا مسبارا خطيا به 32 قناة ، بمسافة بين الأقطاب تبلغ 25 ميكرومتر. لاحظ أنه في اليوم 18 ، تم تعديل عمق المسبار ، مما أدى إلى تحويل المسبار إلى أسفل بمقدار 600 ميكرومتر. قبل وبعد هذا التعديل ، ظلت إشارات LFP مستقرة عبر أيام التسجيل.

واتساقا مع ذلك، كانت الأشكال الموجية السنبلة للوحدات المفردة المفترضة واضحة على العديد من التسجيلات. يوضح الشكل 4B مثالا تمثيليا لأشكال موجات الارتفاع من ثلاث جلسات تسجيل على مدار شهر من التسجيلات ، مما يدل على أنه يمكن تحديد نشاط وحدة واحدة بنجاح بمرور الوقت. يوضح الشكل 4C العدد الإجمالي للوحدات الفردية المفترضة المستخرجة من التسجيلات المزمنة في ستة ، والتي تمتد على نافذة تصل إلى 100 يوم. تم تعريف الوحدات المفردة وفقا للمعايير الافتراضية للكيلو سورت 3.0 (انظر الجدول التكميلي 1). كما يمكن للمرء أن يرى ، فإن عدد الوحدات الفردية المحددة بوضوح بلغ عادة ~ 40 في الأسبوع الأول بعد الزرع ، ثم انخفض تدريجيا ، متجها نحو خط مقارب مستقر على ما يبدو يبلغ ~ 20 وحدة. بالنظر إلى أن هذه التسجيلات أجريت باستخدام مجسات خطية ذات 32 قناة ، فإن هذا يعادل عائدا متوقعا يبلغ حوالي 1.25 وحدة مفردة لكل قطب كهربائي مباشرة بعد الزرع ، وينخفض إلى حوالي 0.65 وحدة مفردة لكل قطب كهربائي في التسجيلات طويلة الأجل. لا يبدو أن الاتصال المتكرر بمضخم / موصل الغرسة خلال الجلسات يؤثر على جودة التسجيل أو استقرار الغرسة لأن تاج فاراداي الذي يحمل مكبر الصوت / الموصل يمكنه تحمل قوى متكررة تزيد عن 10 نيوتن ، وهو أمر من حيث الحجم أكبر حتى من قوى التزاوج القصوى التي تتطلبها الموصلات القياسية (انظر الفيديو التكميلي 2).

الشكل 4: استقرار التسجيلات العصبية بمرور الوقت. (أ) متوسط نشاط LFP استجابة لتحفيز CSD واسع المجال ، يظهر عبر جميع القنوات ال 32 لمسبار مزمن من 3-110 أيام بعد الزرع. يشير الخط العمودي الأحمر إلى إنزال المسبار إلى موقع جديد بسبب تسجيل القنوات 0-8 من خارج الدماغ بحلول اليوم 18 بعد الجراحة. (ب) الأشكال الموجية السنبلة لثلاث وحدات نموذجية من نفس الغرسة المزمنة المسجلة بشكل متكرر على مدار أربعة أسابيع. الخطوط الرفيعة: أشكال موجات سبايك الفردية. خط متراكب سميك: متوسط شكل موجة سبايك. (ج) عدد الوحدات الفردية المفترضة التي اكتشفها Kilosort 3 عبر أيام التسجيل ل 6 (انظر وسيلة الإيضاح الداخلية). يشير المربع الأحمر إلى الأيام التي تم فيها نقل المسبار. يشير الخط المنقط إلى عدد الأقطاب الكهربائية لكل غرسة مستخدمة في هذه التسجيلات (32). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أخيرا ، من خلال توفير نظام معياري بما في ذلك محرك أقراص صغير بالإضافة إلى قفص فاراداي يمكن ارتداؤه وصفيحة رأس تتضاعف كقاعدة زرع وجهاز لتثبيت الرأس ، يتيح هذا البروتوكول دمج الفيزيولوجيا الكهربية المزمنة مع السلوك الثابت للرأس. هنا ، يتم عرض أمثلة على البيانات من الفئران التي تعبر بيئة افتراضية على جهاز المشي الكروي. يوضح الشكل 5 أ نشاط الارتفاع المرتبط بالتشغيل ل 20 وحدة في تجربة مثال. يوضح الشكل 5B العلاقات المتنوعة ولكن القوية بين سرعة الجري ونشاط الارتفاع للوحدات الفردية المصنفة بمسامير ، بالإضافة إلى متوسط السكان لنفس التأثير في الشكل 5C ، مما يؤكد التأثير الراسخ للنشاط الحركي على النشاط العصبي في القوارض V1²⁴.

