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요약

이 프로토콜은 DS human iPSC를 사용하여 다운 증후군(DS) 손상된 신경 발생을 재현하는 방법론을 설명합니다. 이 프로토콜은 이위상 세포주기 결함을 다운 증후군에서 손상된 신경 발생의 원인으로 확인했습니다. 이는 DS와 관련된 비정상적인 신경 발생의 기저에 있는 세포 및 분자 메커니즘을 이해하기 위한 강력한 플랫폼을 제공합니다.

초록

21번 염색체의 추가 사본으로 인해 발생하는 다운 증후군(DS)은 지적 장애의 주요 원인입니다. 이러한 지적 장애를 유발하는 주요 요인 중 하나는 태아 단계부터 관찰되는 신경 발생 장애입니다. 이러한 신경 발달 이상을 연구하기 위해 DS 환자에서 얻은 세포를 사용하여 생성된 인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC)는 가치 있고 관련성 있는 모델을 제공합니다. 여기에서는 DS 태아 단계에서 관찰된 DS 손상 신경 발생을 요약하기 위한 포괄적인 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 21번 염색체 사본 3개를 가진 한 쌍의 DS-hiPSC와 21번 염색체 사본 2개를 가진 동종 유배체 hiPSC를 사용합니다. 중요한 것은, 여기에 기술된 프로토콜은 DS 손상된 신경 발생을 요약하고 있으며, 이위상 세포주기 결함, 즉 신경인성 단계의 초기 단계에서 DS 신경전구세포(NPC)의 증식 감소와 신경인성 단계의 후반 단계에서 DS NPC의 증식 증가가 DS 손상된 신경 발생의 원인임을 발견했습니다. 신경인성 단계의 후반 단계에서 DS NPC의 증식 증가는 세포주기의 종료를 지연시켜 DS NPC의 유사분열 후 뉴런 생성을 감소시킵니다. 이 프로토콜에는 hiPSC의 유지를 위한 자세한 단계, 신경인성 단계에서 이위상 세포주기 결함을 나타내는 신경 계통으로의 분화, DS 세포에서 감소된 신경 분화에 대한 후속 검증이 포함됩니다. 이 방법론을 따름으로써 연구자들은 DS의 신경 발달 상태를 모방하는 강력한 실험 시스템을 만들 수 있으며, 이를 통해 21번 삼염색체증으로 인한 뇌 발달의 특정 변화를 탐구할 수 있습니다.

서문

다운 증후군(Down syndrome, DS) 또는 21번 삼염색체증(trisomy 21)은 가장 흔한 염색체 이상이며 지적 장애(ID)의 주요 원인입니다1. DS 태아 발달 중 손상된 신경 발생은 DS2에서 지적 장애의 원인 중 하나입니다. 인간 DS 태아 연구는 뇌 무게와 부피의 감소, 뉴런 감소, 성상 세포 증가 3,4 및 레이어 II 및 IV 층 뉴런의 비정상적인 분포 5,6를 보여줍니다. 또한, 피질 발달의 두 번째 단계, 즉 적층(lamination)의 출현은 DS7에서 지연되고 무질서합니다.

DS의 신경 발달 결함은 주로 Ts65Dn, Ts1Rhr 및 Ts1cje8과 같은 DS의 마우스 모델을 사용하여 연구되었습니다. 그러나 이러한 마우스 모델은 마우스와 인간 간의 생리학적 및 발달적 차이로 인해 DS 연구에서 관찰된 다양한 표현형을 완전히 요약할 수 없었고9, 이는 임상 시험10 실패로 이어졌습니다. 유도 만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell)11,12의 발명은 DS를 가진 개인으로부터 직접 유래한 세포를 사용하여 다운 증후군 신경 장애를 모델링할 수 있는 기회를 제공했습니다. 그러나 인간 iPSC를 사용하여 DS 신경 발달 결함을 모델링하려는 초기 시도는 일관성 없는 결과를 얻었고 DS 태아 뇌 섹션 13,14,15,16에서 관찰된 신경 발달 결함을 완전히 설명할 수 없었습니다. 예를 들어, Shi 등에서 발표한 한 보고서에서는 DS와 관련된 알츠하이머병 표현형을 발견했지만 유배체 대조군과 비교했을 때 DS 신경발생에는 차이가 없다고 보고했다15. 마찬가지로, Weick 등은 유배체 대조군에 비해 DS에서 시냅스 활성은 감소했지만 정상적인 신경 발생을 보고했다16. 그러나, 이러한 출판물에 보고된 DS의 정상적인 신경발생은 DS 태아의 뇌 절편에서 관찰된 것과 일치하지 않았다. 나중에, Hibaoui 등의 보고에 따르면 DS의 신경발생이 감소했다고 보고했는데, 이는 DS 태아의 뇌 섹션14에서 관찰된 것과 일치했다. 그러나 이 보고서와 또 다른 최근 보고서는 DS14,17의 신경 발생 감소의 원인으로 DS NPC의 증식 감소를 설명했습니다. 그러나 DS NPC의 증식 감소만으로는 DS 태아의 뇌 발달 과정에서 성상아교세포의 증가와 적층의 지연된 출현을 설명할 수 없었다.

