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摘要

该协议概述了一种使用 DS 人类 iPSC 概括唐氏综合症 （DS） 受损神经发生的方法。该方案确定双相细胞周期缺陷是唐氏综合征神经发生受损的原因。它为了解与 DS 相关的异常神经发生背后的细胞和分子机制提供了一个强大的平台。

摘要

唐氏综合症 （DS） 是由 21 号染色体的额外副本引起的，是导致智力残疾的主要原因。导致这种智力障碍的关键因素之一是从胎儿阶段开始观察到的神经发生受损。为了研究这些神经发育异常，使用从 DS 患者获得的细胞产生的人诱导多能干细胞 （hiPSC） 提供了一个有价值且相关的模型。在这里，描述了一种全面的方案，用于概括在 DS 胎儿阶段观察到的 DS 受损神经发生。该方案利用一对具有三个 21 号染色体拷贝的 DS-hiPSC 及其具有两个 21 号染色体拷贝的同基因整倍体 hiPSC。重要的是，这里描述的方案概括了 DS 受损的神经发生，并发现双相细胞周期缺陷，即在神经源性阶段的早期阶段 DS 神经祖细胞 （NPC） 的增殖减少，随后在神经源性阶段的后期 DS NPC 的增殖增加是 DS 受损神经发生的原因。在神经源性阶段的后期，DS NPC 的增殖增加导致细胞周期的延迟退出，导致 DS NPC 有丝分裂后神经元的产生减少。该方案包括维持 hiPSC 的详细步骤，它们在神经源性阶段分化为显示双相细胞周期缺陷的神经谱系，以及随后验证 DS 细胞中神经分化减少。通过遵循这种方法，研究人员可以创建一个强大的实验系统，模拟 DS 的神经发育条件，使他们能够探索由 21 三体综合征引起的大脑发育的特定变化。

引言

唐氏综合症 （DS） 或 21 三体综合征是最常见的染色体异常，也是导致智力障碍 （ID） 的主要原因1。DS 胎儿发育过程中的神经发生受损是 DS2 智力障碍的原因之一。人类 DS 胎儿研究表明，大脑重量和体积减少，神经元减少，星形胶质细胞增加 3,4，以及神经元在 II 层和 IV 层的异常分布 5,6。此外，皮质发育的第二阶段，即层状的出现，在 DS7 中既延迟又杂乱无章。

DS 中的神经发育缺陷主要使用 DS 小鼠模型（如 Ts65Dn、Ts1Rhr 和 Ts1cje8）进行研究。然而，由于小鼠和人类之间的生理和发育差异，这些小鼠模型无法完全概括在 DS 研究中观察到的各种表型9，这导致临床试验失败10。诱导多能干细胞11,12 的发明为使用直接来源于 DS 个体的细胞模拟唐氏综合征神经功能障碍提供了机会。然而，早期使用人类 iPSC 建模 DS 神经发育缺陷的尝试遇到了不一致的结果，并且无法完全解释在 DS 胎儿脑切片13、14、15、16 中观察到的神经发育缺陷。例如，Shi 等人发表的一份报告发现了与 DS 相关的阿尔茨海默病表型，但报告与整倍体对照相比，DS 神经发生没有差异15。同样，Weick 等人报道，与整倍体对照相比，DS 的突触活动降低，但神经发生正常16。然而，这些出版物中报道的 DS 的正常神经发生与 DS 胎儿脑切片的观察不一致。后来，Hibaoui 等人的一份报告报道了 DS 的神经发生减少，这与 DS 胎儿脑切片14 的观察结果一致。然而，这份报告和最近的另一份报告将 DS NPC 增殖减少描述为 DS 神经发生减少的原因14,17。然而，仅 DS NPC 增殖的减少并不能解释 DS 胎儿大脑发育过程中星形胶质细胞增加和层粘连出现延迟。