الشكل 5: الاستجابات العصبية أثناء السلوك الثابت للرأس. (أ) مخطط نقطي لاستجابات الوحدة الواحدة عبر تجربة مثال ، مع سرعة التشغيل (الخط الأرجواني) ومتوسط معدلات إطلاق النار عبر جميع الوحدات الفردية (الخط الأزرق الفاتح) متراكبة. (ب) نشاط وحدة واحدة خلال فئات سرعة الجري المختلفة، كما هو موضح في ست وحدات نموذجية. (ج) متوسط نشاط الارتفاع عبر جميع الوحدات الفردية في جلسة مثال واحدة ، مرسومة عبر الخماسيات الخمسة لتوزيع سرعة التشغيل. تراوحت سرعات الجري في هذه الجلسة من 0 إلى 0.88 متر / ثانية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: جدول يوضح المعلمات الافتراضية المستخدمة بواسطة Kilosort 3 عند تحديد الوحدات المفردة في التسجيلات الموضحة في الشكل 3 والشكل 4 والشكل 5. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو تكميلي 1: فيديو يوضح النشاط الحركي للحيوان بعد الزرع. اكتمل الفيديو الذي تم التقاطه بعد اكتمال مرحلة التعافي لمدة 5 أيام ، ويظهر السلوك الحركي الطبيعي ، بالإضافة إلى التكيف مع حجم ووزن الغرسة. يمكن رؤية بشكل طبيعي وهو يستكشف قفص اللعب الذي يحتوي على إثراء بيئي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

فيديو تكميلي 2: فيديو يظهر القوة التي يتم تطبيقها على تاج فاراداي المجمع. القوى التي صمد أمامها تاج فاراداي أكبر برتبة واحدة تقريبا من قوة الاتصال اللازمة للموصلات القياسية مثل موصلات النانو المستقطبة ذات 4 سنون. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 1: شكل يوضح صور حامل محرك الأقراص. يمكن العثور على ملفات التصميم القابلة للطباعة في مستودع Github المقابل (https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/). الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 2: قالب للشبكة النحاسية. اطبع القالب باستخدام القياس الأصلي واستخدم الاستنسل لقطع الشبكة النحاسية (الخطوة 2.12). استخدم شريط القياس للتحقق من قياس الطباعة وضبطه إذا لزم الأمر. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 3: سلسلة صور توضح خطوات تجميع الغرسة أثناء الجراحة. يتم تثبيت اثنين من محركات الأقراص الصغيرة ، بالإضافة إلى اثنين من مكبرات الصوت ، في هذه الحالة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي 4: رسم جمجمة الفأر مع مثال على وضع محركات الأقراص ، وحج القحف (باللون الأخضر) ، ودبوس GND / REF (باللون الأحمر). يقترح موقع الدبوس بسبب وضعه في المخيخ ، والذي من غير المرجح أن يتداخل مع التسجيلات القشرية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا للزرع السريع والآمن والموحد للمجسات ، والذي يسمح أيضا باستعادة المسبار وإعادة استخدامه في نهاية التجربة. يستخدم هذا النهج نظاما معياريا لمكونات الزرع ، وتحديدا محرك أقراص صغير ، متوافق مع جميع مجسات السيليكون وأنظمة التسجيل الشائعة ، ولوحة رأس يمكن استخدامها للتجارب السلوكية الثابتة للرأس ، وقفص فاراداي يمكن ارتداؤه لحماية الغرسة. تسمح هذه الكوكبة للمستخدمين بتكييف غرساتهم بمرونة مع النماذج التجريبية المختلفة ، مثل السلوك الثابت للرأس مقابل السلوك الحر الحركة أو تصغير الزرع (بدون قفص فاراداي) مقابل زيادة متانة الإشارة على المدى الطويل (مع قفص فاراداي) - دون الحاجة إلى التضحية بتوحيد الغرسة في هذه العملية.