최근 발표된 연구에서는 신경 발생 감소를 보여주는 인간 iPSC 기반 DS 손상 신경 발생 모델이 개발되었습니다. 이 모델은 DS의 손상된 신경 발생이 신경인성 단계(만능 줄기 세포에서 신경 전구 세포가 생성되는 단계) 동안의 이위상 세포주기 결함으로 인한 것임을 발견했습니다. 신경인성 단계의 첫 번째 단계에서 DS NPC는 동인성 유배체 신경 세포에 비해 증식이 감소한 후 신경인성 단계 후기 단계에서 동인성 유배체 세포에 비해 DS NPC의 증식이 증가했습니다18.

이 원고에서는 다운 증후군 hiPSC와 동인성 유배성 hiPSC를 피질 뉴런으로 분화하기 위한 단계별 세부 프로토콜이 설명되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 DS와 관련된 신경 발생 결함을 모델링하는 데 중점을 두고 한 쌍의 DS hiPSC와 동인성 유배체 hiPSC를 피질 뉴런으로 구별하기 위한 상세한 단계별 프로토콜을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜은 DS 손상 신경 발생을 유발하는 기저에 있는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하기 위한 강력하고 재현 가능한 시스템을 제공하도록 설계되었습니다.

이 프로토콜의 개발의 근거는 발달 신경생물학의 원리를 활용하여 만능 줄기세포를 피질 뉴런으로 분화할 수 있도록 하여 질병/장애로 인해 발생하는 표현형을 식별할 수 있도록 하는 것입니다. 이 연구는 Ca++ 채널 또는 NOTCH 경로의 결함으로 인해 발생하는 질병 표현형을 각각 가릴 수 있는 cAMP 또는 DAPT와 같은 화합물을 피함으로써 iPSC의 신경 분화에 대한 최소한의 접근 방식을 취하는 것을 목표로 했습니다. 마찬가지로, 아스코르브산(Ascorbic acid), BDNF 및 GDNF의 사용도 피했는데, 이는 신경 발생을 강화하여 다른 신경 질환 관련 표현형을 가릴 수 있습니다.

대체 방법에 비해 이 기술의 장점은 DS 태아 뇌 절편에서 관찰되는 신경학적 표현형을 강력하게 재현한다는 데 있습니다. 주목할 점은 마우스 모델과 비교했을 때, 인간 iPSC 기반 시스템은 종 간 차이를 제거하여 인간 특이적 신경 발달 과정을 연구하는 데 더 관련성 있는 모델을 제공하지만9 지금까지 DS 태아 단계에서 관찰된 DS 손상된 신경 발생을 재현하지 못했습니다. 또한, hiPSC의 동종 쌍을 사용하면 변동성을 줄이고 관찰된 표현형 차이의 신뢰성을 높일 수 있습니다. 이 프로토콜은 신경 발달 장애와 인간 신경 발생을 연구하는 연구자들에게 특히 흥미로울 것입니다. 특히 DS의 인간 특이적 측면을 모델링하려는 사람들 또는 21번 삼염색체증과 관련된 신경 발생 결함을 표적으로 하는 치료 개입을 개발하는 데 관심이 있는 사람들과 관련이 있습니다.

