JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول منهجية لتلخيص ضعف تكوين الخلايا العصبية لمتلازمة داون (DS) باستخدام DS iPSCs البشرية. حدد البروتوكول عيب دورة الخلية ثنائية الطور كسبب لضعف تكوين الخلايا العصبية في متلازمة داون. يوفر منصة قوية لفهم الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء تكوين الخلايا العصبية غير الطبيعي المرتبط ب DS.

Abstract

تعد متلازمة داون (DS) ، الناتجة عن نسخة إضافية من الكروموسوم 21 ، سببا رئيسيا للإعاقة الذهنية. أحد العوامل الرئيسية التي تساهم في هذه الإعاقة الذهنية هو ضعف تكوين الخلايا العصبية الذي لوحظ من مراحل الجنين فصاعدا. لدراسة هذه التشوهات النمائية العصبية ، توفر الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) التي يتم إنشاؤها باستخدام الخلايا التي تم الحصول عليها من مرضى DS نموذجا قيما وذا صلة. هنا ، يتم وصف بروتوكول شامل لتلخيص تكوين الخلايا العصبية الضعيفة DS التي لوحظت خلال مراحل الجنين DS. يستخدم هذا البروتوكول زوجا من DS-hiPSCs يحتوي على ثلاث نسخ من الكروموسوم 21 ويحتوي hiPSCs euploid متساوي التكوين على نسختين من الكروموسوم 21. الأهم من ذلك ، أن البروتوكول الموصوف هنا يلخص تكوين الخلايا العصبية الضعيفة DS ووجد أن عيب دورة الخلية ثنائية الطور ، أي انخفاض تكاثر الخلايا السلفية العصبية DS (NPC) خلال المرحلة المبكرة من المرحلة العصبية متبوعة بزيادة انتشار DS NPC خلال المرحلة المتأخرة من المرحلة العصبية هو سبب ضعف تكوين الخلايا العصبية. يؤدي الانتشار المتزايد ل DS NPC خلال المرحلة المتأخرة من المرحلة العصبية إلى تأخير الخروج من دورة الخلية ، مما يتسبب في انخفاض توليد الخلايا العصبية بعد الانقسامية من DS NPCs. يتضمن هذا البروتوكول خطوات مفصلة للحفاظ على hiPSCs ، وتمايزها إلى سلالات عصبية تعرض عيبا في دورة الخلية ثنائية الطور خلال المرحلة العصبية ، والتحقق اللاحق من التمايز العصبي المنخفض في خلايا DS. باتباع هذه المنهجية ، يمكن للباحثين إنشاء نظام تجريبي قوي يحاكي ظروف النمو العصبي ل DS ، مما يمكنهم من استكشاف التغيرات المحددة في نمو الدماغ الناجمة عن التثلث الصبغي 21.

Introduction

متلازمة داون (DS) ، أو التثلث الصبغي 21 ، هي أكثر شذوهات الكروموسومات شيوعا والسبب الرئيسي للإعاقة الذهنية (ID) 1. يعد ضعف تكوين الخلايا العصبية أثناء نمو الجنين DS أحد أسباب الإعاقة الذهنية في DS2. تظهر دراسات الجنين البشري DS انخفاضا في وزن الدماغ وحجمه ، وانخفاض الخلايا العصبية ، وزيادة الخلايا النجمية3،4 ، والتوزيع غير الطبيعي للخلايا العصبية في الطبقتين الثانية والرابعة5،6. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المرحلة الثانية من التطور القشري ، أي ظهور التصفيح ، تتأخر وغير منظمة في DS7.

تمت دراسة عيوب النمو العصبي في DS في الغالب باستخدام نماذج الفئران من DS مثل Ts65Dn و Ts1RRR و Ts1cje8. ومع ذلك ، لم تكن نماذج الفئران هذه قادرة على تلخيص الأنماط الظاهرية المختلفة التي لوحظت في دراسات DS بشكل كامل بسبب الاختلافات الفسيولوجية والتنموية بين الفئران والبشر9 ، مما أدى إلى فشل التجارب السريرية10. أتاح اختراع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات11،12 فرصة لنمذجة الضعف العصبي لمتلازمة داون باستخدام الخلايا المشتقة مباشرة من الأفراد المصابين بمتلازمة داون. ومع ذلك, المحاولات السابقة لنمذجة عيوب النمو العصبي DS باستخدام iPSCs البشرية قابلت نتائج غير متسقة ولم تستطع تفسير عيوب النمو العصبي بشكل كامل التي لوحظت في أقسام دماغ الجنين DS 13,14,15,16. على سبيل المثال ، وجد تقرير نشره Shi et al. الأنماط الظاهرية لمرض الزهايمر المرتبط ب DS ولكنه لم يبلغ عن أي اختلاف في تكوين الخلايا العصبية ل DS مقارنة بعناصر التحكم euploid15. وبالمثل ، أبلغ Weick et al. عن انخفاض النشاط المشبكي ولكن تكوين الخلايا العصبية الطبيعي في DS مقارنة بعناصر التحكم euploid16. ومع ذلك ، فإن تكوين الخلايا العصبية الطبيعي في DS المبلغ عنه في هذه المنشورات لم يكن متسقا مع الملاحظة من أقسام دماغ الجنين DS. في وقت لاحق ، أفاد تقرير أعده هباوي وآخرون عن انخفاض تكوين الخلايا العصبية في DS ، والذي كان متسقا مع الملاحظة من قسم دماغ الجنينDS 14. ومع ذلك ، وصف هذا التقرير وتقرير حديث آخر انخفاض انتشار NPCs DS بأنه سبب انخفاض تكوين الخلايا العصبية في DS14،17. ومع ذلك ، فإن انخفاض انتشار DS NPCs فقط لا يمكن أن يفسر زيادة الخلايا الفلكية وتأخر ظهور التصفيح أثناء نمو دماغ الجنين DS.

