DREAM 植入物：一种轻便、模块化且经济高效的植入系统，用于头部固定和行为自由的小鼠的慢性电生理学

摘要

在这里，我们介绍了一种轻便、经济高效的探针植入系统，用于啮齿动物的慢性电生理学，该系统针对易用性、探针恢复、实验多功能性和行为兼容性进行了优化。

摘要

啮齿动物的慢性电生理记录显着提高了我们对神经元动力学及其行为相关性的理解。然而，目前的长期植入探针方法在成本、易用性、尺寸、适应性和长期稳定性之间存在巨大的权衡。

该协议为小鼠引入了一种新型慢性探针植入系统，称为 DREAM（动态、可恢复、经济、适应性和模块化），旨在克服与当前可用选项相关的权衡。该系统提供了一种轻量级、模块化且经济高效的解决方案，具有标准化硬件元件，这些硬件元件可以在简单的步骤中组合和植入，并安全地取出以进行探针的回收和多次重复使用，从而显著降低实验成本。

DREAM 植入系统集成了三个硬件模块：（1） 一个可以携带所有标准硅探针的微型驱动器，允许实验者在长达 7 mm 的行程距离内调整记录深度;（2） 用于覆盖铜网的可穿戴法拉第笼的三维 （3D） 可打印开源设计，用于电气屏蔽、冲击保护和连接器放置，以及 （3） 用于改善动物福利和易用性的小型化头部固定系统。相应的手术方案针对速度（总持续时间：2 小时）、探针安全性和动物福利进行了优化。

植入物对动物的行为库影响最小，易于适用于自由移动和头部固定的环境，并在植入后数周的数据收集中提供清晰可识别的尖峰波形和健康的神经元反应。感染和其他手术并发症极为罕见。

因此，DREAM 植入系统是一种多功能、经济高效的小鼠慢性电生理解决方案，可增强动物健康状况，并实现更合理的行为学实验。它的设计简化了满足各种研究需求的实验程序，增加了啮齿动物慢性电生理学在广泛研究实验室中的可及性。

引言

由于慢性植入硅探针的遗传和实验易处理性，使用慢性植入硅探针的电生理学已成为研究行为动物（尤其是小鼠）神经活动和连接的强大技术¹。特别是层状硅探针，已被证明是一种非常有价值的工具，可用于识别皮质柱内的功能关系² ，并以以前不可能的方式将大型神经元群的动力学与行为联系起来³。

两种互补方法是目前记录体内神经活动的金标准：双光子显微镜 ^4,5 和细胞外电生理学⁶。记录方法的选择限制了可以获得的读数的性质：双光子显微镜特别适合于对不同时间的大量群体中可单独识别的神经元进行纵向研究，但设备成本高，并且仅限于完整大脑皮层的表层。此外，~30 Hz 的典型时间分辨率限制了其捕获正在进行的神经元动力学的能力 ^7,8。

相比之下，电生理记录提供高时间分辨率（高达 40 kHz）来跟踪每时每刻的神经元活动，可以广泛应用于跨物种以及跨皮层深度，并且与双光子显微镜相比，设置成本相对较低。然而，单个神经元的识别以及神经元群的纵向跟踪很难实现。这尤其适用于电极丝，例如四极管和急性电极插入。除了缺乏在记录会话中跟踪神经元的能力⁹ 之外，反复的急性插入还会导致局部创伤¹⁰ 产生免疫反应¹¹，从而增加感染和神经胶质增生的机会。这最终降低了记录的神经元活动的稳定性和实验动物的预期寿命，将以急性电生理记录为特色的纵向研究的范围限制在仅几天内¹²。

慢性高密度硅探针记录旨在结合急性电生理学和双光子成像的一些最佳属性。与双光子成像相比，它们可以跟踪跨会话的神经种群动态，但识别单个神经元的能力仅略有降低¹³。这些记录在记录信号的空间放置和精确的时间分辨率方面提供了高度的灵活性，并且与急性记录相比，提高了实验动物的寿命和健康状况¹⁴。此外，与急性记录相比，慢性电生理学只需要一次植入事件，有效降低了感染和组织损伤的风险，并最大限度地减少了对动物的压力¹⁵。总的来说，这些优势使慢性电生理学成为研究神经系统组织和功能的有力工具。

然而，常用的小鼠慢性植入技术限制了研究人员在与行为记录的兼容性、植入物重量、植入物的可复制性、财务成本和整体易用性之间做出重大权衡。许多植入方案并非旨在促进探针¹⁶ 的重复使用，这大大提高了单个实验的有效成本，从而使一些实验室在经济上难以使用慢性电生理学。它们通常还需要大量的内部原型制作和设计工作，而这些工作可能没有专业知识和资源。

另一方面，集成植入系统¹⁷ 为啮齿动物的慢性电生理学提供了更广泛可用的解决方案。这些系统旨在将固定探头的微型驱动器与植入物的其余部分集成在一起，以简化植入物处理和外科手术。然而，一旦植入，这种系统可能会头重脚轻，并限制实验者灵活地使实验适应不同目标坐标的能力。通常，它们的体重会妨碍在较小的动物中植入植入物，可能会损害动物的运动并引起压力¹⁸。这可能会不成比例地影响对青少年和女性队列的研究，因为体重限制更有可能影响这些群体。

此外，并非所有集成系统都允许在植入后调整电极位置。这是相关的，因为由于探针插入¹⁹ 引起的神经胶质增生或瘢痕形成，尤其是在植入²⁰ 后的最初 48 小时内，会降低记录的神经元活动的质量。对探头插入深度的微调可以限制对信号完整性的负面影响。因此，微定位机制（通常称为微驱动器）即使在其长度上分布有大量电极的探针中也是有益的。

为了克服这种权衡，我们为小鼠引入了一种新型慢性电生理植入系统，该系统通过提供轻便、经济高效和模块化的解决方案来解决以前设计的局限性。DREAM 植入系统的设计重量不到小鼠正常体重的 10% （~2.1 g），可确保动物福利和对行为的影响最小。对 DREAM 植入物设计的验证表明，对行为关键指标（例如运动）的影响最小 - 当负载施加在颅骨上时，运动可能会对啮齿动物产生显着影响。这可以通过提高动物福祉并允许更合理的动物行为学实验，使利用自由移动和头部固定的动物的实验范式受益。

该系统包括一个微型驱动器，可灵活调整高达 7 mm 的记录深度，并可适应不同类型的探针和记录设备，为研究人员提供适用于各种实验应用的经济高效且用途广泛的工具。该系统通常与金属微型驱动器²¹ 结合使用，与其他系统相比，它可以提供一致的探针回收率（预期平均回收率：每个探针大约可靠重复使用 3 次），并大大降低了单个实验的成本。

该设计采用 3D 打印的保护法拉第笼，可提供廉价而坚固的保护，防止电生理噪声、机械冲击和传染性材料，从而实现稳定且无噪声的记录，感染率最低。这种植入式笼子由所谓的“冠”和冠环组成，前者设计用于冲击保护并为法拉第笼的导电金属网涂层提供结构，后者用作植入式放大器和/或探针连接器的支架（见 图 1）。