在最近发表的工作中，开发了一种基于人类 iPSC 的 DS 受损神经发生模型，显示神经发生减少。该模型发现 DS 中神经发生受损是由于神经源性阶段（从多能干细胞产生神经祖细胞的阶段）的双相细胞周期缺陷。在神经源性阶段的第一阶段，与同基因整倍体神经细胞相比，DS NPC 的增殖减少，其次在神经源性阶段18 的后期，与同基因整倍体细胞相比，DS NPC 的增殖增加。

在本手稿中，描述了将唐氏综合征 hiPSC 及其同基因整倍体 hiPSC 分化为皮质神经元的分步详细方案。该方法的总体目标是提供一个详细的分步方案，用于将一对 DS hiPSC 及其同基因整倍体 hiPSC 分化为皮质神经元，重点是模拟与 DS 相关的神经发生缺陷。该协议旨在提供一个强大且可重复的系统，用于研究导致 DS 受损神经发生异常的细胞和分子机制。

开发该方案的基本原理是利用发育神经生物学原理将多能干细胞分化为皮层神经元，从而允许识别由于疾病/障碍而产生的表型。它旨在通过避免使用 cAMP 或 DAPT 等化合物来采用一种极简的方法对 iPSC 的神经分化，这些化合物可能分别掩盖由于 Ca++ 通道或 NOTCH 通路缺陷而引起的疾病表型。同样，也避免了抗坏血酸、 BDNF 和 GDNF 的使用，这可能会通过增强神经发生来掩盖其他神经系统疾病相关的表型。

与其他方法相比，该技术的优势在于提供在 DS 胎儿脑切片中观察到的神经表型的稳健概括。值得注意的是，与小鼠模型相比，基于人类 iPSC 的系统消除了跨物种差异，为研究人类特异性神经发育过程提供了更相关的模型9 但到目前为止，未能概括在 DS 胎儿阶段观察到的 DS 受损神经发生。此外，使用 hiPSCs 的同基因对可降低变异性并提高观察到的表型差异的可靠性。研究神经发育障碍和人类神经发生的研究人员将特别感兴趣该协议。对于那些寻求模拟 DS 的人类特异性方面或对开发针对与 21 三体相关的神经发生缺陷的治疗干预措施感兴趣的人尤其相关。

研究方案

遵循以下方案，处理两对唐氏综合征及其同基因整倍体人 iPSC。使用逆转录病毒介导的重编程递送方法产生一对19， 使用非整合仙台病毒递送方法20 产生第二对 （NSi003-A 和 NSi003-B）。该方案大致包括两个阶段：神经源性阶段（第 1 阶段）和神经分化阶段（第 2 阶段）。此外，在神经源性阶段观察到基于唐氏综合征和同基因整倍体细胞系增殖差异的两个阶段，即早期和晚期。本研究中使用的试剂、培养基和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 唐氏综合症 hiPSC 和同基因整倍体 hiPSCs 培养和维持