프로토콜

다음 프로토콜에 따라 두 쌍의 다운 증후군과 동종 유배체 인간 iPSC를 사용했습니다. 한 쌍은 재프로그래밍(reprogramming) 19의 레트로바이러스 매개 전달 방법을 사용하여 생성되었고, 두 번째 쌍(NSi003-A 및 NSi003-B)은 비통합형 센다이 바이러스 전달 방법(20)을 사용하여 생성되었다. 프로토콜은 크게 신경인성 단계(1단계)와 신경 분화 단계(2단계)의 두 단계로 구성됩니다. 또한, 다운 증후군과 동종 유배체 세포주의 증식의 차이에 기초한 두 단계, 즉 초기 단계와 후기 단계가 신경인성 단계에서 관찰됩니다. 이 연구에 사용된 시약, 배지 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 다운 증후군 hiPSC 및 동인성 유배성 hiPSC 배양 및 유지

  1. hiPSC용 피더 도금
    참고: 공급액의 품질과 밀도는 우수한 품질의 인간 iPSC 배양에 매우 중요합니다.
    1. 0.1% 젤라틴 2mL를 추가하여 37°C에서 최소 1-2시간 동안 6웰 플레이트를 코팅한 후 feeder cell로 seeding합니다.
    2. 젤라틴으로 코팅된 플레이트를 세포 배양 후드의 실온에서 세포를 도금하기 전에 최소 30분 동안 보관하십시오.
    3. 비드 배스/수조에서 부활을 위해 사용되는 따뜻한 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 배지.
    4. 5mL의 MEF 매체를 15mL 원심분리 튜브에 분취합니다.
    5. 액체 질소 탱크(LN2 탱크)에서 피더 셀이 담긴 바이알을 꺼냅니다.
      참고: 공급세포는 E13.5 마우스 배아 섬유아세포를 10μg/mL 미토마이신 C로 3시간 동안 처리한 후 DPBS18로 2-3회 세척하여 유도되었습니다. 피더 셀은 직접 사용하거나 나중에 사용할 수 있도록 LN2 탱크에서 동결할 수 있습니다. 모든 마우스는 기관 동물 윤리 위원회(Institutional Animal Ethics Committee)의 승인을 받은 후 사용되었습니다.
    6. 작은 얼음 조각이 남을 때까지 플로팅 랙을 사용하여 바이알을 수조에서 37°C로 유지합니다.
    7. 바이오안전성 캐비닛 안에 있는 바이알을 가지고 알코올로 살균한 후 생물안전성 캐비닛에 넣으십시오.
    8. 1mL의 따뜻한 MEF 미디어( 재료 표 참조)를 한 방울씩 추가합니다.
    9. 바이알에서 배지를 부드럽게 꺼내고 MEF 배지가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브에 한 방울씩 떨어뜨립니다.
    10. 실온에서 200 x g에서 5분간 원심분리기.
    11. 진공 흡입 시스템(VAS)을 사용하여 상층액을 흡입합니다.
    12. MEF 배지 1mL를 넣고 위아래로 3-4회 부드럽게 피펫팅합니다.
    13. 혈구계를 사용하여 세포 수를 측정합니다. 죽은 세포는 Trypan Blue를 사용하여 배제했습니다.
    14. 플레이트 3.1-3.3 x 10 6웰 플레이트의 웰당5 개의 라이브 피더 셀 또는 MEF 배지의 6웰 플레이트당 2 x 106 개의 셀.
    15. CO2 인큐베이터 내부의 플레이트를 37°C, 습도 85%로 밤새 유지하십시오. CO2 인큐베이터 내부의 플레이트를 앞뒤 및 옆으로 2-3회 흔들어 피더 세포의 균일한 분포를 얻습니다.
  2. 다운 증후군 hiPSC와 동인성 유배성 hiPSC의 부활
    참고: 37°C 비드 수조에서 필요한 양의 hiPSC 배지를 가열합니다.