最后，模块化种植体系统中包含的头板旨在与新颖、高效的头部固定系统兼容，而不会增加种植体的体积。与其他现有系统相比，它不需要在靠近植入物的地方拧紧小螺钉，加快了小鼠在实验装置中的固定，并改善了实验者与动物的关系，以及行为依从性。同时，头板用作构建 DREAM 慢性电生理系统其他模块的基础。

DREAM 植入物的设计文件在 https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/ 上作为开源硬件发布。在以下部分中，将描述 DREAM 植入系统的设计和制造，演示其在小鼠模型中的成功实施，并讨论与现有系统相比其潜在应用和优势。

研究方案

所有实验程序均根据马克斯·普朗克学会的机构指导方针进行，并经当地政府伦理委员会（Beratende Ethikkommission nach §15 Tierschutzgesetz， Regierungspräsidium Hessen，项目批准代码：F149-2000）批准。

图 1：植入物设计。 （A） 植入物叠加在小鼠头骨上的3D渲染，硅探针连接到探针连接器。头板的中心孔径约为 10 毫米，用于缩放。驱动器的高度约为 17 mm。未显示形成法拉第冠外部的铜网以及接地/参考线。（B） 与 （A） 相同，连接到放大器板而不是探针连接器。（C） 植入物的爆炸技术图，显示了其组件。（D） 渲染一个可以植入微型驱动器下方的倾斜垫片，允许始终以预定义的角度（此处：20°）植入微型驱动器。（E） 集成头部固定机构的渲染图，显示了植入法拉第冠的头部板，以及周围的头部固定夹和用于设置的燕尾连接。（F） 使用植入物的集成头部固定机构将鼠标头部固定在跑步机上的图像。 请单击此处查看此图的较大版本。

注意：第 1 节和第 2 节讨论了术前准备

1. 硅探针的准备

1. 如果探针重复使用，请根据探针供应商的建议清洁硅探针。将探针浸泡在酶清洁剂中（参见 材料表）5-10 分钟，然后用软化水冲洗。移植后尽快执行此操作。在（重新）植入前一天，将探针浸泡在 70% 乙醇中至少 30 分钟进行消毒。
2. 测量通道阻抗以确保它们在所记录信号的规格范围内。遵循 Neuropixels 用户手册²² 中的噪声级测试协议，通过所需的记录软件（例如 https://open-ephys.github.io/gui-docs/User-Manual/Plugins/Acquisition-Board.html#impedance-testing）测量阻抗，并遵循硅探针制造商或数据表提供的目标通道阻抗。如果阻抗太高，请考虑重新涂覆电极位点²³。
3. 将 0.05 英寸焊尾插座（参见 材料表）焊接到探头的接地 （GND） 线上。在手术过程中将插座连接到 GND 引脚（下一步）。
   注意：在此协议中，不使用单独的参考 （REF） 引脚，因为 GND 和 REF 在所使用的头级上短路。因此，协议的其余部分将仅提及 GND pin。如果使用单独的 REF，请对 REF 引脚重复以下步骤。
4. 要准备 GND 引脚，请反复将 0.05“ 焊尾插座的引脚侧（参见 材料表）插入 GND 0.05” 焊尾插座，直到插入基本不费吹灰之力。使用镀金销可以减少对这种平滑步骤的需求。这确保了 GND 引脚和插座在手术过程中可以轻松连接，而无需施加过大的压力，从而降低了对动物和探针造成伤害的风险。
5. 如果使用用于硅探针的植入式前置放大器，请按照供应商的程序为慢性植入做好准备。然后，使用硅胶石膏将放大器/连接器粘在法拉第笼的环上，将其粘合到设计用于固定放大器的法拉第环区域（见 图 1）。
   注意：按照供应商的程序为硅探针准备植入式前置放大器以进行长期植入，可能包括将它们涂在硅或环氧树脂中，以避免受潮损坏电子设备，以及在录音期间将放大器连接到录音系统时反复插接放大器连接器以减少插拔力。这对 Omnetics 用户特别有用。

2. 准备微型驱动器和头带

1. 转动微驱动器主体上的螺钉，使微驱动器梭几乎完全向上缩回。
2. 或者，用氰基丙烯酸酯胶或牙科粘结剂将倾斜垫片（参见 图 1D）连接到微型驱动器的底部，这可用于允许使用特定程度的倾斜，例如，当通过中央沟内某个区域的皮质层进行记录时，或在可能需要非垂直方法的深层结构中（对于倾斜的垫片， 参见 材料表）。
3. 将微型驱动器水平放在微型驱动器支架上（补充图 1）。
4. 将一小块粘性腻子（参见 材料表）放在微型驱动器支架上，距离将放置头部级连接器的微型驱动器上方一段距离。这个距离取决于将硅探头连接到头部连接器的柔性电缆的长度。
5. 将一小滴硅胶石膏（参见 材料表）放在梭子上。
6. 在钝的软头镊子的帮助下，将硅探针从包装中取出。通过在标准尖嘴镊子上涂上直径为 3 mm 的热缩管来制作这些（参见 材料表）。首先将带有柔性电缆的探头放在微型驱动器的梭子上，使柔性电缆的底部边缘略微悬在微型驱动器梭子的底部边缘上。
7. 轻轻地将柔性电缆拉向微型驱动器的顶部，直到柔性电缆的底部边缘与微型驱动器穿梭机的底部边缘相遇。在此步骤中，确保将柔性电缆推向微型驱动器梭子的左边缘，使其完全垂直放置在微驱动器末端。此时，确保硅胶探针的柄不会（或仅最小）突出超过微型驱动器的下边缘（取决于探针柄的确切长度和目标大脑区域的深度）。
8. 将探头的头部连接器放在支架顶部的粘性腻子上，以防止探头脱落。
9. 使用 27 G 注射器针头在柔性电缆和梭子之间滴一小滴氰基丙烯酸酯胶（参见 材料表），以将探头固定到位。确保胶水不会流到微型驱动器上或沿着穿梭车外的柔性电缆流淌（这非常重要）
10. 将柔性电缆粘合到位后，使用硅胶石膏将放大器连接到冠环（参见 材料表）。然后，将柔性电缆连接到放大器，并用一层薄薄的硅胶石膏覆盖连接和电缆。
11. 5 分钟后，当石膏凝固时，安全地存放微型驱动器和探针，直到进一步使用。
12. 将铜网片（参见 材料表）切割成开放的甜甜圈形状（参见 补充图 2 中的切割图案）以覆盖法拉第笼。
13. 用小滴环氧树脂将铜网切口固定在法拉第笼上（参见 材料表）。对于这一步，还可以用牙科水泥代替环氧树脂。
    注意：法拉第笼包含一个空间，用于容纳探头连接器或放大器。这个空间在设计文件中用 X 标记，它包含一个用于放大器/连接器的支撑底座，以及壳体两个相邻辐条之间的更大距离。为了在放大器/连接器周围创造足够的空间，请在两个相邻的辐条之间固定少量额外的网格，从而形成一个突起。这确保了放大器/连接器以后可以放置在这个“口袋”中，而无需接触法拉第笼。为确保牢固粘附且翘曲最小，请使用直接放置在表冠上的冠环来保持形状并支撑冠状的细辐条。此外，在干燥过程中使用焊接辅助手固定牙冠和网孔。如果在接受手术时难以保持牙冠的形状，请尝试一次只对两个牙冠臂进行环氧树脂处理，以防止翘曲。
14. 如果需要法拉第笼的单独接地，请将一个小接头引脚焊接到 30 mm 接地线上（参见 材料表），然后使用导电环氧树脂将导线粘附到铜网切口上。
    注意：实验室中不遵守此步骤。
15. 此时，请安全地存放准备好的部件，并在以后进行手术。
    注意：第 3-6 节讨论了微型驱动器和头带的植入。