  1. hiPSC 的饲养层铺板
    注：饲养层质量和密度对于人 iPSC 培养的良好质量极为重要。
    1. 加入 2 mL 0.1% 明胶，在 37 °C 下在 6 孔板包被至少 1-2 小时，然后用饲养细胞接种。
    2. 在铺板细胞之前，将明胶包被的板在室温下保存在细胞培养罩中至少 30 分钟。
    3. 温热的小鼠胚胎成纤维细胞 （MEF） 培养基，用于微珠浴/水浴中的复苏。
    4. 将 5 mL MEF 培养基分装到 15 mL 离心管中。
    5. 从液氮罐（LN2 罐）中取出一小瓶饲养层细胞。
      注：饲养细胞是通过用 10 μg/mL 丝裂霉素 C 处理 E13.5 小鼠胚胎成纤维细胞 3 小时，然后用 DPBS18 洗涤 2-3 次来获得的。饲养层电池可以直接使用，也可以在 LN2 槽中冷冻以备将来使用。所有小鼠均在机构动物伦理委员会批准后使用。
    6. 使用浮动架将样品瓶保持在 37 °C 的水浴中，直到留下一小块冰。
    7. 将小瓶放入生物安全柜内，用酒精消毒，然后再放入生物安全柜中。
    8. 逐滴加入 1 mL 温热的 MEF 培养基（参见 材料表）。
    9. 轻轻地从样品瓶中取出培养基，然后逐滴倒入含有 MEF 培养基的 15 mL 离心管中。
    10. 在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。
    11. 使用真空吸液系统 （VAS） 吸出上清液。
    12. 加入 1 mL MEF 培养基，轻轻上下移液 3-4 次。
    13. 使用血细胞计数器进行细胞计数。使用台盼蓝排除死细胞。
    14. 在 MEF 培养基中，每 6 孔板每孔接种 3.1-3.3 x 105 个活饲养层细胞，或每 6 孔板接种 2 x 106 个细胞。
    15. 将板保存在 CO2 培养箱内，在 37 °C 和 85% 湿度下过夜。将 CO2 培养箱内的板前后和侧向摇动 2-3 次，以实现饲养层细胞的均匀分布。
  2. 唐氏综合征 hiPSC 和同基因整倍体 hiPSC 的复兴
    注：在 37 °C 微珠浴中加热所需体积的 hiPSC 培养基。
    人诱导多能干细胞 （hiPSC） 复苏培养基：在 hiPSC 培养基中新鲜添加 25 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 和 10 μM Rock 抑制剂 （RI） （Y-27632 2HCl）。
    1. 从饲养孔中取出 MEF 培养基，并从孔侧面轻轻加入 1 mL/孔的温热 DMEM/F12，对饲养孔进行一次洗涤。吸出培养基并加入 2 mL/孔温热的 hiPSC 复兴培养基。在接种 hiPSC 之前，将板留在培养箱内至少 2 小时。
    2. 取出一小瓶 hiPSC。
    3. 将样品瓶放在 37 °C 水浴中的浮动架上，直到留下一小块冰。
    4. 在将小瓶放入生物安全柜之前，请用 70% 的酒精对其进行消毒。
    5. 加入 1 mL 温热的 hiPSC 复兴培养基。
    6. 轻轻地从小瓶中取出培养基，逐滴倒入含有 5 mL hiPSCs 复苏培养基的 15 mL 离心管中。
    7. 在室温下以 100 x g 离心 2 分钟。
    8. 使用 VAS 吸出上清液，并通过轻轻敲击试管来去除沉淀。
    9. 倒入 500 μL 含 10 μM RI 的 hiPSC 培养基，倒在含有 hiPSC 复苏培养基的饲养板上。用细胞名称、传代号、研究人员姓名和日期标记板。
    10. 在倒置显微镜下以 4 倍放大倍率观察 hiPSC 集落;应该有细胞团块。
    11. 将板保持在 CO2 培养箱内的同时，前后和侧向摇动板 2-3 次，以实现细胞均匀分布。24 小时内不要打扰板。
    12. 第二天，一些菌落可能看起来粘附在饲养器上，而一些菌落会漂浮在空中。在不吸出任何培养基的情况下，加入补充有 25 ng/mL bFGF 和 10 μM RI 的新鲜 hiPSC 培养基。
    13. 在复兴后的第二天，大多数菌落将附着在表面。将完全培养基更换为含 25 ng/mL bFGF 的 hiPSC 培养基。在接下来的几天里，将可以看到 hiPSC 集落。