هذا النهج يجعل التسجيلات الكهربية المزمنة أكثر توحيدا (من خلال العناصر الجاهزة التي لا تتطلب التجميع باليد) ، وأقل تكلفة (من خلال استعادة المسبار) ، وأقل استهلاكا للوقت (عن طريق تبسيط خطوات الجراحة) ، وأكثر توافقا بسهولة مع رعاية وسلوكه (من خلال تقليل حجم الزرع وتثبيت الرأس الخالي من الإجهاد). على هذا النحو ، يهدف هذا البروتوكول إلى جعل الغرسات الكهربية في سلوك القوارض قابلة للتحقيق لمجموعة واسعة من الباحثين خارج المختبرات الرائدة في طليعة المجال.

لتحقيق هذا الهدف ، يقلل البروتوكول المقدم هنا من المفاضلة بين العديد من الجوانب التي غالبا ما تكون حاسمة بنفس القدر من غرسات microdrive ، وهي المرونة ، والنمطية ، وسهولة الزرع ، والاستقرار ، والتكلفة الإجمالية ، والتوافق مع السلوك ، وقابلية إعادة استخدام المسبار. في الوقت الحالي ، غالبا ما تتفوق الأساليب المتاحة في بعض هذه الجوانب ولكن بتكلفة باهظة لميزات أخرى. على سبيل المثال ، بالنسبة لحالات الاستخدام التي تتطلب ثباتا مطلقا للزرع على مدى فترات زمنية طويلة ، قد يكون أفضل نهج للزرع هو تثبيت المسبار مباشرة على الجمجمة²⁵. ومع ذلك ، فإن هذا يمنع أيضا إعادة استخدام المسبار ، وكذلك إعادة وضع مواقع التسجيل في حالة جودة التسجيل السيئة ، وهو غير متوافق مع وضع الزرع القياسي. وبالمثل ، في حين أن محرك AMIE يوفر حلا خفيف الوزن ومنخفض التكلفة لزرع المجسات القابلة للاسترداد ، إلا أنه يقتصر على مجسات فردية ومقيد في وضع الإحداثيات المستهدفة¹⁷. في الطرف الآخر من الطيف ، بعض محركات النانو المتاحة تجاريا (انظر الجدول 1^{16،17،21،26،27،28،29،30}) صغيرة للغاية ، ويمكن وضعها بحرية على الجمجمة ، وزيادة عدد المجسات التي يمكن زرعها في واحد¹⁶. ومع ذلك ، فهي باهظة الثمن مقارنة بالحلول الأخرى ، وتتطلب من المجربين أن يكونوا على درجة عالية من المهارات اللازمة لجراحات الزرع الناجحة ، ويحظرون إعادة استخدام المسبار. محرك الأقراص الصغير الذي طوره Vöröslakos et ^al.21 ، وهو نسخة خفيفة الوزن منه هي أيضا جزء من هذا البروتوكول ، يضحي بحجم غرسة صغير لتحسين سهولة الاستخدام وانخفاض السعر وإعادة استخدام المسبار