3. 手术：准备探头和工作区

1. 按照批准的程序对手术器械进行消毒并将手术器械放置在手术工作区中。
   注：这可能包括使用微珠灭菌器、高压灭菌仪器或用 30% 过氧化物或 90% 乙醇冲洗，具体取决于批准的实验方案。
2. 按照牙科粘固剂套件中的说明，将用于制备牙科粘固剂的陶瓷皿放入冰箱、冰箱或冰柜中（见 材料表）。在水泥搅拌过程中使用冷却的陶瓷皿，以增加水泥的延展时间。每当需要更长的胶合步骤时，请使用冷却皿。
3. 如果需要在实验结束时对探针位置进行组织学验证，请在手术前逆时针转动微型驱动器上的螺丝来延长硅探针，并通过将亲脂性染料（参见 材料表）浸入一小滴染料中将探针涂在探针上。从市售的二甲基亚砜 （DMSO） 或乙醇 （EtOH） 稀释的储备溶液（参见 材料表）制备亲脂性染料，方法是将其稀释在合适的缓冲液（如 PBS）中以 1-5 μM 的浓度稀释。

4. 手术：动物的准备

1. 遵循批准的麻醉方案，在无菌条件下进行 2-4 小时的啮齿动物手术。这可能包括全身麻醉和局部麻醉、镇痛、涂抹眼药膏和注射生理盐水。在这里，使用注射麻醉剂（氯胺酮 100 [mg/kg]/美托咪定 0.5 [mg/kg]）以及局部镇痛霜和眼膏（见 材料表），并将动物放在加热垫上以调节体温。
2. 当动物完全麻醉后，将其移至单独的非无菌剃须区域。
   1. 确保动物充分加热;例如，将其放在加热垫上。去除颅骨顶部的毛发。使用电动剃须刀或脱毛霜（见 材料表）或用覆盖有 70% 乙醇的手术刀反复剃须头顶。
   2. 小心去除松散的毛发，以确保它们以后不会与暴露的组织接触。要去除毛发，请使用用 70% 乙醇和/或挤压球泵润湿的组织等。如果使用脱毛膏，请确保使用棉签和生理盐水将其彻底去除。
3. 用含碘消毒剂（见 材料表）和酒精使用棉签对剃须区域进行多次消毒，从头部中央移动到两侧，从切口部位刷走任何残留的松散毛发。
4. 使用 betadine 对头部和周围的皮毛进行消毒。这确保了无菌的工作区域，并保护手术器械和材料不与未消毒的毛皮接触。
5. 使用耳杆和鼻托将动物放在立体定向框架中（参见 材料表）。
6. 使用小手术剪刀（ 材料 表），在颅骨顶部的皮肤上切出一个杏仁形的开口，从 lambda 缝合线的后部一直延伸到眼睛之间。
7. 在仍然湿润的情况下切开皮下膜和骨膜，然后用手术刀刀片刮擦颅骨，以去除颅骨表面可能阻碍牙科粘结剂粘附的软膜组织。
8. 可选：清除颅骨上的膜组织后，短暂涂抹一层 0.5% 过氧化物的薄层，并用水基碘消毒剂（例如 Betadine）洗掉，然后使颅骨表面变粗糙，以提高底漆与颅骨的粘附性。
9. 通过刮擦十字交叉图案，将手术刀的尖端倒置，小心地使颅骨表面粗糙。这有助于牙科粘固剂稍后粘附在颅骨上。
   注意：不要在缝合线顶部用力抓挠，因为这会导致缝合线破裂并渗出颅内液，从而损害牙科粘接剂的粘附力。
10. 在手术刀刀片和无菌棉签之间交替使用，轻轻刮擦/推开附着在 lambda 缝合线两侧的颈部肌肉，直到肌肉被推回小脑顶部的颅骨“边缘”。这有助于最大限度地减少神经元记录中的肌肉噪声。
11. 用 27 G 针头（参见 材料表）填充 1 mL 注射器，加入少量外科瞬干胶（参见 材料表）。然后，使用注射器将皮肤粘在颅骨边缘，在其上涂抹微小的强力胶滴。将组织尽可能平整地粘在颅骨上，为植入物留出空间。该程序可确保皮肤和肌肉不会与植入物的某些部分直接接触，从而避免了记录中的肌肉噪音并提高了牙科粘固剂的附着力。
12. 在颅骨上涂抹牙科粘固底漆以增加附着力，并用紫外线固化（见 材料表）。这提高了牙科粘接剂的粘附力，并防止颅缝线泄漏并随着时间的推移削弱颅骨粘接剂的粘合。
13. 找到探针植入相对于前囟或 lambda 的目标位置，并用手术标记勾勒出其周围的开颅手术。将头板放在颅骨上，使开颅手术位于颅骨内，在开颅手术的一侧为微型驱动器留出空间，以及 1-2 个接地引脚。
14. 使用牙科粘固剂植入头板。在指定的冷却陶瓷皿中混合牙科水泥（参见步骤 3.2）。确保头板从四面八方都粘附在颅骨上，形成一个水密的“井”。
15. 使用牙钻（尺寸为 US 1/2 HP），在大脑区域上钻一个与 1.4 步骤中准备的针座引脚宽度相同的小毛刺孔，以用作 GND/REF。如果需要将法拉第笼接地，请在靠近法拉第笼边缘的地方为 Faraday-GND 接头引脚钻另一个小毛刺孔。
    注意：对于 GND/REF 接头引脚，请将开颅手术室放置在距笼边缘足够远的位置，以便稍后可以在不接触法拉第笼的情况下将接头引脚本身放入其中。
16. 用注射器轻轻将无菌盐水滴在开颅手术上，然后用不脱落的湿巾将其去除，以清洁开颅手术（见 材料表）。重复此过程，直到去除所有血液和松散组织。
17. 在盐水中制备 0.7% 琼脂（参见 材料表）溶液，稍微冷却，然后使用 1 mL 注射器上的 27 G 针头将其引入开颅手术。
18. 轻轻地将 GND 引脚（参见步骤 1.3）插入上一步中钻出的每个开颅手术中。针脚将在四面八方被琼脂包围（参见步骤 4.17）。在接头引脚周围涂抹水泥以固定它们并提供电气隔离。
19. 清洁陶瓷盘并将其放回冰箱/冰柜中。
20. 使用牙钻，通过稳定地移动边缘来钻出较大开颅手术（圆形或方形）的轮廓。确保开颅手术为 1 毫米 x 1 毫米至 2 毫米 x 2 毫米，以便对探针的位置进行小幅调整，以避免血管而不会暴露太多皮层。如果可能，请避免在缝合线上放置开颅手术。以 20-30 秒的轮次钻孔，并在两次钻孔之间用盐水冷却颅骨。
    注意：开始钻孔时，用记号笔标记出微型驱动器的前缘很有用，从而确保在钻孔时可以形成与微型驱动器前缘平行的直边。这提高了在将微型驱动器固定到位时避免开颅手术中粘接物的机会，并提高了粘附力，防止了微型驱动器悬垂在开颅手术机上，并在将微型驱动器相对于最终记录部位位置放置时允许更大的横向机动性。
21. 在最初的几轮钻孔后，用细镊子（尺寸 5 或更细;见 材料表）轻轻推动骨头的钻孔部分，以测试该部分的阻力。
    1. 在钻孔轮次之间继续测试，直到骨头在推动时开始在镊子下方“弹跳”。在这种情况下，在开颅手术顶部加入一滴生理盐水以软化骨头，然后用镊子轻轻取出钻出的骨头。
    2. 如果无法轻轻地去除骨骼，请进行另一轮钻孔，重点关注骨骼仍然更牢固地附着的点。一般来说，在完全钻穿颅骨之前，用镊子轻轻按压将其取出，因为这通常可以最大限度地减少组织损伤。
       注意：确保硬脑膜表面定期湿润，无论是在钻孔以降低温度期间还是在去除骨瓣之后。这通过防止硬脑膜干燥和变得更难穿透，提高了探针轻松插入的机会。如果硬脑膜被证明太硬而无法穿透，或者正在使用钝探针或多柄探针，则通过用 27 G 针提起硬脑膜并在盐水浸泡下做一个小切口来进行硬脑膜切开术，以防止硬脑膜粘在大脑表面。
22. 用浸泡在凉爽无菌盐水中的止血海绵（ 材料 表）覆盖开颅手术，以保护硬脑膜和大脑。