    인간 유도 만능 줄기세포(hiPSC) 부활 배지: hiPSC 배지에 25ng/mL 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 10μM 암석 억제제(RI)(Y-27632 2HCl)를 새로 첨가합니다.
    1. 피더 웰에서 MEF 매체를 제거하고 웰 측면에서 따뜻한 DMEM/F12 1mL를 부드럽게 추가하여 피더를 한 번 세척합니다. 배지를 흡입하고 2mL/웰 따뜻한 hiPSC 리바이벌 배지를 추가합니다. hiPSC를 도금하기 전에 플레이트를 인큐베이터 내부에 최소 2시간 동안 그대로 두십시오.
    2. hiPSC가 든 바이알을 꺼냅니다.
    3. 작은 얼음 조각이 남을 때까지 37°C 수조의 플로팅 랙에 바이알을 보관하십시오.
    4. 바이알을 생물 안전 캐비닛 안으로 넣기 전에 70% 알코올로 소독하십시오.
    5. 따뜻한 hiPSC 리바이벌 배지 1mL를 추가합니다.
    6. 바이알에서 배지를 부드럽게 꺼내고 5mL의 hiPSC 부활 배지가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브에 한 방울씩 붓습니다.
    7. 실온에서 100 x g에서 2분간 원심분리기.
    8. VAS를 사용하여 상층액을 흡입하고 튜브를 부드럽게 두드려 펠릿을 제거합니다.
    9. 500μL의 hiPSC 배지와 10μM의 RI를 붓고 hiPSC 리바이벌 배지가 들어 있는 피더 플레이트 위에 붓습니다. 플레이트에 세포 이름, 통과 번호, 연구자 이름 및 날짜를 표시합니다.
    10. 4배 배율로 도립 현미경으로 hiPSC 집락을 관찰합니다. 세포 덩어리가 있어야 합니다.
    11. 플레이트를 CO2 인큐베이터 내부에 유지하면서 플레이트를 앞뒤 및 옆으로 2-3회 흔들어 세포의 균일한 분포를 달성합니다. 24시간 동안 접시를 방해하지 마십시오.
    12. 다음 날, 일부 군체는 모이통에 부착된 것처럼 보일 수 있고 일부는 떠 있을 수 있습니다. 배지를 흡입하지 않고 25ng/mL bFGF 및 10μM의 RI가 보충된 새로운 hiPSC 배지를 추가합니다.
    13. 부흥 후 이틀째 되는 날, 대부분의 식민지가 지표면에 붙어있을 것이다. 완전 배지를 25ng/mL bFGF의 hiPSC 배지로 변경합니다. 다음 날에는 hiPSC 집락을 볼 수 있습니다.
      참고: hiPSC가 되살아나서 매끄럽고 잘 정의된 경계, 균일한 세포 형태 및 조밀한 집락 중심을 가진 집락을 만드는 데 최소 일주일이 걸립니다.
  3. 사료 공급원의 패시징 다운 증후군 hiPSC 및 동인성 유배체 hiPSC
    알림: 모든 시약은 시작하기 전에 따뜻해야 합니다. 세포의 과도한 피펫팅을 피플링하지 마십시오. 셀을 매우 부드럽게 다루십시오.
    1. 통과 hiPSC는 대부분의 군체가 서로 합쳐지기 시작하거나 너무 많은 분화된 군체가 출현할 때 발생합니다. 일반적으로 분할은 첫 번째 통과 후 5-7일 이내에 수행해야 합니다.
    2. 쪼개지기 하루 전에 모이통 바이알을 되살립니다.
    3. 1mL/웰의 따뜻한 DMEM/F12로 피더를 1회 세척하고 25ng/mL bFGF가 보충된 2mL/웰의 따뜻한 hiPSC 배지를 추가합니다. hiPSC를 도금하기 전에 CO2 인큐베이터 내부의 플레이트를 37°C에서 최소 2시간 동안 그대로 두십시오.
    4. 분화된 집락에 대해 hiPSC가 있는 플레이트를 관찰하고 실체 현미경으로 200μL 피펫을 사용하여 스크랩하여 분화된 집락을 제거합니다.
    5. 1mL/잘 데운 DMEM/F12로 hiPSC를 한 번 세척합니다.
    6. 1mg/ml 콜라겐분해효소 용액 1mL/웰을 붓습니다. 플레이트를 인큐베이터 내부에 8-10분 동안 보관한 다음 도립 현미경으로 군체의 느슨한 가장자리를 관찰합니다.