في العمل المنشور مؤخرا ، تم تطوير نموذج تكوين الخلايا العصبية الضعيف DS القائم على iPSC يظهر انخفاض تكوين الخلايا العصبية. وجد هذا النموذج أن ضعف تكوين الخلايا العصبية في DS يرجع إلى عيوب دورة الخلية ثنائية الطور خلال المرحلة العصبية (المرحلة التي يتم خلالها إنشاء الخلايا السلفية العصبية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات). خلال المرحلة الأولى من المرحلة العصبية ، تظهر DS NPCs انتشارا منخفضا مقارنة بالخلايا العصبية euploid متساوية المنشأ ، تليها زيادة تكاثر DS NPCs مقارنة بالخلايا euploid متساوية التكوين في المرحلة المتأخرة من المرحلةالعصبية 18.

في هذه المخطوطة ، تم وصف بروتوكول مفصل خطوة بخطوة لتمايز hiPSCs متلازمة داون وhiPSCs متساوية الصيغة الصبغية إلى خلايا عصبية قشرية. الهدف العام من هذه الطريقة هو توفير بروتوكول مفصل خطوة بخطوة للتمييز بين زوج من DS hiPSCs و hiPSCs euploid متساوي التكوين إلى خلايا عصبية قشرية مع التركيز على نمذجة عيوب تكوين الخلايا العصبية المرتبطة ب DS. تم تصميم هذا البروتوكول لتقديم نظام قوي وقابل للتكرار للتحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء التشوهات التي تسبب تكوين الخلايا العصبية الضعيفة ب DS.

الأساس المنطقي وراء تطوير هذا البروتوكول هو السماح بتمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات إلى خلايا عصبية قشرية من خلال استخدام مبادئ علم الأحياء العصبية التنموي ، مما يسمح بتحديد الأنماط الظاهرية التي تنشأ بسبب المرض / الاضطراب. وكان يهدف إلى اتخاذ نهج أضيق الحدود للتمايز العصبي من iPSCs عن طريق تجنب مركبات مثل cAMP أو DAPT, التي قد تخفي الأنماط الظاهرية للمرض الناشئة بسبب عيوب في قناة Ca ++ أو مسار NOTCH, على التوالي. وبالمثل ، تم أيضا تجنب استخدام حمض الأسكوربيك و BDNF و GDNF ، مما قد يخفي الأنماط الظاهرية الأخرى المرتبطة بالأمراض العصبية عن طريق تحفيز تكوين الخلايا العصبية.

تكمن مزايا هذه التقنية على الطرق البديلة في توفير تلخيص قوي للأنماط الظاهرية العصبية التي لوحظت في أقسام دماغ الجنين DS. وتجدر الإشارة إلى أنه بالمقارنة مع نماذج الفئران ، فإن النظام البشري القائم على iPSC يزيل الاختلافات بين الأنواع ، مما يوفر نموذجا أكثر صلة لدراسة عمليات النمو العصبي الخاصة بالإنسان9 ولكنه فشل حتى الآن في تلخيص ضعف تكوين الخلايا العصبية التي لوحظت في مراحل الجنين DS فصاعدا. علاوة على ذلك ، فإن استخدام أزواج متساوية المنشأ من hiPSCs يقلل من التباين ويعزز موثوقية الاختلافات المظهرية المرصودة. سيكون هذا البروتوكول ذا أهمية خاصة للباحثين الذين يدرسون اضطرابات النمو العصبي وتكوين الخلايا العصبية البشرية. إنه مناسب بشكل خاص لأولئك الذين يسعون إلى نمذجة الجوانب الخاصة بالإنسان من DS أو المهتمين بتطوير تدخلات علاجية تستهدف عيوب تكوين الخلايا العصبية المرتبطة بالتثلث الصبغي 21.