      注：hiPSC 至少需要一周时间才能恢复并形成具有光滑、边界明确、细胞形态均匀和密集集落中心的集落。
  3. 饲养层上的传代唐氏综合症 hiPSC 和同基因整倍体 hiPSC
    注意：在开始之前，所有试剂都应是热的。避免细胞过度移液。非常轻柔地处理细胞。
    1. 当大多数集落开始相互融合或出现过多分化集落时，传代 hiPSC。一般需要在首次传代后 5-7 天内进行分液。
    2. 在分液前一天恢复一瓶喂食器。
    3. 用 1 mL/孔的温 DMEM/F12 对饲养层进行一次洗涤，并加入 2 mL/孔的温 hiPSC 培养基，补充有 25 ng/mL bFGF。在接种 hiPSC 之前，将板放在 CO2 培养箱内于 37 °C 下至少 2 小时。
    4. 用 hiPSC 观察板中的分化菌落，并在立体显微镜下使用 200 μL 移液器刮擦去除分化的菌落。
    5. 用 1 mL/孔温热的 DMEM/F12 对 hiPSC 进行一次洗涤。
    6. 倒入 1 mL/孔的 1 mg/ml 胶原酶溶液。将板放在培养箱内 8-10 分钟，然后在倒置显微镜下观察菌落的松散边缘。
    7. 吸出胶原酶并洗涤 2 次 DMEM/F12。然后加入 1 mL/孔 hiPSC 培养基。
    8. 使用 2 mL 注射器的尖端在孔中水平和垂直轻轻切割菌落 8-10 次。在倒置显微镜下观察菌落，以检查大多数菌落是否已切割成合适的大小。
    9. 如果菌落被充分切割，则使用细胞提升器轻轻提起菌落。
    10. 使用 1 mL 吸头轻轻移液孔中的菌落，吸取 5-8 次，具体取决于菌落的大小。
    11. 将所有细胞收集到 15 mL 离心管中，并在室温下以 100 x g 离心 2 分钟。
    12. 用移液管轻轻吸出上清液，轻轻敲击试管去除细胞沉淀，并加入 200 μL 含 25 ng/mL bFGF 和 10 μM RI 的 hiPSC 培养基。用 200 μL 移液器移液 2-3 次，再添加 300 μL 含 25 ng/mL bFGF 和 10 μM RI 的 hiPSC 培养基。
    13. 现在将这些细胞轻轻地铺在含有 hiPSC 培养基 + 25 ng/mL bFGF 的饲养层上。一个孔可分为 1：2 或 1：3，具体取决于去除分化菌落后存在的菌落数量。用细胞名称、传代号、研究人员姓名和日期标记板。
    14. 将板保持在 CO2 培养箱内的同时，前后和侧向摇动板 2-3 次，以实现细胞均匀分布。
    15. 第二天，用温热的 DMEM/F12 轻轻洗涤一次，并加入 2.5 mL 含 25 ng/mL bFGF 的 hiPSC 培养基。
  4. 来自饲养层的冻结唐氏综合征 hiPSC 和同基因整倍体 hiPSC
    注意：在冷冻过程中应避免过度移液人 iPSC。
    1. 当 hiPSCs 仍处于对数期时，即传代后 4-5 天，分裂 hiPSC。
    2. 用 hiPSC 观察板中的分化集落，并在立体显微镜下使用 200 μL 移液器去除分化的集落。
    3. 用 1 mL/孔温热的 DMEM/F12 对 hiPSC 进行一次洗涤。
    4. 加入 1 mL/孔的 1 mg/mL 胶原酶溶液。将板放在培养箱内 8-10 分钟，然后在倒置显微镜下观察菌落边缘的隆起。
    5. 吸出胶原酶并洗涤 2 次 DMEM/F12。然后加入 1 mL/孔 hiPSC 培养基。
    6. 使用细胞提升器轻轻提升菌落。
    7. 使用 1 mL 吸头轻轻移液孔中的菌落 5-8 次，具体取决于菌落的大小。
    8. 将所有细胞收集到 15 mL 离心管中，并在室温下以 100 x g 离心 2 分钟。
    9. 用移液管轻轻吸出上清液，轻轻敲击试管去除细胞沉淀，然后根据孔数加入 1 mL 不含抗生素的 hiPSC 培养基，补充有 25 ng/mL bFGF。将细胞分配到冻存管中。
    10. 在冻存管中加入不含抗生素的 hiPSC 培养基，添加添加 25 ng/mL bFGF 和 20% DMSO，以达到 10% 的 DMSO 终浓度。
    11. 将冻存管放入冰冷的环境中，并用异丙醇浴进行缓慢冷冻。
    12. 将霜冻物保持在 -80 °C 过夜。第二天将样品瓶转移到 LN2 槽中。