5. 手术：探针植入

1. 将定制的微型驱动器支架（参见 材料表）连接到立体定向装置的臂上。如果在探针准备后从微型驱动器支架中取出了微型驱动器，请将带有附加硅探针的微型驱动器放入微型驱动器支架中。根据需要调整立体臂的角度以到达所需的目标大脑区域。将带有附加放大器的冠环放在微型驱动器支架背面的三个垂直引脚上（参见 补充图 1）。
2. 将微型驱动器降低到开颅手术的 ~0.5 毫米范围内，然后使用镊子将连接到探头的 GND/REF 接头引脚连接到植入颅骨上的相应 GND/REF 引脚（参见步骤 4.14-4.15）。参见 补充图 3 和 补充图 4 ，了解驱动、开颅手术和 GND/REF 引脚布局的示例。
3. 就位后，可以选择用一滴导电银环氧树脂固定引脚（参见 材料表），以实现更坚固的连接。银环氧树脂固化后，用少量牙科水泥覆盖连接的针脚（见 材料表），以确保连接长期保持稳定，并且与周围组织和/或种植体元件没有电气连接。
4. 从开颅手术中取出止血海绵（参见步骤 4.22）。
5. 将带有微型驱动器的立体定向臂放在开颅手术机上。
   注意：如果探头缩回，请确保将微型驱动器放置在探头可以接触到不包含大血管的开颅手术部分。
6. 如有必要，通过调整位置和角度来降低微型驱动器，直到探头柄接触到目标区域的硬脑膜或大脑表面（参见步骤 4.21）。
7. 在指定的陶瓷皿中混合牙科水泥（参见步骤 3.2），并将微型驱动器的底座固定到位，重点关注微型驱动器底座不面向电极的三个侧面。确保水泥不接触可移动“底座”上方的微型驱动器（参见 图 1D）。
   1. 确保基底和颅骨之间的任何空间都用牙科水泥完全覆盖。清洁陶瓷盘并将其放回冰箱/冰柜中。等待水泥固化，大约 10-15 分钟。
      注意：在微型驱动器底座和颅骨之间留有一个小间隙，并使用最流畅的水泥来填充它。一旦水泥略微变厚，微驱动器底座壁和颅骨之间的水泥就会堆积起来。始终使用非常少量的水泥，因为物质的流动是不可预测的，并且较大的体积可能会流入不需要的区域。少量蘸有生理盐水的止血海绵可用于覆盖开颅手术的部分。如果粘接剂意外流到开颅手术上，一旦粘接剂进入薄膜状稠度，就用镊子将其去除。
8. 将硅探针降低到大脑上，通过显微镜仔细监测探针位置。当探针柄接触大脑时，将探针快速降低 ~250 μm（螺钉旋转一整圈为 282 μm），以确保探针突破硬脑膜/皮质表面的阻力。
   1. 直观地验证这一点。如果探针没有突破皮层，请等待 5 分钟，然后尝试在硬脑膜/皮层受到探针尖端的张力下，通过反复升高和降低探针几十微米来用柄尖端蚀刻硬脑膜。
9. 一旦探针突破了皮层表面，以较慢的速度（100-200 μm /min）逐渐降低它，直到达到目标坐标或探针移动了 1000 μm 以上。如果目标要求探针移动超过 1000 μm，请在以下记录会话中以最大 1000 μm/会话的步骤推进探针，直到达到目标坐标。
   注意：如果首选在降低硅探针的同时监测神经元信号，请跳过此步骤。第 7 节 中介绍了此操作的步骤。
10. 根据说明准备有机硅弹性体（见 材料表），并使用 1 mL 注射器将一小滴滴入开颅手术中（见 材料表）。
11. 干燥后，用 50/50 的骨蜡和矿物油混合物覆盖有机硅弹性体。此步骤进一步保护探头并防止碎屑和干血浆在开颅手术上积聚，使提取更简单、更安全。要小心，因为在探头降低时在探头周围工作可能会导致破损。

6. 手术：法拉第笼植入

1. 当牙科粘固剂完全凝固时，用内六角扳手松开固定驱动器的横向螺钉，以松开微型驱动器支架（参见 补充图 1）。轻轻缩回支架 ~1 厘米，使微型驱动器独立，但探针放大器/连接器仍固定在植入物支架上，而不会拉伸柔性电缆。
2. 将预制的牙冠和法拉第网放在头板上，方法是在开口处拉伸笼并将其水平插入微型驱动器和柔性电缆上，然后用牙科水泥将其固定在头板上。
   注意：确保用牙科粘结剂封闭法拉第保持架和颅骨之间的所有空间，以保护植入物免受污染。
3. 将带有探头连接器/头的法拉第冠环（参见 材料表）放在冠上，将探头放大器/连接器的集成支架与法拉第冠上缩进的“X”标记的区域对齐（参见步骤 2.13）。
4. 在每个辐条环连接处用一小滴氰基丙烯酸酯胶或牙科水泥将环固定到法拉第笼上。
5. 将带有集成探针放大器/连接器的法拉第环固定到位后，用微型驱动器支架完全缩回立体定向臂。有关组装这些组件的分步指南，请参见 补充图 3 。