    7. 콜라겐분해효소를 흡입하고 DMEM/F12를 2회 세척합니다. 그런 다음 1mL/웰 hiPSC 배지를 추가합니다.
    8. 2mL 주사기 끝을 사용하여 웰에서 콜로니를 수평 및 수직으로 8-10회 부드럽게 자릅니다. 도립 현미경으로 군체를 관찰하여 대부분의 군체가 적절한 크기로 절단되었는지 확인하십시오.
    9. 집락이 충분히 절단되면 세포 리프터를 사용하여 집락을 부드럽게 들어 올립니다.
    10. 군집의 크기에 따라 1mL 팁을 사용하여 5-8회 웰의 군체를 부드럽게 피펫팅합니다.
    11. 모든 세포를 15mL 원심분리 튜브에 모으고 실온에서 100 x g으로 2분 동안 원심분리합니다.
    12. 피펫을 사용하여 상층액을 부드럽게 흡인하고, 튜브를 가볍게 두드려 세포 펠릿을 제거하고, 25ng/mL bFGF 및 10μM RI와 함께 200μL의 hiPSC 배지를 추가합니다. 200 μL 피펫으로 2-3회 피펫팅하고 25 ng/mL bFGF 및 10 μM RI로 300 μL 더 많은 hiPSC 배지를 첨가합니다.
    13. 이제 hiPSC 배지 + 25ng/mL bFGF를 함유한 공급체 위에 이 세포를 부드럽게 플레이트팅합니다. 하나의 웰은 분화된 콜로니를 제거한 후 존재하는 콜로니의 수에 따라 1:2 또는 1:3으로 분할할 수 있습니다. 플레이트에 세포 이름, 통과 번호, 연구자 이름 및 날짜를 표시합니다.
    14. 플레이트를 CO2 인큐베이터 내부에 유지하면서 플레이트를 앞뒤 및 옆으로 2-3회 흔들어 세포의 균일한 분포를 달성합니다.
    15. 다음 날, 따뜻한 DMEM/F12로 한 번 부드럽게 세척하고 25ng/mL bFGF와 함께 2.5mL의 hiPSC 배지를 추가합니다.
  4. 급식세포에서 동결 증후군 hiPSC 및 동인성 유배체성 hiPSC
    참고: 냉동 절차 중에는 human iPSC의 과도한 피펫팅을 피해야 합니다.
    1. hiPSC는 아직 로그 단계(log phase)에 있을 때, 즉 통과 후 4-5일이 지났을 때 분리합니다.
    2. 분화된 집락에 대해 hiPSC가 있는 플레이트를 관찰하고 실체현미경으로 200μL 피펫을 사용하여 분화된 집락을 제거합니다.
    3. 1mL/잘 데운 DMEM/F12로 hiPSC를 한 번 세척합니다.
    4. 1mg/mL 콜라겐분해효소 용액 1mL/웰을 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터 내부에 8-10분 동안 보관한 다음 도립 현미경으로 군집의 가장자리를 들어 올리는지 관찰합니다.
    5. 콜라겐분해효소를 흡입하고 DMEM/F12를 2회 세척합니다. 그런 다음 1mL/웰 hiPSC 배지를 추가합니다.
    6. 세포 리프터를 사용하여 집락을 부드럽게 들어 올립니다.
    7. 집락의 크기에 따라 1mL 팁을 사용하여 웰의 집락을 5-8회 부드럽게 피펫팅합니다.
    8. 모든 세포를 15mL 원심분리 튜브에 모으고 실온에서 100 x g으로 2분 동안 원심분리합니다.
    9. 피펫을 사용하여 상층액을 부드럽게 흡인하고, 튜브를 부드럽게 두드려 세포 펠릿을 제거하고, 웰 수에 따라 25ng/mL bFGF가 보충된 항생제 없이 1mL의 hiPSC 배지를 추가합니다. 세포를 cryovials로 분배합니다.
    10. 항생제가 첨가되지 않은 hiPSC 배지에 25ng/mL bFGF 및 20% DMSO를 극저온판에 첨가하여 10%의 DMSO 최종 농도를 달성합니다.
    11. 천천히 얼기 위해 이소프로판올 욕조가 있는 서리가 내린 곳에 냉동 식품을 넣으십시오.
    12. 밤새 -80 °C에서 서리가 내립니다. 다음날 바이알을 LN2 탱크로 옮깁니다.