الجدول 1: مقارنة بين الاستراتيجيات الشائعة لزراعة المسبار المزمن في القوارض. التوفر: ما إذا كان محرك الأقراص الصغير مفتوح المصدر (للباحثين لبناء أنفسهم) أو متاحا تجاريا أو كليهما. نمطية: تتكون الأنظمة المتكاملة من مكون واحد أو عدد قليل من المكونات التي لها علاقة ثابتة مع بعضها البعض ، بينما تسمح الأنظمة المعيارية بوضع المسبار / محرك الأقراص الصغير مجانا بالنسبة للحماية (ترس الرأس / قفص فاراداي) بعد إنتاج الغرسة (على سبيل المثال ، في وقت الجراحة). تم تحديد النمطية من المعلومات المنشورة أو بروتوكولات الزرع للغرسات المدرجة. إصلاح الرأس: نعم: تحتوي الغرسة على آليات لتثبيت الرأس مدمجة في تصميمها ، X: تترك الغرسة المساحة لإضافة صفيحة رأس إضافية للتثبيت دون مشاكل كبيرة ، لا: من المحتمل أن يخلق تصميم الغرسة مشكلات في المساحة أو يتطلب تعديلات كبيرة في التصميم للاستخدام مع تثبيت الرأس. موضع المسبار: مقيد: موقع المسبار محدود في مرحلة تصميم الزرع. مرن: يمكن تعديل موقع المسبار حتى أثناء الجراحة. عدد المجسات: عدد المجسات التي يمكن زرعها. لاحظ أن زرع مجسات >2 على الماوس يشكل تحديا كبيرا مستقلا عن نظام الزرع المختار. دقق في قابلية إعادة الاستخدام: نعم ، إذا كان من الممكن ، من الناحية النظرية ، إعادة استخدام المجسات. الوزن / الحجم: وزن وضخامة الغرسة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

لإنشاء نظام يوفق بين هذه المتطلبات المختلفة بسلاسة أكبر ، تم تصميم غرسة DREAM على أساس غرسة Vöröslakos²¹ ، ولكن مع العديد من التعديلات الأساسية. أولا ، لتقليل الوزن الإجمالي للزرع ، يتم إنتاج محرك الأقراص الصغير المستخدم هنا من الألومنيوم المشكل آليا بدلا من الفولاذ المقاوم للصدأ المطبوع 3D ، ويتم تصغير تاج فاراداي ، مما يحقق انخفاضا إجماليا في الوزن يتراوح بين 1.2 و 1.4 جم اعتمادا على اختيار مادة لوح الرأس (انظر الجدول 2). ثانيا ، تم تصميم لوحة الرأس المحيطة بمحرك الأقراص الصغير للسماح بآلية تثبيت رأس متكاملة تتيح تثبيت الرأس بسرعة وخالية من الإجهاد مع مضاعفة كقاعدة لقفص فاراداي ، مما يتيح الوصول إلى معظم المناطق المستهدفة المحتملة للتسجيلات العصبية وإضافة الحد الأدنى من الوزن إلى الغرسة. يضمن الشكل المسطح لآلية التثبيت ونقص النتوءات أيضا الحد الأدنى من ضعف المجال البصري للحيوانات أو حركتها (انظر الشكل 2A-C) ، وهو تحسن واضح مقارنة بالأنظمة السابقة^31,32. كما تم تغيير تاج وخاتم فاراداي المثبت على لوح الرأس بشكل كبير مقارنة بالتصميمات السابقة. لا تتطلب الآن أي تكيف مخصص (على سبيل المثال ، من حيث وضع الموصل) أو اللحام طوال الجراحة ، وإزالة الأسباب المحتملة لتلف الزرع والتباين غير المتوقع في جودة الزرع. بدلا من ذلك ، توفر غرسة DREAM العديد من الاختلافات القياسية في حلقة التاج التي تسمح بوضع كل موصل في أحد المواضع الأربعة المحددة مسبقا ، مما يقلل من التباين والجهد أثناء الجراحة. أخيرا ، من خلال تحسين نظام الزرع لاستعادة المسبار ، تسمح غرسة DREAM للمجربين بخفض التكلفة بشكل كبير بالإضافة إلى وقت التحضير لكل عملية زرع حيث يمكن عادة استعادة محرك الأقراص الصغير والمسبار وتنظيفهما وإعادة استخدامهما معا.