2. 神经元分化

注：饲养层条件培养基 （FCM） 的制备：使用 T-75 培养瓶，每个培养瓶接种 4 x 106 个饲养层细胞。第二天，加入 40 mL 含 4 ng/mL bFGF 的 hiPSC 培养基。收集 7 天。每天将试管在 -20 °C 下储存长达 1 个月。在解离细胞之前，在 37 °C 下用 10 mL 0.1% 明胶包被 15 cm 培养皿至少 2 小时。在解离细胞前 1 天，用 hESC 合格的基底膜基质（以下简称“合格的基质”）包被 6 孔板。在整个方案中解离细胞时，向细胞分离溶液中加入 10 μM RI（参见 材料表）、DPBS 和电镀培养基（补充有 25 ng/mL bFGF 的 FCM）。为每次分化制备新鲜的饲养层条件培养基 （FCM）。避免 hiPSC 的过度移液。

  1. 体外日间 （DIV） 2：制备单细胞并接种 hiPSC 以进行神经分化
    1. 将 10 μM RI 添加到补充有 25 ng/mL bFGF、DPBS、细胞分离溶液和补充有 25 ng/mL bFGF 的饲养层条件培养基中的 hiPSC 培养基中。将所有这些试剂在 37 °C 下加热。
    2. 在饲养层上取 6 孔板的 iPSC，去除分化的集落，并加入补充有 25ng/mL bFGF 和 10 μM RI 的新鲜 hiPSC 培养基。将板在培养箱中放置 2 小时。
    3. 2 小时后取出 iPSCs 板，用不含 Ca++ 和 Mg++ 的 DPBS 洗涤一次。
    4. 加入 1 mL/孔细胞分离溶液（+ 10 μM RI），并将板在 CO2 培养箱内放置 12-14 分钟。
    5. 12-14 分钟后，在倒置显微镜下观察细胞;大多数细胞开始从板中分离。如果一些细胞仍然粘附，请从侧面轻轻敲击板。
    6. 通过添加 3 mL/孔含 Ca++ 和 Mg++ （+ 10 μM RI）的 DPBS 来稀释细胞分离溶液。使用 5 mL 移液器轻柔移液 2-3 次，避免气泡破裂结块。
    7. 让细胞通过 40 μM 过滤器。
    8. 将细胞收集到 50 mL 离心管中。
    9. 在室温下以 200 x g 离心 5 分钟，并使用 VAS 轻轻吸出培养基。
    10. 将细胞重悬于 10 mL hiPSC 培养基（+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM RI）中。将细胞添加到 0.1% 明胶包被的 15 cm 培养皿上 1.5 小时以去除饲养层，因为与 hiPSC 相比，饲养层对明胶涂层表面具有优先粘附性。
    11. 1.5 小时后，轻轻收集带有细胞的培养基，并在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。使用 VAS 吸出培养基。
    12. 将细胞重悬于 1 mL FCM（+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM RI）中并进行细胞计数。
    13. 使用 FCM（+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM RI），制备 30,000-50,000 个细胞/mL 的细胞悬液，并接种 5 mL 细胞悬液/60 mm 板或 2 mL/孔的 6 孔板或 500 μL/孔的 24 孔板。板应涂有合格的基质（参见 材料表）。
  2. DIV 0：（~48 小时后）：将饲养层条件培养基更换为 NPC 培养基（DDM + B27，不含维生素 A + N2）（参见 材料表）。
  3. 第 2 部分：每隔天添加含 0.125 μM Dorsomorphin 的 NPC 培养基，直至第 18 部分。
  4. 第 18 部分：添加不含 Dorsomorphin 的 NPC 培养基，每隔一天补充一次，直到第 28 部分。
  5. DIV 28-30： 为第 2 阶段制作单细胞和 NPC 接种
    1. 在 DIV 28 上，取出板（含有 NPC），并用 NPC 培养基（+ 10 μM RI）更换培养基。将板放入 CO2 培养箱中 2 小时。
    2. 2 小时后，吸出培养基并用 DPBS（不含 Ca++ 和 Mg ++）洗涤一次。
    3. 加入 1 mL/孔细胞分离溶液（+ 10 μM RI），并将板在培养箱内放置 14 分钟。
    4. 14 分钟后，在倒置显微镜下以 4 倍观察细胞。大多数细胞开始从板中分离。如果一些细胞仍然粘附，请从侧面轻轻敲击板。
    5. 通过添加 3 mL/孔含 Ca++ 和 Mg++ （+ 10 μM RI）的 DPBS 来稀释细胞分离溶液。使用 5 mL 移液器轻柔移液 2-3 次，避免气泡破裂结块。
    6. 穿过 40 μM 过滤器，置于 50 mL 离心管上。
    7. 在室温下以 200 x g 离心 5 分钟。使用 VAS 轻轻吸出培养基。
    8. 用维生素 A（+ 10 μM RI）将细胞重悬于 DDM + B27 中。
    9. 用血细胞计数器使用台盼蓝对活细胞进行计数。
    10. 将 50,000 个细胞/孔接种在 48 孔板的合格基质包被板 （1x） 上。
  6. DIV 33：将培养基更换为神经分化培养基（参见 材料表）。每 5 天更换一次培养基。继续补充培养基，直到 DIV 85/90。