2. 신경 분화

참고: 피더 컨디셔닝 배지(FCM) 준비: T-75 플라스크를 사용하고 플라스크당 4 x 106 피더 셀을 플레이트합니다. 다음날 4ng/mL bFGF와 함께 hiPSC 배지 40mL를 추가합니다. 7일 동안 수집합니다. 매일 튜브를 -20°C에서 최대 1개월 동안 보관하십시오. 세포를 해리하기 전에 15cm 접시에 0.1% 젤라틴 10mL를 37°C에서 최소 2시간 동안 코팅합니다. 세포를 해리하기 1일 전에 hESC 인증 기저막 매트릭스(이하 "적격 매트릭스"라고 함)로 6웰 플레이트를 코팅합니다. 전체 프로토콜에서 세포를 해리할 때 세포 분리 용액( Table of Materials(Table of Materials) 참조), DPBS 및 도금 배지(25ng/mL bFGF가 보충된 FCM)에 10μM의 RI를 추가합니다. 모든 차별화를 위해 새로운 피더 컨디셔닝 배지(FCM)를 준비합니다. hiPSC의 과도한 피펫팅을 피우지 마십시오.

  1. Day In vitro (DIV) 2: 신경 분화를 위한 단일 세포 제작 및 hiPSC 파종
    1. 25ng/mL bFGF, DPBS, 세포 분리 용액이 보충된 hiPSC 배지 및 25ng/mL bFGF가 보충된 Feeder Conditioned Medium에 10μM의 RI를 추가합니다. 이 모든 시약을 37°C에서 가열합니다.
    2. 공급체에 6웰 플레이트의 iPSC를 취하여 분화된 콜로니를 제거하고 25ng/mL bFGF 및 10μM의 RI가 보충된 새로운 hiPSC 배지를 추가합니다. 플레이트를 인큐베이터에서 2시간 동안 보관하십시오.
    3. 2시간 후 iPSC 플레이트를 꺼내고 Ca++ 및 Mg++가 없는 DPBS로 한 번 세척합니다.
    4. 1mL/웰 세포 분리 용액(+ 10μM RI)을 추가하고 플레이트를 CO2 인큐베이터 내부에 12-14분 동안 보관합니다.
    5. 12-14분 후 도립 현미경으로 세포를 관찰합니다. 대부분의 세포가 플레이트에서 분리되기 시작합니다. 일부 세포가 여전히 부착되어 있으면 측면에서 플레이트를 부드럽게 두드립니다.
    6. 3mL/well DPBS와 Ca++ 및 Mg++ (+ 10μM의 RI)를 첨가하여 세포 분리 용액을 희석합니다. 5mL 피펫을 사용하여 2-3회 부드럽게 피펫팅을 수행하여 기포가 뭉치지 않도록 합니다.
    7. 40μM 스트레이너를 통해 세포를 통과시킵니다.
    8. 세포를 50mL 원심분리 튜브에 모읍니다.
    9. 실온에서 200 x g 에서 5분 동안 원심분리기를 원심분리하고 VAS를 사용하여 매체를 부드럽게 흡인합니다.
    10. 10mL의 hiPSC 배지(+ 25ng/mL bFGF + 10μM의 RI)에 세포를 재현탁합니다. 0.1% 젤라틴 코팅된 15cm 접시에 세포를 1.5시간 동안 첨가하여 공급체가 hiPSC에 비해 젤라틴 코팅 표면에 우선적으로 접착되기 때문에 공급체를 제거합니다.
    11. 1.5시간 후, 세포와 함께 배지를 부드럽게 수집하고 실온에서 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. VAS를 사용하여 미디어를 흡입합니다.
    12. 1mL의 FCM(+ 25ng/mL bFGF + 10μM의 RI)에 세포를 재현탁하고 세포 수를 측정합니다.
    13. FCM(+ 25ng/mL bFGF + 10μM RI)을 사용하여 30,000-50,000 cells/mL의 세포 현탁액과 5mL 세포 현탁액/60mm 플레이트를 시드하거나 6-well 플레이트의 2mL/웰 또는 24-웰 플레이트의 500 μL/웰을 만듭니다. 플레이트는 적격 매트릭스로 코팅해야 합니다( 재료 표 참조).
  2. DIV 0: (~48시간 후): 피더 컨디셔닝 배지를 NPC 매체(비타민 A + N2가 없는 DDM + B27)로 변경합니다( 재료 표 참조).
  3. DIV 2 : DIV 18까지 격일로 0.125 μM의 Dorsomorphin이 함유 된 NPC 매체를 추가합니다.
  4. DIV 18: Dorsomorphin이 없는 NPC 미디어를 추가하고 DIV 28까지 격일로 보충합니다.
  5. DIV 28-30: 2단계를 위한 단세포 제작 및 NPC 파종
    1. DIV 28에서 플레이트(NPC 포함)를 꺼내고 매체를 NPC 매체(+ 10μM RI)로 교체합니다. 플레이트를 CO2 인큐베이터에 2시간 동안 넣습니다.
    2. 2시간 후 미디어를 흡인하고 DPBS(Ca++ 및 Mg++ 제외)로 한 번 세척합니다.
    3. 1mL/웰 세포 분리 용액(+ 10μM RI)을 추가하고 플레이트를 14분 동안 인큐베이터 내부에 보관합니다.
    4. 14분 후 도립 현미경으로 세포를 4x로 관찰합니다. 대부분의 세포가 플레이트에서 분리되기 시작합니다. 일부 세포가 여전히 부착되어 있으면 측면에서 플레이트를 부드럽게 두드립니다.
    5. 3mL/웰 DPBS와 Ca++ 및 Mg++ (+ 10μM의 RI)를 첨가하여 세포 분리 용액을 희석합니다. 5mL 피펫을 사용하여 2-3회 부드럽게 피펫팅을 수행하여 기포가 뭉치지 않도록 합니다.
    6. 50mL 원심분리 튜브에 놓인 40μM 스트레이너를 통과시킵니다.
    7. 실온에서 200 x g에서 5분간 원심분리기. VAS를 사용하여 미디어를 부드럽게 흡입합니다.
    8. DDM + B27의 세포를 비타민 A (+ 10 μM의 RI)로 재현탁시킵니다.
    9. 혈구계(hemocyometer)와 함께 트리판 블루(trypan blue)를 사용하여 살아있는 세포를 계수합니다.
    10. 50,000개의 세포/웰을 48웰 플레이트의 검증된 매트릭스 코팅 플레이트(1x)에 파딩합니다.
  6. DIV 33: 매체를 신경 분화 매체로 변경(재료 표 참조). 5일마다 매체를 교체하십시오. DIV 85/90까지 미디어를 계속 보충합니다.