7. 术后检查记录

1. 将探头放大器/连接器连接到记录硬件并开始记录。
2. 如果在初始插入期间探针尚未到达其目标位置（参见步骤 5.9），请逆时针缓慢转动微驱动器螺钉以降低探针，同时监测神经元信号。
   注意：信号应发生变化 a） 当电极接触开颅手术上方的硅橡胶层时，以及 b） 当电极开始进入大脑时（参见步骤 7.2）。高频神经元活动将由完全插入大脑的电极记录，而与大脑表面的 CSF 接触的电极通常会显示低通过滤的神经元群信号，而没有尖峰活动（类似于脑电图轨迹），空气中的记录点会记录到增加的电噪声。在测试记录后，可以通过测量各个通道的阻抗来额外验证探头插入深度。与空气接触的通道应显示高阻抗（表示开路）和阻抗，就像手术前为接触 CSF 或已经在大脑中的通道测量的阻抗一样。每次会话将硅探针推进最大总距离约 1000 μm，最大速度约为 75 μm/min（参见步骤 5.5）。
3. 当探针上可以看到神经局部场电位和/或探针最大前进 1000 μm 时，结束测试记录并断开头部tage 连接器。

8. 恢复

1. 用自粘性兽医包裹物覆盖法拉第笼（参见 材料表）。
2. 结束麻醉并按照批准的实验指南让动物恢复几天。
3. 如果硅探针上的电极尚未位于所需的目标位置，请以小步长转动微型驱动器的螺钉，每次最多转动四整圈（或 ~1000 μm）。如有必要，请在几天内重复此过程，直到达到目标。建议将探针移动与同步记录相结合，以评估横向区域的电生理活动。

9. 行为实验和慢性记录

1. 对于任务执行期间的慢性头部固定记录，通过手动打开夹子并夹紧植入的头板，将法拉第笼底部的头板连接到头部固定夹上（参见 图 1C、E、F）。
   注意：如果不需要头部固定，该植入系统也可用于自由移动的录音。对于自由移动的录音，请跳过步骤 9.1 和 9.7。
2. 从植入物上取下自粘性兽医包裹物。
   注意：为了尽量减少动物的不适，建议在此步骤之前开始一项简单、有益的行为任务，以分散实验者使用植入物的注意力。
3. 将放大器/连接器连接到录音设备。
4. 在动物执行任务时进行神经元记录。
   注意：如果目标是最大化记录的细胞外单位的数量，则每当某个位置的神经产量降低时，将梭子移动几十微米。请注意，移动探头后，信号可能需要几分钟到几小时才能稳定下来。因此，在会话结束时移动探测器可能是有益的，这样信号就可以恢复，直到下一个会话开始。
5. 在行为记录结束时，断开记录设备并用新的兽医包裹物覆盖植入物。
6. 打开头部固定夹，将动物从头部固定装置上分离。

10. 探针恢复

1. 在最终记录结束时，顺时针转动螺钉，将硅探针尽可能缩回微型驱动器上。当动物头部固定并行为正常或在手术设置中麻醉动物时执行此操作。通过同时监测神经元信号并检查浸入大脑、接触大脑表面或与空气接触的电极的特征，绘制探针从大脑中的出口（参见步骤 7.3）。
   注：根据组织学方案和探针，在缩回探针之前进行电解损伤，以确定探针上某些电极的确切位置。如果不需要通过神经元记录来监测探针的出口，也可以在动物终止后收回探针。
2. 按照批准的指南处决动物（如果计划固定大脑以进行后续组织学，这包括灌注动物）。
3. 动物死亡后等待 ~ 10 分钟。然后，将动物头部固定在立体模型中，确保动物的头部在外植体期间不能移动，以防止探针破损。
4. 在开颅手术顶部滴一滴生理盐水，让它浸泡几分钟，以软化探针柄上的干燥生物组织并降低探针柄断裂的机会。
5. 将立体定向支架放在微型驱动器上方约 0.5 厘米处。然后用小手术剪刀剪断法拉第笼辐条的上端（参见 材料表），以释放固定放大器/连接器的法拉第环，并将环转移回立体定向支架顶部的垂直销钉上（参见步骤 5.1 和 补充图 1）。
6. 用相同的手术剪刀小心地剪掉铜网，在法拉第冠的辐条之间剪出 U 形网眼区域。然后，剪掉表冠底部处的塑料辐条。
   注意： 避免在切割打印的塑料辐条时弯曲它们，因为它们可能会折断并使塑料碎屑飞向探头。
7. 降低立体定向支架，直到可以使用支架的横向螺钉将微型驱动器固定在支架中，固定微型驱动器，然后松开将微型驱动器主体连接到微型驱动器底座的 T1 螺钉。
8. 用植入物支架慢慢缩回立体定向臂，将微型驱动器从其底座上提起。确保微驱动器与底座以垂直角度分离（即，与底座“垂直”）。
   注意：如果微型驱动器主体和底座不容易分离，请验证立体定向臂的运动是否与微型驱动器方向相比没有成一定角度。如有必要，通过稍微松开动物头部的固定并相应地重新定位，将支架和微型驱动器彼此重新对齐。正确对齐是轻松恢复微型驱动器的关键方面之一。此外，检查是否有残留的牙科粘结剂连接微型驱动器和微型驱动器底座（参见步骤 5.5）。如果是这样，根据水泥的使用量，用手术刀和/或牙钻小心地刮掉水泥。
9. 用连接的探头抬起立体定向臂，使其下方留出足够的空间。
10. 将动物从立体体中取出，并根据需要按照批准的组织学方案准备大脑。回收植入的微型驱动器底座，并将其浸泡在丙酮中数小时以备后用。
11. 将干净的微型驱动器底座放在粘性腻子上（参见 材料表），然后将微型驱动器降低到底座上并拧紧螺丝。为防止破损，请在整个过程中在显微镜下监测探针位置。如果需要先清洁植入的 microdrive 底座以供重复使用，则可以在以后完成此步骤。
    注意：该协议要求使用粘性腻子作为底座的平台，这一点至关重要，因为它既可以固定底座，又具有一定程度的弹性，确保底座不会滑动并与探头碰撞。腻子应在微驱动器底座的一侧形成垂直的“悬崖面”，探头将在那里下降。这确保了如果探头下降到底座之外，它不会与下面的腻子接触。油灰“塔”也应该足够高，如果它降低到微驱动器底座之外，探头不会与放置油灰的台面接触。最后，将腻子很好地固定在表面上，以防止其滑落或掉落。将微型驱动器降低到油灰固定的微型驱动器底座上时，请确保显微镜的侧面剖面视图以监控进度，以便在探头降低时，它不会与底座或油灰发生碰撞。
12. 按照制造商的说明对探头进行清洁和消毒。对于最常用的探针，将它们浸泡在酶清洁剂（参见 材料表）中 12 小时，然后用软化水冲洗并用酒精消毒。通过将探针放入装有酶清洁剂的大烧杯中，同时仍连接到立体定向臂上的微驱动器支架上来执行此操作。
    注意：如果需要，清洁后测量探头上电极的阻抗，以监测单个电极的电位退化。
13. 将带有清洁探针的微型驱动器安全地存放，直到下一次实验。

结果

该协议提出了一种慢性植入系统，使研究人员能够在行为良好的小鼠中实施轻量级、经济高效且安全的慢性电生理记录（图 1）。决定这种方法成功应用的主要因素包括：颅骨的完全水泥覆盖、微创且得到适当保护的开颅手术、微型驱动器和接线与颅骨的牢固连接以及法拉第保护材料的完全连续性。当考虑到这些点时，可以始终如一地获得高质量的录音。这里显示了与手术成功的以下主要方面有关的代表性结果：