3. 免疫细胞化学 （ICC）

注：在所有阶段添加足够的缓冲液以覆盖细胞，并避免在洗涤阶段吸液时孔干燥。

  1. 在细胞培养区外取出分化的细胞板。
  2. 吸出介质并进行 DPBS 清洗。
  3. 对于固定，向细胞中加入 1 mL 4% 多聚甲醛 （PFA）。用铝箔盖住板，并将其放在 37 °C 的摇床上 30 分钟。
  4. 吸出 PFA 并用 DPBS（不含 Ca++ 和 Mg++）洗涤 3 次，每次 15 分钟。
  5. 在室温下加入封闭缓冲液（3% BSA + 5% 驴血清（或来自二抗宿主动物的血清）+ 0.2% Triton-X 的 DPBS 溶液）1 小时。
  6. 加入 250 μL/孔的一抗 [Ki67（1：100 稀释）、TUBB3（1：500 稀释）、PAX6 （1：100）]，并在 4 °C 下在摇床上孵育过夜。在封闭溶液中稀释。
  7. 一抗孵育后用 DPBS 洗涤 3 次。
  8. 在室温下加入 250 μL/孔的二抗（在 3% BSA + 0.2% Triton-X 的 DPBS 中以 1：250 的比例稀释）1 小时。
  9. 二抗孵育后用 DPBS 洗涤 3 次。
  10. 在室温下加入 DAPI（1：1000 稀释 5 mg/mL 原液的 DPBS 溶液）15 分钟。用 DPBS 洗涤 3 次。将最后一次洗涤液留在培养板中，并在显微镜下观察。

4. 图像采集和分析

  1. 使用荧光显微镜以 20 倍分辨率捕获图像。
  2. 使用 540 nm 激发滤光片捕获 Ki67 图像以及 TUBB3 染色图像，使用 488 nm 激发滤光片捕获 PAX6 图像，使用 358 nm 激发滤光片捕获 DAPI 图像。
  3. 从 10 个不同的随机场捕获图像进行分析。
  4. 使用 ImageJ 软件分析 ICC 图像。
  5. 对于 TUBB3 和 PAX6 分析，分别对红色和绿色信号的所有图像以及 DAPI 的蓝色信号强度执行阈值处理。使用 DAPI 蓝色像素的平均强度对 TUBB3 的红色像素和 PAX6 的绿色像素的平均强度进行归一化。
  6. 对于 Ki67 分析，使用 ImageJ 软件中的自动细胞计数器功能对细胞进行计数。用 DAPI 阳性细胞的数量标准化 Ki67 阳性细胞的数量。
  7. 通过使用未配对的 t 检验比较两组，使用统计和绘图软件进行统计分析。数据应表示为来自三个独立实验的 SEM ±平均值。小于 0.05 的 p 值被视为具有统计显著性。