Protocol

اتبعت البروتوكول التالي مع زوجين من متلازمة داون ومتساوي الصيغة الصبغية iPSCs البشرية. تم إنشاء زوج واحد باستخدام طريقة التوصيل بوساطة الفيروسات القهقرية لإعادة البرمجة19 ، وتم إنشاء زوج ثان (NSi003-A و NSi003-B) باستخدام طريقة إيصال فيروس Sendai غير المتكامل20. يتكون البروتوكول بشكل عام من مرحلتين: المرحلة العصبية (المرحلة 1) ومرحلة التمايز العصبي (المرحلة 2). علاوة على ذلك ، لوحظت مرحلتان تستند إلى الاختلافات في انتشار متلازمة داون وخطوط الخلايا euploid متساوية الجين ، أي المرحلتين المبكرة والمتأخرة ، في المرحلة العصبية. تفاصيل الكواشف والوسائط والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. متلازمة داون hiPSCs وثقافة وصيانة hiPSCs euploid euploid متساوية الأصل

  1. طلاء التغذية ل hiPSCs
    ملاحظة: جودة المغذي والكثافة مهمة للغاية لنوعية جيدة من ثقافة iPSCs البشرية.
    1. أضف 2 مل من الجيلاتين 0.1٪ لتغطية صفيحة من 6 آبار لمدة 1-2 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية قبل البذر بالخلايا المغذية.
    2. احتفظ باللوحة المطلية بالجيلاتين في درجة حرارة الغرفة في غطاء مزرعة الخلية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل طلاء الخلايا.
    3. وسائط الخلايا الليفية الجنينية للفأر الدافئة (MEF) لاستخدامها في الإحياء في حمام الخرزة / الحمام المائي.
    4. Aliquot 5 مل من وسائط MEF في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
    5. أخرج قارورة من الخلايا المغذية من خزان النيتروجين السائل (خزان LN2).
      ملاحظة: تم اشتقاق الخلايا المغذية عن طريق معالجة الخلايا الليفية الجنينية E13.5 Mouse ب 10 ميكروغرام / مل Mitomycin C لمدة 3 ساعات متبوعة بغسل 2-3 مرات باستخدام DPBS18. يمكن استخدام خلايا التغذية مباشرة أو تجميدها في خزان LN2 للاستخدام في المستقبل. تم استخدام جميع الفئران بعد موافقة اللجنة المؤسسية لأخلاقيات.
    6. احتفظ بالقارورة عند 37 درجة مئوية في الحمام المائي باستخدام رف عائم حتى تبقى قطعة صغيرة من الثلج.
    7. خذ القارورة داخل خزانة السلامة الحيوية وقم بتعقيمها بالكحول قبل وضعها داخل خزانة السلامة الحيوية.
    8. أضف 1 مل من وسائط MEF الدافئة (انظر جدول المواد) قطرة قطرة.
    9. أخرج الوسائط من القارورة برفق واسكبها قطرة قطرة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على وسائط MEF.
    10. جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 200 × جم.
    11. شفط المادة الطافية باستخدام نظام الشفط الفراغي (VAS).
    12. أضف 1 مل من متوسط MEF وقم برفع الماصة برفق لأعلى ولأسفل 3-4 مرات.
    13. خذ عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. تم استبعاد الخلايا الميتة باستخدام Trypan Blue.
    14. اللوحة 3.1-3.3 × 105 خلايا تغذية حية لكل بئر من صفيحة 6 آبار أو 2 × 106 خلايا لكل صفيحة 6 آبار في وسط MEF.
    15. احتفظ باللوحة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية مع رطوبة 85٪ طوال الليل. رج اللوحة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 من الأمام والخلف والجانبين 2-3 مرات لتحقيق توزيع متجانس للخلايا المغذية.
  2. إحياء hiPSCs متلازمة داون وhiPSCs متساوي الصيغة الصبغية
    ملاحظة: قم بتسخين الحجم المطلوب من وسائط hiPSC في حمام حبة 37 درجة مئوية.