1） 植入物是否干扰动物的行为或健康？
2） 信号质量高吗，信号能否长时间保持？
3） 录音是否可以轻松地与任务绩效相结合？

为了评估植入物对动物行为的影响，我们分析了 5 只植入动物的跟踪运动模式。 图 2A 显示了动物在植入前和植入后 1 周在游戏笼内自由移动 10 分钟的示例。可以看出，运动模式没有变化。 图 2B、C 证实了这一观察结果，该图显示了动物之间移动速度和头部方向的分布。植入前后跑步速度和头部方向基本没有变化，如果有的话，手术后跑步速度似乎略有提高。 补充视频 1 显示了植入手术后 6 天的动物的简短视频记录。典型的家庭笼子行为，如在家庭环境中运动、梳理毛发、饲养和觅食都是可见的，表明手术成功恢复，以及总体健康状况。植入物对行为的影响很小，很可能是由于其重量轻且高度可控。

图 2：手术前后的运动。 （A） 动物在植入前（左图）和后（右图）的运动示例。x/y 坐标以厘米为单位，点表示动物在 10 分钟内每个时间点的位置。（B） 5 只动物植入前 5 个会话和植入后 3 个会话的运动速度分布（以厘米/秒为单位）。（C） 在 （B） 中分析的相同会话中，不同方向移动概率的核密度。 请单击此处查看此图的较大版本。

接下来，评估本地场电位 （LFP） 的信号质量和记录站点的尖峰活动。在这里，我们显示了来自初级视觉皮层 （V1） 皮层记录的代表性数据。为了验证，使用 Kilosort 3 从清醒小鼠 V1 中记录的宽带神经元信号中提取推定的单单位活性（参见 图 3）。 图 3A 显示了提取的单个单元在探针柄上的位置， 图 3B 显示了相应的尖峰波形， 图 3C 显示了相同神经元对电流源密度 （CSD） 协议的尖峰响应。在这种范式中，在 200 次试验中，以 1 Hz 的频率（即 300 ms 打开，700 ms 关闭）呈现宽场闪光的持续时间为 300 ms。最后， 图 3D 显示了相同单元对视觉感受野映射协议的响应，该协议由灰色背景上随机选择的 2000 帧黑白方块组成，每个帧呈现 16.6 毫秒。每个正方形覆盖 12 度的视角，并从 15 x 5 个可能位置的字段中选择，以便映射范例覆盖 -90 至 +90 度方位角和 -30 至 +40 度仰角的视觉空间。通过分析 16.6 ms 窗口内的最大触发速率来提取对每个刺激帧的触发速率响应，延迟在 40-140 ms 之间，根据每个窗口中的最大活动确定每个通道的最佳触发率。这种类型的记录可用于指导调整每个电极的插入深度，并评估植入手术后的信号质量。

图 3：记录的神经元信号。 （A） 由 Kilosort 3 加标分选包沿探针电极触点分选的单个单元的推断位置。（B） A 中所示的相同单位在 5 ms 时间内的尖峰波形。细线：单个尖峰波形。粗线：平均尖峰波形。（C） 响应电流源密度 （CSD） 范式的尖峰光栅图，该范式呈现 300 ms 宽场闪光，然后是 700 ms 黑屏。响应的显示单位与 A 和 B 中的单位相同。叠加的彩色线条表示相同响应的刺激周围时间直方图 （PSTH）。PSTH 的发射速率以 10 毫秒的分箱计算，然后按整个 PSTH 的最大发射速率进行标准化。时间 0 以宽场闪光刺激为中心。（D） 与 A-C 中相同单位的估计感受野，通过稀疏噪声感受野映射范式测量。每个图显示了 16.6 毫秒分析窗口内响应白色和黑色方形刺激的开始（左面板）或偏移（右面板）的平均发射速率活动。刺激的持续时间为 16.6 毫秒，随机分布在 5 x 15 的正方形网格上，水平视角为 180 度，垂直视角为 70 度。发射速率活动在整个感受野网格中进行 z 评分（参见彩条）。请单击此处查看此图的较大版本。

在数周到数月的重复记录中，记录质量保持较高水平。图 4A 显示了一只动物在 15 周内的纵向 LFP 记录。记录 LFP 以响应上述 CSD 范式（参见图 3A-C）。图 4A 显示了闪光开始后 500 ms 的平均 LFP 响应。在这个例子中，我们使用了一个具有 32 个通道的线性探针，电极间距离为 25 μm。请注意，在第 18 天，调整探针深度，将探针向下移动 600 μm。在此调整之前和之后，LFP 信号在记录日内保持稳定。

与此一致，在许多录音中可以辨别出假定的单个单元的尖峰波形。 图 4B 显示了一个月的记录中三个记录会话的代表性示例尖峰波形，表明随着时间的推移可以成功识别单个单元活动。 图 4C 显示了从 6 只动物的慢性记录中提取的推定单个单位的总数，跨越长达 100 天的窗口。根据 kilosort 3.0 的默认标准定义单个单位（参见 补充表 1）。如您所见，在植入后第一周，明确定义的单个单位的数量通常达到 ~40 个，然后逐渐下降，朝着 ~20 个单位的明显稳定的渐近线移动。鉴于这些记录是使用线性 32 通道探针进行的，这相当于植入后立即每个电极的预期产量约为 1.25 个单单位，在长期记录中每个电极下降到约 0.65 个单单位。在会话中反复连接到植入物的放大器/连接器似乎不会影响记录质量或植入物稳定性，因为固定放大器/连接器的法拉第冠可以承受超过 10 牛顿的重复力，甚至比标准连接器所需的最大插拔力还要大一个数量级（参见 补充视频 2）。

图 4：神经元记录随时间变化的稳定性。 （A） 响应宽场闪光 CSD 刺激的平均 LFP 活性，显示在植入后 3-110 天慢性植入探针的所有 32 个通道中。红色竖线表示由于手术后第 18 天从大脑外部记录通道 0-8，探针被降低到新位置。（B） 在 4 周内重复记录的来自同一慢性植入物的三个示例单元的尖峰波形。细线：单个尖峰波形。粗叠加线：平均尖峰波形。（C） Kilosort 3 在记录日内为 6 只动物检测到的推定单个单位的数量（见插图图例）。红色方块表示探测器移动的日期。虚线表示这些记录中使用的每个植入物的电极数量 （32）。 请单击此处查看此图的较大版本。

最后，通过提供一个模块化系统，包括一个微型驱动器以及一个可穿戴的法拉第笼和一个兼作植入底座和头部固定装置的头板，该协议实现了慢性电生理学与头部固定行为的整合。这里显示了在球形跑步机上穿越虚拟环境的小鼠的示例数据。 图 5A 显示了示例试验中 20 个单位的跑步相关峰值活动。 图 5B 显示了跑步速度和单个尖峰排序单元的尖峰活动之间多样化但稳健的关系，以及 图 5C 中相同效果的种群平均值，证实了运动活动对啮齿动物 V1 神经元活动的公认影响^{V1 24}。

图 5：头部固定行为期间的神经元反应。 （A） 示例试验中单个单元响应的光栅图，叠加了所有单个单元的运行速度（紫线）和平均发射速率（浅蓝色线）。（B） 不同跑步速度类别下的单个装置活动，显示了 6 个示例装置。（三） 在一个示例会话中所有单个单元的平均峰值活动，绘制在跑步速度分布的五个五分位数上。本次训练的跑步速度范围为 0 至 0.88 米/秒。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充表 1：表格显示了 Kilosort 3 在图 3、图 4 和图 5 所示的记录中识别单个单元时使用的默认参数。请点击此处下载此文件。