3. 면역세포화학(ICC)

알림: 모든 단계에서 충분한 완충액을 추가하십시오.tages는 세포를 덮고 세척 단계에서 흡인하는 동안 우물이 건조되지 않도록 합니다.

  1. 세포 배양 영역 밖에서 분화된 세포판을 꺼냅니다.
  2. 미디어를 흡입하고 DPBS 세척을 제공합니다.
  3. 고정을 위해 1mL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 세포에 첨가합니다. 접시를 알루미늄 호일로 덮고 37°C의 로커 셰이커에 30분 동안 놓습니다.
  4. PFA를 흡입하고 DPBS(Ca++ 및 Mg++ 제외)로 각각 15분씩 3회 세척합니다.
  5. 실온에서 1시간 동안 차단 완충액(3% BSA + 5% 당나귀 혈청(또는 2차 항체 숙주 동물의 혈청) + DPBS 중 0.2% Triton-X)을 추가합니다.
  6. 250 μL/well의 1차 항체[Ki67 (1:100 희석), TUBB3 (1:500 희석), PAX6 (1:100)]를 추가하고 4 °C에서 로커 쉐이커에서 밤새 배양합니다. 희석은 차단 용액에서 수행되었습니다.
  7. 1차 항체 배양 후 DPBS로 3회 세척합니다.
  8. 실온에서 1시간 동안 250μL/well의 2차 항체(3% BSA + 0.2% Triton-X에 희석된 1:250)를 추가합니다.
  9. 2차 항체 배양 후 DPBS로 3회 세척합니다.
  10. 실온에서 15분 동안 DAPI(DPBS에 5mg/mL 스톡을 1:1000 희석)를 추가합니다. DPBS로 세 번 세탁하십시오. 배양 플레이트에 마지막 세척을 남겨두고 현미경으로 관찰하십시오.

4. 이미지 획득 및 분석

  1. 20x 해상도의 형광 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.
  2. 540nm의 excitation filter를 사용한 TUBB3 staining 이미지, 488nm의 excitation filter를 사용한 PAX6, 358nm의 excitation filter를 사용한 DAPI 이미지뿐만 아니라 Ki67의 이미지를 캡처합니다.
  3. 분석을 위해 10개의 서로 다른 무작위 필드에서 이미지를 캡처합니다.
  4. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 ICC 이미지를 분석합니다.
  5. TUBB3 및 PAX6 분석의 경우 각각 빨간색 및 녹색 신호에 대해 모든 이미지의 임계값을 수행하고 DAPI에 대해 파란색 신호 강도를 수행합니다. TUBB3의 적색 픽셀과 PAX6의 녹색 픽셀의 평균 강도는 DAPI의 청색 픽셀의 평균 강도로 정규화되었습니다.
  6. Ki67 분석의 경우 ImageJ 소프트웨어의 자동화된 세포 계수기 기능을 사용하여 세포를 계수합니다. Ki67 양성 세포의 수를 DAPI 양성 세포의 수로 정규화합니다.
  7. 통계와 그래프 작성 소프트웨어를 사용하여 쌍체를 이루지 않은 t-검정을 사용하여 두 그룹을 비교함으로써 통계 분석을 수행합니다. 데이터는 3개의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± SEM으로 표현되어야 합니다. p-값이 0.05 미만이면 통계적으로 유의한 것으로 간주됩니다.