للحصول على نظرة عامة أكثر شمولا على المقايضات التي تطرحها أنظمة الزرع المختلفة ، انظر الجدول 1. في حين أن النهج المقدم هنا لا يوفر عموما أقصى أداء مقارنة بجميع الاستراتيجيات الأخرى ، على سبيل المثال ، من حيث الحجم أو الاستقرار أو التكلفة ، فإنه يعمل في النطاق الأعلى عبر جميع هذه المعلمات ، مما يجعله أكثر سهولة في التطبيق على مجموعة واسعة من التجارب.

هناك ثلاثة جوانب من البروتوكول حاسمة بشكل خاص للتكيف مع كل حالة استخدام محددة: كوكبة الأرض والمرجع ، وتقنية تدعيم محرك الأقراص الصغير ، والتحقق من صحة الزرع عبر التسجيل العصبي. أولا ، عند زرع الأرض والدبابيس المرجعية ، كان الهدف هو تحديد النقطة الحلوة بين الاستقرار الميكانيكي / الكهربائي والغزو. في حين أن الأسلاك الفضية العائمة المضمنة في الآجار ، على سبيل المثال ، أقل توغلا من البراغي العظمية³³ ، فمن المحتمل أن تكون أكثر عرضة للإزاحة بمرور الوقت. يضمن استخدام المسامير ، إلى جانب الأجار ، اتصالا كهربائيا مستقرا مع ميزة سهولة التحكم أثناء الإدخال ، وتجنب صدمة الأنسجة. من غير المحتمل أن يتم إزاحة المسامير الأرضية المثبتة في الجمجمة ، وفي حالة فصل السلك عن الدبوس ، عادة ما تكون إعادة التثبيت بسيطة بسبب مساحة السطح الأكبر واستقرار الدبوس المزروع.

الجدول 2: مقارنة أوزان المكونات بين غرسة DREAM والغرسة التي وصفها Vöröslakos et ^al.21. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الجدول.

ثانيا ، يجب أن يحدث تدعيم محرك الأقراص الصغير بشكل عام قبل إدخال المسبار في الدماغ. هذا يمنع الحركة الجانبية للمسبار داخل الدماغ إذا لم يتم تثبيت محرك الأقراص الصغير بشكل مثالي في حامل التوضيع التجسيمي أثناء الإدراج. للتحقق من موضع المسبار قبل تثبيت محرك الأقراص الصغير في مكانه ، يمكن للمرء أن يخفض طرف ساق المسبار لفترة وجيزة للتأكد من المكان الذي سيتصل فيه بالدماغ لأن استقراء موضع الهبوط قد يكون صعبا نظرا لتحول اختلاف المنظر في المجهر. بمجرد إنشاء موضع microdrive ، يمكن للمرء اختياريا حماية حج القحف باستخدام المطاط الصناعي السيليكوني قبل تدعيم محرك الأقراص الصغير لضمان عدم ملامسة الأسمنت عن طريق الخطأ مع حج القحف ؛ ومع ذلك ، لا ينصح بخفض المسبار من خلال المطاط الصناعي السيليكوني ، حيث يمكن سحب بقايا المطاط الصناعي السيليكوني إلى الدماغ وتسبب الالتهاب والتسمم الغذائي.