    وسط إحياء الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحث عن الإنسان (hiPSC): أضف حديثا 25 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) و 10 ميكرومتر مثبط الصخور (RI) (Y-27632 2HCl) في وسط hiPSC.
    1. قم بإزالة وسائط MEF من المغذيات جيدا وقم بغسل المغذيات مرة واحدة عن طريق إضافة 1 مل / بئر من DMEM / F12 الدافئ برفق من جوانب البئر. استنشق الوسط وأضف 2 مل / وسط إحياء hiPSC دافئ جيدا. اترك اللوحة داخل الحاضنة لمدة 2 ساعة على الأقل قبل طلاء hiPSCs.
    2. أخرج قارورة من hiPSCs.
    3. احتفظ بالقارورة على رف عائم في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية حتى تبقى قطعة صغيرة من الثلج.
    4. قبل أخذ القارورة داخل خزانة السلامة الحيوية ، قم بتعقيمها بالكحول بنسبة 70٪.
    5. أضف 1 مل من وسط إحياء hiPSC الدافئ.
    6. أخرج الوسائط من القارورة برفق واسكبها قطرة قطرة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسائط إحياء hiPSCs.
    7. جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين عند 100 × جم.
    8. قم بشفط المادة الطافية باستخدام VAS وقم بإزاحة الحبيبات عن طريق النقر برفق على الأنبوب.
    9. صب 500 ميكرولتر من وسط hiPSC مع 10 ميكرومتر من RI واسكبه فوق لوحة التغذية التي تحتوي على وسط إحياء hiPSC. قم بتسمية اللوحة باسم الخلية ورقم المقطع واسم الباحث والتاريخ.
    10. مراقبة مستعمرات hiPSC تحت مجهر مقلوب بتكبير 4x ؛ يجب أن يكون هناك كتل من الخلايا.
    11. مع الاحتفاظ باللوحة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 ، قم بهز اللوحة من الأمام والخلف والجانبين 2-3 مرات لتحقيق توزيع متجانس للخلايا. لا تزعج اللوحة لمدة 24 ساعة.
    12. في اليوم التالي ، قد تبدو بعض المستعمرات ملتصقة بالمغذيات ، وبعضها قد يطفو. بدون شفط أي وسائط ، أضف وسط hiPSCs طازجا مكملا ب 25 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر من RI.
    13. في اليوم الثاني بعد الإحياء ، سيتم ربط معظم المستعمرات بالسطح. قم بتغيير الوسط الكامل مع وسيط hiPSC مع 25 نانوغرام / مل bFGF. في الأيام التالية ، ستكون مستعمرات hiPSC مرئية.
      ملاحظة: يستغرق الأمر أسبوعا على الأقل حتى تنعش hiPSCs وتصنع مستعمرات ذات حدود ناعمة ومحددة جيدا ، ومورفولوجيا خلوية موحدة ، ومركز مستعمرة كثيف.
  3. مرور hiPSCs متلازمة داون وhiPSCs متساوية الصيغة الصبغية على المغذيات
    ملاحظة: يجب أن تكون جميع الكواشف دافئة قبل البدء. تجنب الإفراط في سحب الخلايا. تعامل مع الخلايا برفق شديد.
    1. مرور hiPSCs عندما تبدأ معظم المستعمرات في الاندماج مع بعضها البعض أو عندما يكون هناك ظهور عدد كبير جدا من المستعمرات المتمايزة. بشكل عام ، يجب إجراء التقسيم في غضون 5-7 أيام بعد المرور الأول.
    2. قم بإحياء قارورة من المغذيات قبل يوم واحد من الانقسام.
    3. أعط غسلا واحدا للمغذيات التي تحتوي على 1 مل / بئر من DMEM / F12 الدافئ وأضف 2 مل / بئر من متوسط hiPSCs الدافئ المكمل ب 25 نانوغرام / مل bFGF. اترك اللوحة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل طلاء hiPSCs.
    4. راقب اللوحة التي تحتوي على hiPSCs بحثا عن مستعمرات متمايزة وقم بإزالة المستعمرة المتمايزة عن طريق التخريد باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر تحت مجهر مجسم.
    5. اغسل مرة واحدة لمركبات الاحتجاز العالي مع 1 مل / دافئ جيدا DMEM / F12.