结果

将单一化的人 iPSC 作为单细胞悬液接种到合格的基质包被培养皿上，并通过去除 bFGF 开始分化。为了抑制非外胚层分化，从 DIV 2-1821 添加了 BMP 信号抑制剂 Dorsomorphin。为了从神经源性阶段进一步分化祖细胞，将单细胞悬液以低密度重新接种在合格的基质上（图 1）上再放置 6-10 周，以观察早期神经分化。在神经分化阶段（第 2 阶段?...

讨论

在这项工作中，描述了一种针对同基因整倍体 hiPSCs 和 DS hiPSCs 的有效无向单层皮质神经分化方案。由于细胞以单层形式生长，因此它们更多地暴露在培养条件下，这与使用拟胚体分化 iPSC 的程度是不可能的，后者通常用于其他方案14,16。虽然类器官系统的实用性越来越大，但基于单层的神经分化系统在为细胞提供均匀的分化环?...

披露声明

作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

作者感谢 Stuart H. Orkin 教授为我们提供了一对唐氏综合症和同基因整倍体 hiPSC。作者还感谢浦那国家细胞科学中心 （BRIC-NCCS） 为开展这项工作提供资金。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
MEF medium:
DMEM High GlucoseGibco11965-092
FBSVWR97068-08510% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-MercaptoethanolGibco21985-0231X final concentration
hiPSC medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Knockout Serum Replacement (KOSR)Gibco10828-02820% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-Mercaptoethanol (1000X)Gibco21985-0231X final concentration
DDM medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
Albumax (10%)Invitrogen 11020-0210.5 X of 10% Albumax is final concentration
NPC medium:
DDM medium
N2 SupplementGibco 175020481X final concentration
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AGibco 125870101X final concentration
Neural Differentiation medium (ND):
DDM medium1/2 of volume
Neurobasal MediumGibco 21103-0491/2 of volume
N2 SupplementGibco 175020480.5 X final concentration
B-27 Supplement (50X)Gibco 175040440.5 X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X of Neurobasal medium
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X of Neurobasal medium
Antibodies and reagents for immunostaining:
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G4%
DPBS, no calcium, no magnesiumSigma-AldrichD5652
Triton-X-100 SolutionSigma-AldrichX100-500ML0.20%
BSAHycloneA7979-50ML1.00%
Purified anti-tubulin β-3 (TUBB3) (TUJ1)BioLegend8012021:500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa fluor 594 conjugateLife Tech Invitrogen A212031:250 dilution
Purified Mouse-Anti-Human Ki67BD Pharmingen5506091:100 dilution
Purified anti-PAX6BioLegends9013021:100 dilution
Alexa fluor 488 Donkey (anti-rabbit)Life Tech Invitrogen A212061:250 dilution
DAPI Solution (5 mg/mL)SigmaD95421:1000 dilution
Others
Cell detachment solution (Accutase) Gibco A11105-01Ready to use working solution
Rock inhibitor (RI) Sellechckem Y2763210 mM/ml final concentration
Dorsomorphin Sellechckem S73060.125 nM/ml final concentration
DPBS with calcium and magnisium (DPBS+ Ca, Mg)Gibco 14040133Ready to use working solution
DPBS without calcium and magnisiumGibco 14190136Ready to use working solution
Gelatin Type ASigma G2500-100G0.10%
hESC-qualified basement membrane matrix (Matrigel GFR) Corning 3562301 mg stock vial diluted 1:240
Trypsin 0.05%Gibco25300054
Trypan BlueGibco15250-0610.40%
Basic Fibrablast Growth Factor (bFGF)Peprotech 100-18B25 ng/ml final concentration
Collagenase Gibco 17104-0191mg/ml final concentration

参考文献

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