ثالثا ، اعتمادا على البروتوكول التجريبي المستخدم ، قد يكون أو لا يكون تسجيل الاختبار مباشرة بعد الجراحة مفيدا. إلى حد كبير ، لن يكون النشاط العصبي المسجل مباشرة بعد إدخال المسبار ممثلا مباشرا للنشاط المسجل بشكل مزمن ، بسبب عوامل مثل تورم الدماغ العابر وحركة الأنسجة حول المسبار ، مما يعني أنه من غير المرجح أن يستقر كل من عمق الإدخال وكذلك أشكال موجات السنبلة بشكل مباشر. على هذا النحو ، يمكن أن تعمل التسجيلات الفورية بشكل أساسي على التأكد من جودة الإشارة العامة وسلامة الزرع. يوصى باستخدام زلاجة microdrive المتحركة في الأيام اللاحقة بعد الجراحة بمجرد استقرار الدماغ لضبط الوضع. يساعد هذا أيضا على تجنب تحريك المسبار بأكثر من 1000 ميكرومتر في اليوم ، مما يقلل من الأضرار التي تلحق بموقع التسجيل وبالتالي تحسين طول عمر موقع التسجيل.

وأخيرا، قد يرغب المستعملون في تكييف النظام للتسجيل من أكثر من موقع مستهدف واحد. نظرا لأن هذا النظام معياري ، فإن المستخدم لديه الكثير من الفسحة حول كيفية تجميع المكونات ووضعها فيما يتعلق ببعضها البعض (انظر أعلاه والشكل التكميلي 3 والشكل التكميلي 4). ويشمل ذلك التعديلات التي من شأنها أن تسمح بتركيب مكوك ممتد أفقيا على محرك الأقراص الصغير ، مما يسمح بزرع مجسات متعددة أو مجسات كبيرة متعددة السيقان ، بالإضافة إلى زرع محركات ميكرو فردية متعددة (انظر الشكل التكميلي 3 والشكل التكميلي 4). تتطلب هذه التعديلات فقط استخدام حلقة تاج معدلة ، مع زيادة عدد مناطق التثبيت للموصلات / لوحات الواجهة / مراحل الرأس. ومع ذلك ، فإن قيود المساحة لهذا التصميم تمليها النموذج الحيواني ، في هذه الحالة ، الماوس ، مما يجعل تكديس مجسات متعددة على محرك ميكرو واحد أكثر جاذبية من حيث البصمة من زرع عدة محركات ميكرو بشكل مستقل عن بعضها البعض. يمكن أن تدعم محركات الأقراص الصغيرة المستخدمة هنا المجسات المكدسة ، وبالتالي ، فإن القيد الحقيقي الوحيد هو عدد المراحل الرئيسية أو الموصلات التي يمكن أن تناسب قيود المساحة والوزن التي يحددها النموذج الحيواني. يمكن أيضا استخدام الفواصل لزيادة مسارات التركيب والإدراج غير الرأسية.