    6. صب 1 مل / بئر من محلول الكولاجيناز 1 مجم / مل. احتفظ باللوحة داخل الحاضنة لمدة 8-10 دقائق ، ثم راقب تحت المجهر المقلوب الحواف السائبة للمستعمرات.
    7. شفط الكولاجيناز وإعطاء 2 غسلة من DMEM / F12. ثم أضف 1 مل / بئر hiPSC متوسط.
    8. قم بقطع المستعمرات برفق أفقيا وعموديا 8-10 مرات في بئر باستخدام طرف حقنة سعة 2 مل. راقب المستعمرات تحت المجهر المقلوب للتحقق مما إذا كانت معظم المستعمرات قد تم قطعها إلى الحجم المناسب.
    9. إذا تم قطع المستعمرات بشكل كاف ، ارفع المستعمرات برفق باستخدام رافع الخلايا.
    10. قم بماصة المستعمرات في البئر برفق باستخدام طرف 1 مل ، 5-8 مرات ، حسب حجم المستعمرات.
    11. اجمع كل الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين عند 100 × جم.
    12. قم بشفط المادة الطافية برفق باستخدام ماصة ، وقم بإزاحة حبيبات الخلية عن طريق النقر برفق على الأنبوب ، وأضف 200 ميكرولتر من وسط hiPSC مع 25 نانوغرام / مل bFGF و 10 ميكرومتر من RI. ماصة 2-3 مرات باستخدام الماصة 200 ميكرولتر وإضافة 300 ميكرولتر من وسط hiPSC مع 25 نانوغرام/مل bFGF و10 ميكرومتر من RI.
    13. الآن قم بوضع هذه الخلايا برفق فوق المغذيات التي تحتوي على متوسط hiPSC + 25 نانوغرام / مل bFGF. يمكن تقسيم بئر واحد إلى 1: 2 أو 1: 3 ، اعتمادا على عدد المستعمرات الموجودة بعد إزالة المستعمرات المتمايزة. قم بتسمية اللوحة باسم الخلية ورقم المقطع واسم الباحث والتاريخ.
    14. مع الاحتفاظ باللوحة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 ، قم بهز اللوحة من الأمام والخلف والجانبين 2-3 مرات لتحقيق توزيع متجانس للخلايا.
    15. في اليوم التالي ، اغسلي بلطف مع DMEM / F12 دافئ وأضيفي 2.5 مل من وسط hiPSC مع 25 نانوغرام / مل bFGF.
  4. تجميد hiPSCs متلازمة داون والخلايا العليا Euploid متساوية المنشأ من المغذيات
    ملاحظة: يجب تجنب الإفراط في سحب العين iPSCs البشرية أثناء إجراء التجميد.
    1. قم بتقسيم hiPSCs عندما لا تزال في مرحلة السجل ، أي بعد 4-5 أيام من المرور.
    2. راقب الصفيحة التي تحتوي على hiPSCs للمستعمرات المتمايزة وقم بإزالة المستعمرات المتمايزة باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر تحت مجهر مجسم.
    3. اغسل مرة واحدة لمركبات الاحتجاز العالي مع 1 مل / دافئ جيدا DMEM / F12.
    4. أضف 1 مل / بئر من محلول الكولاجيناز 1 مجم / مل. احتفظ باللوحة داخل الحاضنة لمدة 8-10 دقائق ، ثم راقب تحت المجهر المقلوب لرفع حواف المستعمرات.
    5. شفط الكولاجيناز وإعطاء 2 غسلة من DMEM / F12. ثم أضف 1 مل / بئر hiPSC متوسط.
    6. ارفع المستعمرات برفق باستخدام رافع الخلايا.
    7. قم بتقطيع المستعمرات في البئر برفق باستخدام طرف 1 مل 5-8 مرات ، اعتمادا على حجم المستعمرات.
    8. اجمع كل الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين عند 100 × جم.
    9. قم بشفط المادة الطافية برفق باستخدام ماصة ، وقم بإزاحة حبيبات الخلية عن طريق النقر برفق على الأنبوب ، وأضف 1 مل من hiPSC Medium بدون مضاد حيوي مكمل ب 25 نانوغرام / مل bFGF حسب عدد الآبار. توزيع الخلايا في المبردات.
    10. أضف hiPSC Medium بدون مضاد حيوي مكمل ب 25 نانوغرام / مل bFGF و 20٪ DMSO في المبردات لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 10٪ من DMSO.
    11. ضع المبردات في مكان بارد مع حمام الأيزوبروبانول لتوفير تجميد بطيء.
    12. حافظ على الفاترة عند -80 درجة مئوية طوال الليل. انقل القوارير في اليوم التالي إلى خزان LN2.