补充视频 1：显示植入后动物运动活动的视频。 5 天恢复期后拍摄的视频完成，显示正常的运动行为，以及对植入物大小和重量的适应。可以看到这只动物正常地探索一个装有环境丰富的游戏笼。 请点击此处下载此文件。

补充视频 2：视频显示对组装好的法拉第表冠施加力。 法拉第冠承受的力比标准连接器（如 4 针极化纳米连接器）所需的连接力大约大一个数量级。 请点击此处下载此文件。

补充图 1：显示驱动器支架图像的图。 可打印的设计文件可以在相应的 Github 存储库 （https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/） 中找到。 请点击此处下载此文件。

补充图 2：铜网模板。 打印具有原始缩放比例的模板，并使用模板切割铜网（步骤 2.12）。使用比例尺验证并在必要时调整打印的缩放比例。 请点击此处下载此文件。

补充图 3：显示手术过程中植入物组装步骤的照片系列。 在这种情况下，安装了两个微型驱动器和两个放大器。 请点击此处下载此文件。

补充图 4：小鼠头骨图，包括驱动器、开颅手术（绿色）和 GND/REF 引脚（红色）的示例放置。 由于位于小脑中，因此建议针钉位置，这不太可能干扰皮质记录。 请点击此处下载此文件。

讨论

本手稿提出了一种快速、安全和标准化探针植入的方案，该方案还允许在实验结束时恢复和重复使用探针。该方法利用了植入物组件的模块化系统，特别是与所有常见硅探针和记录系统兼容的微型驱动器、可用于头部固定行为实验的头板以及用于保护植入物的可穿戴法拉第笼。该星座允许用户灵活地使他们的植入物适应不同的实验范式，例如头部固定与自由移动行为或植入物小型化（无法拉第笼）与增加的长期信号稳健性（使用法拉第笼）——而不必在此过程中牺牲植入物的标准化。

这种方法使慢性电生理记录更加标准化（通过不需要手工组装的预制元件）、成本更低（通过探针恢复）、更耗时（通过简化手术步骤），并且更容易与动物福利和行为兼容（通过减小植入物尺寸和无压力头部固定）。因此，该协议旨在使行为啮齿动物的电生理植入物可供该领域前沿的开创性实验室以外的更广泛的研究人员实现。

为了实现这一目标，此处介绍的协议最大限度地减少了微驱动器植入物的几个通常同样关键的方面之间的权衡，即灵活性、模块化、易于植入、稳定性、总体成本、与行为的兼容性和探针可重用性。目前，可用的方法通常在某些方面表现出色，但其他功能的成本很高。例如，对于需要长时间绝对植入物稳定性的用例，最好的植入物方法可能是直接将探针粘接到颅骨^{上 25}。然而，这也阻止了探针的重复使用，以及在记录质量差的情况下重新定位记录位点，并且与标准化的植入物放置不兼容。同样，虽然 AMIE 驱动器为探针的可恢复植入提供了一种轻量级、低成本的解决方案，但它仅限于单个探针，并且在目标坐标的放置方面受到限制¹⁷。在光谱的另一端，一些市售的纳米驱动器（见 表 1^{16、17、21、26、27、28、29、30}）非常小，可以自由放置在头骨上，并最大限度地提高可以植入单个动物的探针数量¹⁶.然而，与其他解决方案相比，它们价格昂贵，需要实验人员具备高超的技能才能成功进行植入手术，并且禁止重复使用探针。由 Vöröslakos 等人开发的微型驱动器²¹，其轻量级版本也是该协议的一部分，它牺牲了小的植入物尺寸，以获得更好的易用性、更低的价格和探针的可重用性

表 1：啮齿动物慢性探针植入的流行策略比较。可用性：微驱动器是开源的（供研究人员自行构建）、市售的，还是两者兼而有之。 模块化：集成系统由一个或几个彼此固定关系的组件组成，而模块化系统允许在植入物生产后（例如，在手术时）相对于保护装置（头齿轮/法拉第笼）自由放置探头/微驱动器。模块化是根据所列植入物的已发布信息或植入方案确定的。 头部固定装置： 是： 植入物在其设计中集成了头部固定机制， X： 植入物留出空间来添加额外的头部板进行固定，没有大问题， 否： 植入物的设计可能会产生空间问题或需要对设计进行大量修改才能用于头部固定。 探针放置： 受限：探针位置在植入物设计阶段受到限制。 灵活： 即使在手术过程中也可以调整探头位置。 Number of probes：可以植入的探针数量。请注意，在小鼠上植入 >2 探针确实会带来重大挑战，这与所选的植入系统无关。 探针可重用性：是的，如果探针理论上可以重复使用。 重量/大小：植入物的重量和体积。 请点击此处下载此表格。

为了创建一个更无缝地协调这些不同需求的系统，DREAM 植入物是在 Vöröslakos^{植入物 21} 的基础上设计的，但进行了几处基本修改。首先，为了减轻植入物的整体重量，这里使用的微型驱动器是用机加工铝而不是 3D 打印不锈钢制造的，并且法拉第冠是小型化的，根据头板材料的选择，整体重量减轻了 1.2-1.4 g（见表 2）。其次，微型驱动器周围的头板设计为允许集成的头部固定机构，可实现快速、无压力的头部固定，同时兼作法拉第笼的底座，可以进入神经元记录的大多数潜在目标区域，并且只增加植入物的最小重量。固定机构的扁平形状和没有突起也确保了对动物视野或运动的最小损害（见图 2A-C），比以前的系统有了明显的改进^31,32。与以前的设计相比，固定在头板上的法拉第表冠和环也发生了重大变化。现在，它们不需要在整个手术过程中进行任何临时调整（例如，在连接器放置方面）或焊接，从而消除了植入物损伤的潜在原因和植入物质量的不可预测的差异。相反，DREAM 植入物提供了多种标准化的冠环变体，允许将每个连接器放置在四个预定义位置之一，从而最大限度地减少手术过程中的可变性和工作量。最后，通过优化植入物系统以进行探针恢复，DREAM 植入物使实验者能够大大降低每个植入物的成本和准备时间，因为微型驱动器和探针通常可以一起回收、清洁和重复使用。

有关不同种植体系统带来的权衡的更详尽概述，请参见 表 1。虽然与所有其他策略相比，这里介绍的方法通常不能提供最大的性能，例如，在尺寸、稳定性或成本方面，但它在所有这些参数的上限范围内运行，使其更容易适用于广泛的实验。

该协议的三个方面对于适应每个特定用例尤为重要：接地和参考的星座、粘合微驱动器的技术以及通过神经元记录进行植入物验证。首先，在植入接地和参考引脚时，目标是确定机械/电气稳定性和侵入性之间的最佳平衡点。虽然例如，嵌入琼脂中的浮动银线比接骨螺钉³³ 的侵入性更小，但它们可能更容易随着时间的推移而脱落。使用针脚与琼脂相结合，确保了稳定的电气连接，同时还具有在插入过程中更容易控制、避免组织创伤的优势。粘合到颅骨上的接地针不太可能脱落，并且在电线与针脚分离的情况下，由于植入针的表面积较大且稳定性好，重新连接通常很简单。