في الختام ، يسمح هذا البروتوكول بزرع مسبار غير مكلف وخفيف الوزن وقابل للتعديل بشكل مهم ، مع ميزة إضافية تتمثل في تصميم محرك الأقراص المصغر الذي يعطي الأولوية لاستعادة المسبار. يعالج هذا مشاكل التكلفة الباهظة للتحقيقات ذات الاستخدام الواحد ، والحاجز العالي للمهارات الجراحية والزرع ، فضلا عن حقيقة أن الحلول التجارية للزرع المزمن غالبا ما تكون صعبة التكيف مع حالات الاستخدام الفريدة. تشكل هذه المشكلات نقطة ألم للمختبرات التي تستخدم بالفعل الفيزيولوجيا الكهربية الحادة ورادعا لتلك التي لا تجري بعد تجارب الفيزيولوجيا الكهربية. يهدف هذا النظام إلى تسهيل استيعاب أبحاث الفيزيولوجيا الكهربية المزمنة على نطاق أوسع بما يتجاوز هذه القيود.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05" Solder Tail Socket	Mill-Max	853-93-100-10-001000
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- Reagent tetramethylindocarbocyanine perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))	ThermoFisher	D282	Lipophilic dye used for easier histological verification of the probe location
Adhesive Putty (Blu-Tack)	Bostik	308590110	Variations (e.g. by Pritt) should be available in your stationary store
Agar	Sigma Aldrich	A1296	Make with saline for conductivity.
Amplifier (Miniamp-64)	Cambridge Neurotech		Miniature and implantable amplifier and digitiser. Alternative Implantable digitiser, or implantable Omnetics connector use possible.
Analgesic Cream (EMLA Cream)	Aspen	39699/0088	Analgesic cream used for operative pain containing prilocaine, lidocaine.
Angled Spacer	3DNeuro		Angled spacer for non-perpendicular drive mounting.. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Blue light curing LED	B.A. International	818223	Curing light for primer polymerisation. 420-480 nm wavelength
Bone wax	SMI	Z046	Wax to protect craniotomy and probe post surgery.
Buprenorphine	Elanco Europe LTD	401513	Injectable Buprenorphine solution (0.3 mg/mL)
Copper mesh	Dexmet	3CU6-050FA	Copper mesh used to electrically and physically shield probe and craniotomy.
Cyanoacrylate glue (Loctite)	Loctite	1363589	Cyanoacrylate gel glue
Dental Cement (SuperBond C&B)	Sun Medical	K058E	Dental cement (SuperBond)
Depilation Cream (Veet)	Veet	310000091434	Hair removal cream for removal of hair around surgical site.
Enrofloxacin (Baytril)	Elanco Europe LTD	00879/4117	Injectable enrofloxacin solution (25 mg/mL)
Faraday crown	3DNeuro		3D printed implantable protective cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Faraday ring	3DNeuro		3D printed implantable protective ring for faraday cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Haemostatic Sponge	SMI	ZHG101010	Absorbable gelatin haemostatic sponge
Heat Shrink Tubing	HellermannTyton	TA32-9/3 BK	Heat Shrink tubing for making soft tipped forceps
Iodine	Braunol	9322507	Aqueous povidone-iodine solution.
Metamizole (Novalgin)	Sanofi-Aventis Gmbh	4527098	Injectable Metamizole (500mg/mL)
Metamizole (Novalgin)	Sanofi-Aventis Gmbh	1553758	Metamizole solution
Microdrive (R2Drive)	3DNeuro		Recoverable Metal micro drive with moveable shuttle. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5310-100ML	Oil used as solvent to create craniotomy protection gel.
Non-Shedding Wipes (Kimtech)	Kimtech	7552	Non-shedding wipes
Primer	Bisco	B-7202P	Universal skull adhesive preventing moisture from deteriorating the cement and providing a solid base to build up cement onto.
R2Drive holder	3DNeuro		Stereotactic attachment for mounting R2Drive. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Self-adherent wrap	3M	VB050	Protective wrap for implant post surgery
Silicon probe (H2)	Cambridge Neurotech		Chronically implantable linear silicon probe with 32 channels. Alternative Probe use possible.
Silicone Elastomer (Duragel)	Cambridge Neurotech		Silicone Elastomer
Silicone Plaster (Kwikcast)	WPI	KWIK-CAST
Silver conductive epoxy	MG Chemicals	8331D-14G	Silver epoxy
Size 5 Dumont forceps	FSTools	11251-10	Small forceps for lifting bone flap.
Stainless steel wire, Teflon coated	Science Products GmBH	SS-3T	Ground wire
Stereotax (RWD)	RWD	68803	Stereotax for surgical procedures on mice.
Tergazyme	Alconox	1304	A possible enzymatic cleaner to clean probe
Two Part Fast setting Epoxy Resin	Gorilla	EP3	Epoxy for permanent bonding of DREAM implant parts.
Vannas Spring Scissors Round Handle	FSTools	15403-08	0.075mm straight tipped spring rebound veterinary scissors.
Veterinary Cyanoacrylate glue (Vetbond)	3M	70-0068-5256-3	Veterinary cyanoacrylate glue