2. التمايز العصبي

ملاحظة: تحضير الوسط المكيف بوحدة التغذية (FCM): استخدم قارورة T-75 ولوحة 4 × 106 خلايا تغذية لكل قارورة. في اليوم التالي ، أضف 40 مل من وسط hiPSC مع 4 نانوغرام / مل bFGF. اجمع لمدة 7 أيام. قم بتخزين كل أنبوب يومي عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. قم بتغطية طبق مقاس 15 سم ب 10 مل من الجيلاتين 0.1٪ عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل تفكيك الخلايا. قم بتغطية صفيحة مكونة من 6 آبار بمصفوفة غشاء قاعدية مؤهلة من hESC (تسمى فيما يلي "المصفوفة المؤهلة") قبل يوم واحد من تفكيك الخلايا. عند تفكيك الخلايا في البروتوكول بأكمله ، أضف 10 ميكرومتر من RI إلى محلول انفصال الخلية (انظر جدول المواد) و DPBS ووسائط الطلاء (FCM مكمل ب 25 نانوغرام / مل bFGF). قم بإعداد وسيط مكيف بوحدة تغذية جديدة (FCM) لكل تمايز. تجنب الإفراط في سحب معالي الأنابيب عالية النطاقات.

  1. اليوم في المختبر (DIV) 2: صنع خلايا مفردة وبذر hiPSCs للتمايز العصبي
    1. أضف 10 ميكرومتر من RI إلى وسائط hiPSC مكملة ب 25 نانوغرام / مل bFGF و DPBS ومحلول انفصال الخلايا والوسط المكيف المغذي المكمل ب 25 نانوغرام / مل bFGF. قم بتسخين كل هذه الكواشف عند 37 درجة مئوية.
    2. خذ لوحة 6 آبار من iPSCs على مغذيات, إزالة المستعمرات متباينة, وإضافة وسائط hiPSC جديدة مكملة مع 25ng/مل bFGF و 10 ميكرومتر من RI. احتفظ بالطبق لمدة 2 ساعة في الحاضنة.
    3. أخرج لوحة iPSCs بعد 2 ساعة وأعط غسلة واحدة مع DPBS بدون Ca ++ و Mg ++.
    4. أضف 1 مل / محلول انفصال خلية البئر (+ 10 ميكرومتر من RI) واحتفظ باللوحة داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 12-14 دقيقة.
    5. بعد 12-14 دقيقة ، راقب الخلايا تحت المجهر المقلوب ؛ تبدأ معظم الخلايا في الانفصال عن اللوحة. إذا استمرت بعض الخلايا في التصاق ، فاضغط برفق على اللوحة من الجانبين.
    6. تمييع محلول انفصال الخلايا عن طريق إضافة 3 مل / بئر DPBS مع Ca ++ و Mg ++ (+ 10 ميكرومتر من RI). باستخدام ماصة سعة 5 مل ، قم بسحب العينات بلطف 2-3 مرات ، وتجنب الفقاعات لكسر التكتلات.
    7. مرر الخلايا عبر مصفاة 40 ميكرومتر.
    8. اجمع الخلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
    9. جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 200 × جم وشفط الوسائط برفق باستخدام VAS.
    10. أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسط hiPSC (+ 25 نانوغرام / مل bFGF + 10 ميكرومتر من RI). أضف الخلايا إلى طبق 15 سم مطلي بالجيلاتين بنسبة 0.1٪ لمدة 1.5 ساعة لإزالة المغذيات لأن المغذيات لها التصاق تفضيلي بالسطح المطلي بالجيلاتين مقارنة ب hiPSCs.
    11. بعد 1.5 ساعة ، اجمع الوسائط برفق مع الخلايا وأجهزة الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 200 × جم. استنشاق الوسائط باستخدام VAS.
    12. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من FCM (+ 25 نانوغرام / مل bFGF + 10 ميكرومتر من RI) وخذ عدد الخلايا.
    13. باستخدام FCM (+ 25 نانوغرام / مل bFGF + 10 ميكرومتر من RI) ، قم بعمل تعليق خلية من 30،000-50،000 خلية / مل وبذرة 5 مل معلق خلية / صفيحة 60 مم أو 2 مل / بئر من 6 آبار أو 500 ميكرولتر / بئر من لوحة 24 بئر. يجب أن تكون الألواح مطلية بمصفوفة مؤهلة (انظر جدول المواد).
  2. DIV 0: (~ 48 ساعة لاحقا): قم بتغيير الوسط المكيف بوحدة التغذية إلى وسائط NPC (DDM + B27 بدون فيتامين A + N2) (انظر جدول المواد).
  3. DIV 2: أضف وسيط NPC مع 0.125 ميكرومتر من Dorsomorphin كل يوم بديل حتى DIV 18.
  4. DIV 18: أضف وسائط NPC بدون Dorsomorphin وقم بتجديدها كل يوم بديل حتى DIV 28.
  5. DIV 28-30: صنع خلايا مفردة وبذر الشخصيات غير القابلة للعب للمرحلة 2
    1. في DIV 28 ، أخرج اللوحة (التي تحتوي على NPCs) ، واستبدل الوسائط بوسائط NPC (+ 10 ميكرومتر من RI). ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 2 ساعة.
    2. بعد ساعتين ، قم بشفط الوسائط وغسل مرة واحدة باستخدام DPBS (بدون Ca ++ و Mg ++).
    3. أضف 1 مل / محلول انفصال خلية البئر (+ 10 ميكرومتر من RI) واحتفظ باللوحة داخل الحاضنة لمدة 14 دقيقة.
    4. بعد 14 دقيقة ، راقب الخلايا تحت المجهر المقلوب عند 4x. تبدأ معظم الخلايا في الانفصال عن اللوحة. إذا استمرت بعض الخلايا في التصاق ، فاضغط برفق على اللوحة من الجانبين.
    5. قم بتخفيف محلول انفصال الخلية عن طريق إضافة 3 مل / بئر DPBS مع Ca ++ و Mg ++ (+ 10 ميكرومتر من RI). باستخدام ماصة سعة 5 مل ، قم بسحب العينات بلطف 2-3 مرات ، وتجنب الفقاعات لكسر التكتلات.
    6. تمر عبر مصفاة 40 ميكرومتر موضوعة على أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
    7. جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق عند 200 × جم. قم بشفط الوسائط برفق باستخدام VAS.
    8. أعد تعليق الخلايا في DDM + B27 بفيتامين أ (+ 10 ميكرومتر من RI).
    9. عد الخلايا الحية باستخدام التربان الأزرق باستخدام مقياس كثافة الدم.
    10. قم بزرع 50,000 خلية / بئر على صفيحة مؤهلة مطلية بمصفوفة (1x) من اللوحة المكونة من 48 بئرا.
  6. DIV 33: تغيير الوسيط إلى وسيط التمايز العصبي (انظر جدول المواد). قم بتغيير الوسيط كل 5 أيام. استمر في تجديد الوسائط حتى DIV 85/90.

3. كيمياء الخلايا المناعية (ICC)

ملاحظة: أضف ما يكفي من المخزن المؤقت في جميع المراحل لتغطية الخلايا وتجنب جفاف البئر أثناء الشفط أثناء مرحلة الغسيل.