결과

단일화된 인간 iPSC를 단일 세포 현탁액으로 적격한 매트릭스 코팅 접시에 파종하고 bFGF를 제거하여 분화를 시작했습니다. 비외배엽 분화를 억제하기 위해, DIV 2-18에서 BMP 신호억제제인 도르소모르핀(Dorsomorphin)을 첨가하였다21. 신경인성 단계에서 전구 세포를 추가로 분화하기 위해, 초기 신경 분화를 관찰하기 위해 추가 6-10주 동안 적격 매트릭스(

토론

이 연구에서는 Euploid hiPSC와 DS hiPSC의 동종 쌍에 대한 효율적인 비방향성 단층 피질 신경 분화 프로토콜이 설명됩니다. 세포는 단층으로 성장하기 때문에 배양 조건에 더 많이 노출되며, 이는 다른 프로토콜에서 일반적으로 사용되는 iPSC를 구별하기 위해 배아체를 사용하는 것과 동일한 정도로 불가능합니다14,16. 오가노이드 시?...

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

저자는 한 쌍의 다운 증후군과 동종 유배성 hiPSC를 제공해 주신 Stuart H. Orkin 교수에게 감사드립니다. 저자들은 또한 이 연구를 수행할 수 있도록 자금을 제공한 푸네의 국립세포과학센터(BRIC-NCCS)에 감사를 표합니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
MEF medium:
DMEM High GlucoseGibco11965-092
FBSVWR97068-08510% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-MercaptoethanolGibco21985-0231X final concentration
hiPSC medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Knockout Serum Replacement (KOSR)Gibco10828-02820% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-Mercaptoethanol (1000X)Gibco21985-0231X final concentration
DDM medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
Albumax (10%)Invitrogen 11020-0210.5 X of 10% Albumax is final concentration
NPC medium:
DDM medium
N2 SupplementGibco 175020481X final concentration
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AGibco 125870101X final concentration
Neural Differentiation medium (ND):
DDM medium1/2 of volume
Neurobasal MediumGibco 21103-0491/2 of volume
N2 SupplementGibco 175020480.5 X final concentration
B-27 Supplement (50X)Gibco 175040440.5 X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X of Neurobasal medium
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X of Neurobasal medium
Antibodies and reagents for immunostaining:
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G4%
DPBS, no calcium, no magnesiumSigma-AldrichD5652
Triton-X-100 SolutionSigma-AldrichX100-500ML0.20%
BSAHycloneA7979-50ML1.00%
Purified anti-tubulin β-3 (TUBB3) (TUJ1)BioLegend8012021:500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa fluor 594 conjugateLife Tech Invitrogen A212031:250 dilution
Purified Mouse-Anti-Human Ki67BD Pharmingen5506091:100 dilution
Purified anti-PAX6BioLegends9013021:100 dilution
Alexa fluor 488 Donkey (anti-rabbit)Life Tech Invitrogen A212061:250 dilution
DAPI Solution (5 mg/mL)SigmaD95421:1000 dilution
Others
Cell detachment solution (Accutase) Gibco A11105-01Ready to use working solution
Rock inhibitor (RI) Sellechckem Y2763210 mM/ml final concentration
Dorsomorphin Sellechckem S73060.125 nM/ml final concentration
DPBS with calcium and magnisium (DPBS+ Ca, Mg)Gibco 14040133Ready to use working solution
DPBS without calcium and magnisiumGibco 14190136Ready to use working solution
Gelatin Type ASigma G2500-100G0.10%
hESC-qualified basement membrane matrix (Matrigel GFR) Corning 3562301 mg stock vial diluted 1:240
Trypsin 0.05%Gibco25300054
Trypan BlueGibco15250-0610.40%
Basic Fibrablast Growth Factor (bFGF)Peprotech 100-18B25 ng/ml final concentration
Collagenase Gibco 17104-0191mg/ml final concentration

참고문헌

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