表 2：DREAM 植入物与 Vöröslakos 等人描述的植入物之间的组件重量比较²¹。请点击此处下载此表格。

其次，微型驱动器的粘合通常应在将探针插入大脑之前进行。如果微型驱动器在插入过程中没有完全固定在立体定向支架中，这可以防止探针在大脑内的横向移动。为了在将微型驱动器固定到位之前检查探针的位置，可以短暂降低探针柄的尖端以确定它将与大脑接触的位置，因为考虑到显微镜的视差偏移，推断着陆位置可能很困难。一旦确定了微驱动器的位置，可以选择在粘接微驱动器之前用硅橡胶保护开颅手术，以确保粘接物不会意外地与开颅手术接触;但是，不建议通过硅橡胶降低探针，因为硅橡胶残留物会被吸入大脑并引起炎症和神经胶质增生。

第三，根据所使用的实验方案，手术后直接进行测试记录可能有用，也可能没有用。在很大程度上，由于瞬时脑肿胀和探针周围的组织运动等因素，探针插入后立即记录的神经元活动不会直接代表长期记录的活动，这意味着插入深度和尖峰波形都不太可能直接稳定。因此，即时记录主要用于确定一般信号质量和植入物完整性。建议在手术后的几天内，一旦大脑稳定下来，就可以使用可移动的微型驱动雪橇来微调位置。这也有助于避免每天将探针移动超过 1000 μm，最大限度地减少对记录位点的损坏，从而延长记录位点的使用寿命。

最后，用户可能希望使系统适应从多个目标位置进行录制。由于该系统是模块化的，因此用户在如何相对于彼此组装和放置组件方面有很大的回旋余地（参见上文和 补充图 3 和 补充图 4）。这包括允许在微驱动器上安装水平延伸的梭子的修改，允许植入多个探针或大型多柄探针，以及植入多个单独的微型驱动器（参见 补充图 3 和 补充图 4）。此类修改只需要使用合适的冠环，并增加连接器/接口板/头部的安装区域数量。然而，这种设计的空间限制是由动物模型决定的，在本例中为鼠标，这使得将多个探针堆叠到一个微驱动器上比植入多个彼此独立的微驱动器更具吸引力。这里使用的微型驱动器可以支持堆叠探针，因此，唯一真正的限制是可以适应动物模型定义的空间和重量限制的头部或连接器的数量。垫片也可用于进一步增加非垂直安装和插入路径。

总之，该协议允许廉价、轻便且重要的是可调节的探针植入，并具有优先考虑探针恢复的微驱动器设计的额外好处。这解决了一次性探针成本高昂、手术和植入技能门槛高以及慢性植入的商业解决方案通常难以适应独特用例等问题。这些问题对已经在使用急性电生理学的实验室构成了痛点，也对那些尚未进行电生理学实验的实验室产生了威慑。该系统旨在促进超越这些限制的慢性电生理学研究的更广泛采用。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05" Solder Tail Socket	Mill-Max	853-93-100-10-001000
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'- Reagent tetramethylindocarbocyanine perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))	ThermoFisher	D282	Lipophilic dye used for easier histological verification of the probe location
Adhesive Putty (Blu-Tack)	Bostik	308590110	Variations (e.g. by Pritt) should be available in your stationary store
Agar	Sigma Aldrich	A1296	Make with saline for conductivity.
Amplifier (Miniamp-64)	Cambridge Neurotech		Miniature and implantable amplifier and digitiser. Alternative Implantable digitiser, or implantable Omnetics connector use possible.
Analgesic Cream (EMLA Cream)	Aspen	39699/0088	Analgesic cream used for operative pain containing prilocaine, lidocaine.
Angled Spacer	3DNeuro		Angled spacer for non-perpendicular drive mounting.. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Blue light curing LED	B.A. International	818223	Curing light for primer polymerisation. 420-480 nm wavelength
Bone wax	SMI	Z046	Wax to protect craniotomy and probe post surgery.
Buprenorphine	Elanco Europe LTD	401513	Injectable Buprenorphine solution (0.3 mg/mL)
Copper mesh	Dexmet	3CU6-050FA	Copper mesh used to electrically and physically shield probe and craniotomy.
Cyanoacrylate glue (Loctite)	Loctite	1363589	Cyanoacrylate gel glue
Dental Cement (SuperBond C&B)	Sun Medical	K058E	Dental cement (SuperBond)
Depilation Cream (Veet)	Veet	310000091434	Hair removal cream for removal of hair around surgical site.
Enrofloxacin (Baytril)	Elanco Europe LTD	00879/4117	Injectable enrofloxacin solution (25 mg/mL)
Faraday crown	3DNeuro		3D printed implantable protective cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Faraday ring	3DNeuro		3D printed implantable protective ring for faraday cage. Open souce, also available at https://github.com/zero-noise-lab/dream-implant/
Haemostatic Sponge	SMI	ZHG101010	Absorbable gelatin haemostatic sponge
Heat Shrink Tubing	HellermannTyton	TA32-9/3 BK	Heat Shrink tubing for making soft tipped forceps
Iodine	Braunol	9322507	Aqueous povidone-iodine solution.
Metamizole (Novalgin)	Sanofi-Aventis Gmbh	4527098	Injectable Metamizole (500mg/mL)
Metamizole (Novalgin)	Sanofi-Aventis Gmbh	1553758	Metamizole solution
Microdrive (R2Drive)	3DNeuro		Recoverable Metal micro drive with moveable shuttle. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Mineral Oil	Sigma-Aldrich	M5310-100ML	Oil used as solvent to create craniotomy protection gel.
Non-Shedding Wipes (Kimtech)	Kimtech	7552	Non-shedding wipes
Primer	Bisco	B-7202P	Universal skull adhesive preventing moisture from deteriorating the cement and providing a solid base to build up cement onto.
R2Drive holder	3DNeuro		Stereotactic attachment for mounting R2Drive. Open souce, also available at https://buzsakilab.github.io/ 3d_print_designs/
Self-adherent wrap	3M	VB050	Protective wrap for implant post surgery
Silicon probe (H2)	Cambridge Neurotech		Chronically implantable linear silicon probe with 32 channels. Alternative Probe use possible.
Silicone Elastomer (Duragel)	Cambridge Neurotech		Silicone Elastomer
Silicone Plaster (Kwikcast)	WPI	KWIK-CAST
Silver conductive epoxy	MG Chemicals	8331D-14G	Silver epoxy
Size 5 Dumont forceps	FSTools	11251-10	Small forceps for lifting bone flap.
Stainless steel wire, Teflon coated	Science Products GmBH	SS-3T	Ground wire
Stereotax (RWD)	RWD	68803	Stereotax for surgical procedures on mice.
Tergazyme	Alconox	1304	A possible enzymatic cleaner to clean probe
Two Part Fast setting Epoxy Resin	Gorilla	EP3	Epoxy for permanent bonding of DREAM implant parts.
Vannas Spring Scissors Round Handle	FSTools	15403-08	0.075mm straight tipped spring rebound veterinary scissors.
Veterinary Cyanoacrylate glue (Vetbond)	3M	70-0068-5256-3	Veterinary cyanoacrylate glue