  1. أخرج صفيحة الخلية المتمايزة خارج منطقة زراعة الخلايا.
  2. استنشق الوسائط وغسل DPBS.
  3. للتثبيت ، أضف 1 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) إلى الخلايا. غطي اللوحة بورق الألمنيوم وضعيها على شاكر هزاز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. قم بشفط PFA وأعط ثلاث غسلات كل منها 15 دقيقة باستخدام DPBS (بدون Ca ++ و Mg ++).
  5. أضف المخزن المؤقت المانع (3٪ BSA + 5٪ مصل الحمار (أو مصل من المضيف للجسم المضاد الثانوي) + 0.2٪ Triton-X في DPBS) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  6. أضف 250 ميكرولتر / بئر من الأجسام المضادة الأولية [Ki67 (1: 100 تخفيف) ، TUBB3 (1: 500 تخفيف) ، PAX6 (1: 100)] واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر هزاز. تم التخفيف في محلول حظر.
  7. يغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية.
  8. أضف 250 ميكرولتر / بئر من الجسم المضاد الثانوي (مخفف 1: 250 في 3٪ BSA + 0.2٪ Triton-X في DPBS) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  9. يغسل 3 مرات باستخدام DPBS بعد حضانة الأجسام المضادة الثانوية.
  10. أضف DAPI (1: 1000 تخفيف من مخزون 5 مجم / مل في DPBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل ثلاث مرات باستخدام DPBS. اترك الغسيل الأخير في لوحة الثقافة وراقب تحت المجهر.

4. الحصول على الصور وتحليلها

  1. التقط الصور باستخدام المجهر الفلوري بدقة 20x.
  2. التقط صورا ل Ki67 ، بالإضافة إلى صور تلطيخ TUBB3 باستخدام مرشح إثارة يبلغ 540 نانومتر ، و PAX6 باستخدام مرشح إثارة يبلغ 488 نانومتر ، وصور DAPI باستخدام مرشح إثارة يبلغ 358 نانومتر.
  3. التقط صورا من عشرة حقول عشوائية مختلفة للتحليل.
  4. تحليل صور ICC باستخدام برنامج ImageJ.
  5. بالنسبة لتحليل TUBB3 و PAX6 ، قم بإجراء عتبة لجميع الصور للإشارتين الحمراء والخضراء ، على التوالي ، وشدة الإشارة الزرقاء ل DAPI. تم تطبيع متوسط شدة وحدات البكسل الحمراء ل TUBB3 والبكسل الأخضر ل PAX6 مع متوسط شدة وحدات البكسل الزرقاء ل DAPI.
  6. لتحليل Ki67 ، قم بحساب الخلايا باستخدام ميزة عداد الخلايا الآلي في برنامج ImageJ. تطبيع عدد الخلايا الإيجابية Ki67 بعدد الخلايا الإيجابية ل DAPI.
  7. إجراء التحليل الإحصائي باستخدام برامج الإحصاء والرسوم البيانية من خلال مقارنة المجموعتين باستخدام اختبارات t غير المزاوجة. يجب التعبير عن البيانات كمتوسط ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. تعتبر القيمة الاحتمالية التي تقل عن 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تم زرع iPSCs البشرية المفردة على أطباق مؤهلة المغلفة بالمصفوفة كمعلقات أحادية الخلية, وبدأ التمايز عن طريق إزالة bFGF. لتثبيط التمايز غير الأديم الظاهر ، تمت إضافة دورسومورفين ، وهو مثبط إشارات BMP ، من DIV 2-1821. لمزيد من التمايز بين الخلايا السلفية من المرحلة العصب?...

Discussion

في هذا العمل ، تم وصف بروتوكول التمايز العصبي القشري أحادي الطبقة الفعال غير الموجه لزوج متساوي الجين من hiPSCs Euploid و DS hiPSCs. منذ الخلايا نمت كطبقات أحادية, أنها أكثر تعرضا لظروف الثقافة, وهو أمر غير ممكن بنفس القدر مثل استخدام الأجسام الجنينية للتمييز iPSCs, التي تستخدم عموما ?...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون البروفيسور ستيوارت أوركين لتزويدنا بزوج من متلازمة داون ومتلازمة داون ومتساوي الصيغة الصبغية hiPSCs. كما يعرب المؤلفون عن امتنانهم للمركز الوطني لعلوم الخلايا (BRIC-NCCS) ، بيون ، لتوفير التمويل لتنفيذ هذا العمل.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MEF medium:
DMEM High GlucoseGibco11965-092
FBSVWR97068-08510% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-MercaptoethanolGibco21985-0231X final concentration
hiPSC medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Knockout Serum Replacement (KOSR)Gibco10828-02820% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-Mercaptoethanol (1000X)Gibco21985-0231X final concentration
DDM medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
Albumax (10%)Invitrogen 11020-0210.5 X of 10% Albumax is final concentration
NPC medium:
DDM medium
N2 SupplementGibco 175020481X final concentration
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AGibco 125870101X final concentration
Neural Differentiation medium (ND):
DDM medium1/2 of volume
Neurobasal MediumGibco 21103-0491/2 of volume
N2 SupplementGibco 175020480.5 X final concentration
B-27 Supplement (50X)Gibco 175040440.5 X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X of Neurobasal medium
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X of Neurobasal medium
Antibodies and reagents for immunostaining:
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G4%
DPBS, no calcium, no magnesiumSigma-AldrichD5652
Triton-X-100 SolutionSigma-AldrichX100-500ML0.20%
BSAHycloneA7979-50ML1.00%
Purified anti-tubulin β-3 (TUBB3) (TUJ1)BioLegend8012021:500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa fluor 594 conjugateLife Tech Invitrogen A212031:250 dilution
Purified Mouse-Anti-Human Ki67BD Pharmingen5506091:100 dilution
Purified anti-PAX6BioLegends9013021:100 dilution
Alexa fluor 488 Donkey (anti-rabbit)Life Tech Invitrogen A212061:250 dilution
DAPI Solution (5 mg/mL)SigmaD95421:1000 dilution
Others
Cell detachment solution (Accutase) Gibco A11105-01Ready to use working solution
Rock inhibitor (RI) Sellechckem Y2763210 mM/ml final concentration
Dorsomorphin Sellechckem S73060.125 nM/ml final concentration
DPBS with calcium and magnisium (DPBS+ Ca, Mg)Gibco 14040133Ready to use working solution
DPBS without calcium and magnisiumGibco 14190136Ready to use working solution
Gelatin Type ASigma G2500-100G0.10%
hESC-qualified basement membrane matrix (Matrigel GFR) Corning 3562301 mg stock vial diluted 1:240
Trypsin 0.05%Gibco25300054
Trypan BlueGibco15250-0610.40%
Basic Fibrablast Growth Factor (bFGF)Peprotech 100-18B25 ng/ml final concentration
Collagenase Gibco 17104-0191mg/ml final concentration

References

  1. Chapman, R. S., Hesketh, L. J. Behavioral phenotype of individuals with Down syndrome. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 6 (2), 84-95 (2000).
  2. Haydar, T. F., Reeves, R. H. Trisomy 21 and early brain development. Trends Neurosci. 35 (2), 81-91 (2012).
  3. Wisniewski, K. E. Down syndrome children often have brain with maturation delay, retardation of growth, and cortical dysgenesis. Am J Med Genet Suppl. 7, 274-281 (1990).
  4. Guidi, S., et al. Neurogenesis impairment and increased cell death reduce total neuron number in the hippocampal region of fetuses with Down syndrome. Brain Pathol. 18 (2), 180-197 (2008).
  5. Lott, I. T. Neurological phenotypes for Down syndrome across the life span. Prog Brain Res. 197, 101-121 (2012).
  6. Stagni, F., Giacomini, A., Emili, M., Guidi, S., Bartesaghi, R. Neurogenesis impairment: An early developmental defect in Down syndrome. Free Radic Biol Med. 114, 15-32 (2018).
  7. Golden, J. A., Hyman, B. T. Development of the superior temporal neocortex is anomalous in trisomy 21. J Neuropathol Exp Neurol. 53 (5), 513-520 (1994).
  8. Gupta, M., Dhanasekaran, A. R., Gardiner, K. J. Mouse models of Down syndrome: Gene content and consequences. Mamm Genome. 27 (11-12), 538-555 (2016).
  9. Wu, Y., West, N. R., Bhattacharyya, A., Wiseman, F. K. Cell models for Down syndrome-Alzheimer's disease research. Neuronal Signal. 6 (1), NS20210054 (2022).
  10. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. Am J Hum Genet. 103 (6), 829-857 (2018).
  11. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  12. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  13. Briggs, J. A., et al. Integration-free induced pluripotent stem cells model genetic and neural developmental features of Down syndrome etiology. Stem Cells. 31 (3), 467-478 (2013).
  14. Hibaoui, Y., et al. Modeling and rescuing neurodevelopmental defect of Down syndrome using induced pluripotent stem cells from monozygotic twins discordant for trisomy 21. EMBO Mol Med. 6 (2), 259-277 (2014).
  15. Shi, Y., et al. A human stem cell model of early Alzheimer's disease pathology in Down syndrome. Sci Transl Med. 4 (124), 124ra29 (2012).
  16. Weick, J. P., et al. Deficits in human trisomy 21 iPSCs and neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9962-9967 (2013).
  17. Meharena, H. S., et al. Down syndrome-induced senescence disrupts the nuclear architecture of neural progenitors. Cell Stem Cell. 29 (1), 116-130.e7 (2022).
  18. Sharma, V., et al. Biphasic cell cycle defect causes impaired neurogenesis in Down syndrome. Front Genet. 13, 1007519 (2022).
  19. Maclean, G. A., et al. Altered hematopoiesis in trisomy 21 as revealed through in vitro differentiation of isogenic human pluripotent cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (43), 17567-17572 (2012).
  20. Nehra, S., Sharma, V., Umrani, M., Singhal, N. Generation of integration-free Down syndrome and isogenic euploid human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 67, 103041 (2023).
  21. Yu, P. B., et al. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nat Chem Biol. 4 (1), 33-41 (2008).
  22. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
  23. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  24. Gaspard, N., et al. Generation of cortical neurons from mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 4 (10), 1454-1463 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HiPSCs21

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved