Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה לסיכום נוירוגנזה לקויה של תסמונת דאון (DS) באמצעות iPSCs אנושיים של DS. הפרוטוקול זיהה פגם במחזור התא הדו-פאזי כגורם לפגיעה בנוירוגנזה בתסמונת דאון. הוא מספק פלטפורמה חזקה להבנת המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס הנוירוגנזה החריגה הקשורה ל-DS.

Abstract

תסמונת דאון (DS), הנגרמת על ידי עותק נוסף של כרומוזום 21, היא גורם מוביל ללקות אינטלקטואלית. אחד הגורמים המרכזיים התורמים למוגבלות אינטלקטואלית זו הוא נוירוגנזה לקויה הנצפית משלבי העובר ואילך. כדי לחקור את החריגות הנוירו-התפתחותיות הללו, תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSCs) הנוצרים באמצעות תאים שהתקבלו מחולי DS מספקים מודל בעל ערך ורלוונטי. כאן, מתואר פרוטוקול מקיף לסיכום נוירוגנזה לקויה ב-DS שנצפתה במהלך שלבי העובר של DS. פרוטוקול זה משתמש בזוג DS-hiPSCs בעלי שלושה עותקים של כרומוזום 21 ו-hiPSCs האופלואידים האיזוגניים שלו בעלי שני עותקים של כרומוזום 21. חשוב לציין, הפרוטוקול המתואר כאן מסכם נוירוגנזה לקויה ב-DS ומצא כי פגם במחזור התא הדו-פאזי, כלומר, התפשטות מופחתת של תאי אב עצביים DS (NPC) במהלך השלב המוקדם של השלב הנוירוגני ואחריו התפשטות מוגברת של DS NPC במהלך השלב המאוחר של השלב הנוירוגני הוא הגורם לנוירוגנזה לקויה של DS. התפשטות מוגברת של DS NPC בשלב המאוחר של השלב הנוירוגני מובילה ליציאה מאוחרת ממחזור התא, וגורמת לייצור מופחת של נוירונים פוסט-מיטוטיים מ-DS NPCs. פרוטוקול זה כולל שלבים מפורטים לתחזוקה של hiPSCs, התמיינותם לשושלות עצביות המציגות פגם במחזור התא הדו-פאזי במהלך השלב הנוירוגני, ואימות לאחר מכן של התמיינות עצבית מופחתת בתאי DS. על ידי יישום מתודולוגיה זו, חוקרים יכולים ליצור מערכת ניסויית חזקה המחקה את התנאים הנוירו-התפתחותיים של DS, ומאפשרת להם לחקור את השינויים הספציפיים בהתפתחות המוח הנגרמים על ידי טריזומיה 21.

Introduction

תסמונת דאון (DS), או טריזומיה 21, היא ההפרעה הכרומוזומלית השכיחה ביותר והגורם המוביל למוגבלות שכלית (ID)1. נוירוגנזה לקויה במהלך התפתחות העובר DS היא אחד הגורמים למוגבלות שכלית ב-DS2. מחקרי DS עובריים בבני אדם מראים ירידה במשקל ובנפח המוח, ירידה בתאי עצב, עלייה באסטרוציטים 3,4 ופיזור חריג של נוירונים בשכבות II ו-IV 5,6. בנוסף, השלב השני של התפתחות קליפת המוח, כלומר הופעת הלמינציה, מתעכב ולא מאורגן ב-DS7.

פגמים בהתפתחות עצבית ב-DS נחקרו בעיקר באמצעות מודלים של עכברים של DS כגון Ts65Dn, Ts1Rhr ו-Ts1cje8. עם זאת, מודלים אלה של עכברים לא הצליחו לסכם באופן מלא פנוטיפים שונים שנצפו במחקרי DS עקב הבדלים פיזיולוגיים והתפתחותיים בין עכברים לבני אדם9, מה שהוביל לניסויים קליניים כושלים10. המצאת תאי גזע פלוריפוטנטייםמושרים 11,12 סיפקה הזדמנות למדל ליקוי נוירולוגי של תסמונת דאון באמצעות תאים שמקורם ישירות מאנשים עם תסמונת דאון. עם זאת, ניסיונות קודמים לדגמן פגמים נוירו-התפתחותיים של DS באמצעות iPSCs אנושיים נתקלו בתוצאות לא עקביות ולא הצליחו להסביר באופן מלא פגמים נוירו-התפתחותיים שנצפו בחלקי מוח עובריים של DS 13,14,15,16. לדוגמה, דו"ח שפורסם על ידי Shi et al. מצא פנוטיפים של אלצהיימר הקשורים ל-DS אך לא דיווח על הבדל בנוירוגנזה של DS בהשוואה לביקורת אופלואידית15. באופן דומה, Weick et al. דיווחו על פעילות סינפטית מופחתת אך נוירוגנזה תקינה ב-DS בהשוואה לבקרות אופלואידיות16. עם זאת, נוירוגנזה תקינה ב-DS שדווחה בפרסומים אלה לא הייתה עקבית עם תצפיות מחלקי מוח עובריים של DS. מאוחר יותר, דו"ח של Hibaoui ואחרים דיווח על ירידה בנוירוגנזה ב-DS, מה שעלה בקנה אחד עם התצפית מסעיף14 של מוח העובר של DS. עם זאת, דו"ח זה ודוח נוסף שפורסם לאחרונה תיארו את הריבוי המופחת של NPCs DS כגורם לירידה בנוירוגנזה ב-DS14,17. עם זאת, רק התפשטות מופחתת של NPCs DS לא יכלה להסביר עלייה בתאי אסטרוגליה ועיכוב בהופעת למינציה במהלך התפתחות המוח העוברי של DS.

בעבודה שפורסמה לאחרונה, פותח מודל נוירוגנזה לקוי DS מבוסס iPSC אנושי המראה נוירוגנזה מופחתת. מודל זה מצא כי פגיעה בנוירוגנזה ב-DS נובעת מפגמים במחזור התא הדו-פאזי במהלך השלב הנוירוגני (השלב שבו תאי אב עצביים נוצרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים). במהלך השלב הראשון בשלב הנוירוגני, NPCs DS מציגים התפשטות מופחתת בהשוואה לתאים עצביים אופלואידים איזוגניים, ואחריהם התפשטות מוגברת של NPCs DS בהשוואה לתאים אופלואידים איזוגניים בשלב המאוחר של השלב הנוירוגני18.

בכתב יד זה, תואר פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב להתמיינות של hiPSCs של תסמונת דאון ו-hiPSCs האופלואידים האיזוגניים שלו לנוירונים בקליפת המוח. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד, להבדיל בין זוג hiPSCs DS לבין ה-hiPSCs האופלואידים האיזוגניים שלו לנוירונים בקליפת המוח, תוך התמקדות במידול פגמי הנוירוגנזה הקשורים ל-DS. פרוטוקול זה נועד להציע מערכת חזקה וניתנת לשחזור לחקירת המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס חריגות הגורמות לנוירוגנזה לקויה ב-DS.

הרציונל מאחורי פיתוח פרוטוקול זה הוא לאפשר התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים לנוירונים בקליפת המוח על ידי שימוש בעקרונות של נוירוביולוגיה התפתחותית, ובכך לאפשר זיהוי של פנוטיפים המתעוררים עקב מחלה/הפרעה. מטרת המחקר הייתה לנקוט בגישה מינימליסטית להתמיינות עצבית של iPSCs על ידי הימנעות מתרכובות כמו cAMP או DAPT, שעלולות להסוות פנוטיפים של מחלות הנובעות מפגמים בערוץ Ca++ או במסלול NOTCH, בהתאמה. באופן דומה, נמנע גם השימוש בחומצה אסקורבית, BDNF ו-GDNF, מה שעשוי להסוות פנוטיפים אחרים הקשורים למחלות נוירולוגיות על ידי הגברת נוירוגנזה.

היתרונות של טכניקה זו על פני שיטות אלטרנטיביות נעוצים במתן סיכום חזק של פנוטיפים נוירולוגיים שנצפו בחלקי מוח עובריים של DS. יש לציין כי בהשוואה למודלים של עכברים, המערכת האנושית המבוססת על iPSC מבטלת הבדלים בין מינים, ומספקת מודל רלוונטי יותר לחקרתהליכים נוירו-התפתחותיים ספציפיים לאדם, אך עד כה לא הצליחה לסכם את הנוירוגנזה הלקויה של DS שנצפתה בשלבים העובריים של DS ואילך. יתר על כן, השימוש בזוגות איזוגניים של hiPSCs מפחית את השונות ומשפר את האמינות של הבדלים פנוטיפיים שנצפו. פרוטוקול זה יעניין במיוחד חוקרים החוקרים הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירוגנזה אנושית. זה רלוונטי במיוחד עבור אלה המבקשים לדגמן היבטים ספציפיים לאדם של DS או אלה המעוניינים לפתח התערבויות טיפוליות המכוונות לפגמים בנוירוגנזה הקשורים לטריזומיה 21.

Protocol

הפרוטוקול הבא בוצע עם שני זוגות של תסמונת דאון ו-iPSCs אנושיים אופלואידים איזוגניים שלה. זוג אחד נוצר באמצעות שיטת ההעברה המתווכת רטרו-ויראלית של תכנות מחדש19, וזוג שני (NSi003-A ו-NSi003-B) נוצר באמצעות שיטת העברת וירוס סנדאי20 שאינה אינטגרציה. הפרוטוקול מורכב באופן כללי משני שלבים: השלב הנוירוגני (שלב 1) ושלב ההתמיינות העצבית (שלב 2). יתר על כן, שני שלבים המבוססים על ההבדלים בהתפשטות של תסמונת דאון וקווי תאים אופלואידים איזוגניים, כלומר השלבים המוקדמים והמאוחרים, נצפים בשלב הנוירוגני. פרטי הריאגנטים, המדיה והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. hiPSCs עם תסמונת דאון ו-hiPSCs אופלואידים איזוגניים תרבית ותחזוקה

  1. ציפוי מזין עבור רכיבי hiPSC
    הערה: איכות וצפיפות המזין חשובים ביותר לאיכות טובה של תרבית iPSCs אנושית.
    1. הוסף 2 מ"ל של 0.1% ג'לטין לציפוי צלחת של 6 בארות למשך 1-2 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס לפני הזריעה עם תאי הזנה.
    2. שמור את הצלחת המצופה ג'לטין בטמפרטורת החדר במכסה המנוע של תרבית התאים למשך 30 דקות לפחות לפני ציפוי התאים.
    3. מדיה פיברובלסטים עובריים חמים של עכבר (MEF) לשימוש לתחייה באמבט חרוזים/אמבט מים.
    4. Aliquot 5 מ"ל של מדיה MEF לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל.
    5. הוצא בקבוקון של תאי הזנה ממיכל החנקן הנוזלי (מיכל LN2).
      הערה: תאי הזנה הופקו על ידי טיפול בפיברובלסטים עובריים של עכבר E13.5 עם 10 מיקרוגרם/מ"ל מיטומיצין C למשך 3 שעות ולאחר מכן 2-3 פעמים שטיפה עם DPBS18. ניתן להשתמש בתאי הזנה ישירות או להקפיא במיכל LN2 לשימוש עתידי. כל העכברים שימשו לאחר אישור ועדת האתיקה המוסדית של בעלי חיים.
    6. שמור את הבקבוקון בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט המים באמצעות מתלה צף עד שתישאר חתיכת קרח קטנה.
    7. קח את הבקבוקון בתוך ארון הבטיחות הביולוגית ועקר אותו באלכוהול לפני הכנסתו לארון הבטיחות הביולוגית.
    8. הוסף 1 מ"ל של מדיה MEF חמה (ראה טבלת חומרים) טיפה אחר טיפה.
    9. הוצא את המדיה מהבקבוקון בעדינות ושפך טיפה אחר טיפה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל מדיה MEF.
    10. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ב -200 x גרם.
    11. שאפו את הסופרנטנט באמצעות מערכת שאיבת ואקום (VAS).
    12. הוסף 1 מ"ל של בינוני MEF ופיפטה בעדינות למעלה ולמטה 3-4 פעמים.
    13. קח את ספירת התאים באמצעות המוציטומטר. תאים מתים לא נכללו באמצעות Trypan Blue.
    14. צלחת 3.1-3.3 x 105 תאי הזנה חיים לכל באר של צלחת 6 בארות או 2 x 106 תאים לכל צלחת 6 בארות במדיום MEF.
    15. שמור את הצלחת בתוך חממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 85% לחות למשך הלילה. נענע את הצלחת בתוך חממת CO2 מלפנים ומאחור ולצדדים 2-3 פעמים כדי להשיג פיזור הומוגני של תאי הזנה.
  2. החייאת hiPSCs של תסמונת דאון ו-HiPSCs איזוגניים Euploid
    הערה: יש לחמם את הנפח הנדרש של מדיית hiPSC באמבט חרוזים של 37 מעלות צלזיוס.
    מדיום החייאת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (hiPSC): הוסף טרי 25 ננוגרם/מ"ל גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) ומעכב סלע של 10 מיקרומטר (RI) (Y-27632 2HCl) במדיום hiPSC.
    1. הסר את מדיית MEF מהמזינים היטב ותן שטיפה אחת למזינים על ידי הוספה עדינה של 1 מ"ל/באר DMEM/F12 חם מדפנות הבאר. שאפו את המדיום והוסיפו 2 מ"ל / מדיום תחייה hiPSC חם היטב. השאירו את הצלחת בתוך החממה למשך שעתיים לפחות לפני ציפוי hiPSCs.
    2. הוציאו בקבוקון של HiPSCs.
    3. שמור את הבקבוקון על מדף צף באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס עד שתישאר חתיכת קרח קטנה.
    4. לפני הכנסת הבקבוקון לארון הבטיחות הביולוגית, יש לעקר אותו ב-70% אלכוהול.
    5. הוסף 1 מ"ל של מדיום תחייה חם של hiPSC.
    6. הוציאו את המדיה מהבקבוקון בעדינות ושפכו טיפה אחר טיפה לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של חומרי החייאת hiPSCs.
    7. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות ב 100 x גרם.
    8. שאפו את הסופרנטנט באמצעות VAS והסירו את הכדור על ידי הקשה עדינה על הצינור.
    9. יוצקים 500 מיקרוליטר של מדיום hiPSC עם 10 מיקרומטר של RI ויוצקים על צלחת ההזנה המכילה מדיום החייאת hiPSC. סמן את הלוחית עם שם התא, מספר המעבר, שם החוקר והתאריך.
    10. התבונן במושבות hiPSC תחת מיקרוסקופ הפוך בהגדלה פי 4; צריכים להיות גושי תאים.
    11. תוך שמירה על הצלחת בתוך חממת CO2 , נענע את הצלחת מלפנים לאחור ולצדדים 2-3 פעמים כדי להשיג פיזור הומוגני של תאים. אל תפריע לצלחת למשך 24 שעות.
    12. למחרת, חלק מהמושבות עשויות להיראות דבוקות למאכילים, וחלקן צפות. מבלי לשאוב חומר כלשהו, יש להוסיף מדיום HiPSCs טרי בתוספת 25 ננוגרם/מ"ל bFGF ו-10 מיקרומטר של RI.
    13. ביום השני לאחר התחייה, רוב המושבות היו מחוברות לפני השטח. החלף מדיום שלם עם מדיום hiPSC עם 25 ננוגרם/מ"ל bFGF. בימים הבאים, מושבות hiPSC יהיו גלויות.
      הערה: לוקח לפחות שבוע עד ש-hiPSCs מתעוררים לחיים ויוצרים מושבות עם גבולות חלקים ומוגדרים היטב, מורפולוגיה אחידה של תאים ומרכז מושבה צפוף.
  3. מעבר תסמונת דאון hiPSCs ו-hiPSCs אופלואידים איזוגניים על מזינים
    הערה: כל הריאגנטים צריכים להיות חמים לפני שמתחילים. הימנע מפיפטינג יתר של תאים. טפל בתאים בעדינות רבה.
    1. מעבר hiPSCs כאשר רוב המושבות מתחילות להתמזג זו לתוך זו או כאשר יש הופעה של יותר מדי מושבות מובחנות. בדרך כלל, יש לבצע פיצול תוך 5-7 ימים לאחר המעבר הראשון.
    2. החיו בקבוקון של מזינים יום אחד לפני הפיצול.
    3. תן שטיפה אחת למזינים עם 1 מ"ל/באר DMEM/F12 חם והוסף 2 מ"ל/באר של מדיום hiPSCs חם בתוספת 25 ננוגרם/מ"ל bFGF. השאירו את הצלחת בתוך חממת CO2 בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות לפני ציפוי hiPSCs.
    4. התבונן בצלחת עם hiPSCs עבור מושבות מובחנות והסר את המושבה המובחנת על ידי גריטה באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר תחת סטריאומיקרוסקופ.
    5. תן שטיפה אחת ל-hiPSCs עם 1 מ"ל/DMEM/F12 חם היטב.
    6. יוצקים 1 מ"ל/באר של 1 מ"ג/מ"ל תמיסת קולגנאז. שמור את הצלחת בתוך החממה למשך 8-10 דקות, ולאחר מכן התבונן במיקרוסקופ הפוך בקצוות הרופפים של המושבות.
    7. שאפו את הקולגנאז ותנו 2 שטיפות של DMEM/F12. לאחר מכן יש להוסיף 1 מ"ל/באר hiPSC בינוני.
    8. חותכים בעדינות מושבות אופקית ואנכית 8-10 פעמים בבאר בעזרת קצה מזרק של 2 מ"ל. התבונן במושבות במיקרוסקופ הפוך כדי לבדוק אם רוב המושבות נחתכו לגודל המתאים.
    9. אם המושבות נחתכות מספיק, הרם בעדינות את המושבות באמצעות מרים תאים.
    10. פיפטה בעדינות את המושבות בבאר בעזרת קצה של 1 מ"ל, 5-8 פעמים, תלוי בגודל המושבות.
    11. אוספים את כל התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות ב-100 x גרם.
    12. שאפו את הסופרנטנט בעדינות באמצעות פיפטה, הסירו את כדור התא על ידי הקשה עדינה על הצינור, והוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום hiPSC עם 25 ננוגרם/מ"ל bFGF ו-10 מיקרומטר של RI. פיפטה 2-3 פעמים עם פיפטה של 200 מיקרוליטר והוסף 300 מיקרוליטר יותר מדיום hiPSC עם 25 ננוגרם/מ"ל bFGF ו-10 מיקרומטר של RI.
    13. כעת צלחת בעדינות את התאים הללו מעל המזינים המכילים מדיום hiPSC + 25 ננוגרם/מ"ל bFGF. ניתן לפצל באר אחת ל-1:2 או 1:3, תלוי במספר המושבות הקיימות לאחר הסרת מושבות מובחנות. סמן את הלוחית עם שם התא, מספר המעבר, שם החוקר והתאריך.
    14. תוך שמירה על הצלחת בתוך חממת CO2 , נענע את הצלחת מלפנים לאחור ולצדדים 2-3 פעמים כדי להשיג פיזור הומוגני של תאים.
    15. למחרת, יש לשטוף בעדינות אחת עם DMEM/F12 חם ולהוסיף 2.5 מ"ל של מדיום hiPSC עם 25 ננוגרם/מ"ל bFGF.
  4. הקפאת hiPSCs של תסמונת דאון ו-HiPSCs Euploid איזוגניים ממזינים
    הערה: יש להימנע מפיפטינג יתר של iPSCs אנושיים במהלך הליך ההקפאה.
    1. פיצול hiPSCs כשהם עדיין בשלב היומן שלהם, כלומר 4-5 ימים לאחר המעבר.
    2. התבונן בצלחת עם hiPSCs עבור מושבות מובחנות והסר את המושבות המובחנות באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר תחת סטריאומיקרוסקופ.
    3. תן שטיפה אחת ל-hiPSCs עם 1 מ"ל/DMEM/F12 חם היטב.
    4. הוסף 1 מ"ל/באר של 1 מ"ג/מ"ל תמיסת קולגנאז. שמור את הצלחת בתוך החממה למשך 8-10 דקות, ולאחר מכן התבונן תחת מיקרוסקופ הפוך להרמת קצוות המושבות.
    5. שאפו את הקולגנאז ותנו 2 שטיפות של DMEM/F12. לאחר מכן יש להוסיף 1 מ"ל/באר hiPSC בינוני.
    6. הרם בעדינות את המושבות באמצעות מרים תאים.
    7. פיפטה בעדינות את המושבות בבאר בעזרת קצה של 1 מ"ל 5-8 פעמים, תלוי בגודל המושבות.
    8. אוספים את כל התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות ב-100 x גרם.
    9. שאפו את הסופרנטנט בעדינות באמצעות פיפטה, עקרו את כדור התא על ידי הקשה עדינה על הצינור, והוסיפו 1 מ"ל של מדיום hiPSC ללא אנטיביוטיקה בתוספת 25 ננוגרם/מ"ל bFGF לפי מספר הבארות. מחלקים תאים לקריוביאלים.
    10. יש להוסיף מדיום hiPSC ללא אנטיביוטיקה בתוספת של 25 ננוגרם/מ"ל bFGF ו-20% DMSO בקריוביאלים כדי להשיג ריכוז סופי של 10% של DMSO.
    11. הכניסו את הקריוביאלים לאמבט קפוא עם אמבט איזופרופנול כדי לספק הקפאה איטית.
    12. שמור על הכפור בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך הלילה. העבירו את הבקבוקונים למחרת למיכל LN2.

2. בידול עצבי

הערה: הכנת מדיום מותנה מזין (FCM): השתמש בבקבוק T-75 ובצלחת 4 x 106 תאי הזנה לכל בקבוק. למחרת, הוסף 40 מ"ל של מדיום hiPSC עם 4 ננוגרם/מ"ל bFGF. יש לאסוף למשך 7 ימים. יש לאחסן כל שפופרת יומית בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך עד חודש אחד. מצפים צלחת בגודל 15 ס"מ ב-10 מ"ל של 0.1% ג'לטין ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות לפני ניתוק התאים. מצפים צלחת בת 6 בארות במטריצת קרום הבסיס המוסמכת hESC (להלן "מטריצה מוסמכת") יום אחד לפני ניתוק התאים. בעת פירוק תאים בכל הפרוטוקול, הוסף 10 מיקרומטר של RI לתמיסת ניתוק התאים (ראה טבלת חומרים), DPBS ואמצעי ציפוי (FCM בתוספת 25 ננוגרם/מ"ל bFGF). הכן מדיום ממוזג מזין טרי (FCM) לכל בידול. הימנע מפיפטינג יתר של hiPSCs.

  1. יום במבחנה (DIV) 2: יצירת תאים בודדים וזריעה של hiPSCs לנוירו-דיפרנציאציה
    1. הוסף 10 מיקרומטר של RI למדיית hiPSC בתוספת 25 ננוגרם/מ"ל bFGF, DPBS, תמיסת ניתוק תאים ומדיום מותאם מזין בתוספת 25 ננוגרם/מ"ל bFGF. מחממים את כל הריאגנטים הללו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    2. קח צלחת של 6 בארות של iPSCs על מזינים, הסר מושבות מובחנות, והוסף מדיית hiPSC טרייה בתוספת 25ng/mL bFGF ו-10 μM של RI. שמור את הצלחת למשך שעתיים בחממה.
    3. יש להוציא את לוחית ה-iPSCs לאחר שעתיים ולשטוף פעם אחת עם DPBS ללא Ca++ ו-Mg++.
    4. הוסף תמיסת ניתוק תאים של 1 מ"ל/באר (+ 10 מיקרומטר של RI) ושמור את הצלחת בתוך חממת CO2 למשך 12-14 דקות.
    5. לאחר 12-14 דקות, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ הפוך; רוב התאים מתחילים להתנתק מהצלחת. אם חלק מהתאים עדיין נדבקים, הקש בעדינות על הצלחת מהצדדים.
    6. דילול פתרון ניתוק תאים על ידי הוספת 3 מ"ל/באר DPBS עם Ca++ ו-Mg++ (+ 10 מיקרומטר של RI). בעזרת פיפטה של 5 מ"ל, בצע פיפטינג עדין 2-3 פעמים, הימנע מבועות לשבירת גושים.
    7. העבירו תאים דרך מסננת של 40 מיקרומטר.
    8. אוספים את התאים לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
    9. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ב-200 x גרם ושאיבה עדינה באמצעות VAS.
    10. השעו מחדש את התאים ב-10 מ"ל של מדיום hiPSC (+ 25 ננוגרם/מ"ל bFGF + 10 מיקרומטר של RI). הוסף תאים על צלחת מצופה ג'לטין 0.1% בגודל 15 ס"מ למשך שעה וחצי כדי להסיר מזינים מכיוון שלמזינים יש הידבקות מועדפת למשטח המצופה ג'לטין בהשוואה ל-hiPSCs.
    11. לאחר 1.5 שעות, אוספים בעדינות את המדיה עם תאים וצנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות בטמפרטורה של 200 x גרם. שאב מדיה באמצעות VAS.
    12. השעו מחדש את התאים ב-1 מ"ל של FCM (+ 25 ננוגרם/מ"ל bFGF + 10 מיקרומטר של RI) וקחו את ספירת התאים.
    13. באמצעות FCM (+ 25 ננוגרם/מ"ל bFGF + 10 מיקרומטר של RI), צור תרחיף תאים של 30,000-50,000 תאים/מ"ל וזרע תרחיף תאים של 5 מ"ל/צלחת 60 מ"מ או 2 מ"ל/באר של צלחת 6 בארות או 500 מיקרוליטר/באר של צלחת 24 בארות. הצלחות צריכות להיות מצופות במטריצה מוסמכת (ראה טבלת חומרים).
  2. DIV 0: (~48 שעות מאוחר יותר): החלף את המדיום המותנה במזין למדיית NPC (DDM + B27 ללא ויטמין A + N2) (ראה טבלת החומרים).
  3. DIV 2: הוסף מדיום NPC עם 0.125 מיקרומטר של דורסומורפין בכל יום לסירוגין עד DIV 18.
  4. DIV 18: הוסף מדיית NPC ללא דורסומורפין וחידש כל יום לסירוגין עד DIV 28.
  5. DIV 28-30: יצירת תאים בודדים וזריעה של NPCs לשלב 2
    1. ב-DIV 28, הוצא את הצלחת (המכילה NPCs) והחלף את המדיה במדיית NPC (+ 10 מיקרומטר של RI). הכניסו את הצלחת לחממת CO2 למשך שעתיים.
    2. לאחר שעתיים, שאפו את המדיה ושטפו פעם אחת עם DPBS (ללא Ca++ ו-Mg++).
    3. הוסף תמיסת ניתוק תאים של 1 מ"ל/באר (+ 10 מיקרומטר של RI) ושמור את הצלחת בתוך החממה למשך 14 דקות.
    4. לאחר 14 דקות, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ הפוך ב-4x. רוב התאים מתחילים להתנתק מהצלחת. אם חלק מהתאים עדיין נדבקים, הקש בעדינות על הצלחת מהצדדים.
    5. לדלל את תמיסת ניתוק התאים על ידי הוספת 3 מ"ל/באר DPBS עם Ca++ ו-Mg++ (+ 10 מיקרומטר של RI). בעזרת פיפטה של 5 מ"ל, בצע פיפטינג עדין 2-3 פעמים, הימנע מבועות לשבירת גושים.
    6. עוברים דרך מסננת 40 מיקרומטר המונחת על צינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
    7. צנטריפוגה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות ב -200 x גרם. שאב מדיה בעדינות באמצעות VAS.
    8. השעו מחדש את התאים ב- DDM + B27 עם ויטמין A (+ 10 מיקרומטר של RI).
    9. ספרו את התאים החיים באמצעות טריפן כחול עם המוציטומטר.
    10. זרע 50,000 תאים/באר על צלחת מצופה מטריצה מוסמכת (1x) של צלחת 48 הבארות.
  6. DIV 33: שנה מדיום למדיום התמיינות עצבית (ראה טבלת החומרים). החלף את המדיום כל 5 ימים. המשך לחדש את המדיה עד DIV 85/90.

3. אימונוציטוכימיה (ICC)

הערה: הוסף מספיק חיץ בכל השלבים כדי לכסות תאים ולהימנע מייבוש הבאר בזמן השאיבה בשלב הכביסה.

  1. הוצא את לוחית התאים המובחנת מחוץ לאזור תרבית התאים.
  2. שאפו את המדיה ותנו שטיפת DPBS.
  3. לקיבוע, הוסף 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד (PFA) לתאים. מכסים את הצלחת בנייר אלומיניום ומניחים אותה על שייקר נדנדה בחום של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. שאפו PFA ותנו שלוש שטיפות כל אחת של 15 דקות עם DPBS (ללא Ca++ ו-Mg++).
  5. יש להוסיף חוצץ חוסם (3% BSA + 5% סרום חמור (או נסיוב מהחיה המארחת של נוגדן משני) + 0.2% Triton-X ב-DPBS) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  6. הוסף 250 מיקרוליטר/באר של נוגדנים ראשוניים [Ki67 (דילול 1: 100), TUBB3 (דילול 1: 500), PAX6 (1: 100)] ודגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על שייקר נדנדה. הדילול נעשה בתמיסת חסימה.
  7. שטפו שלוש פעמים עם DPBS לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים.
  8. הוסף 250 מיקרוליטר/באר של נוגדן משני (מדולל 1: 250 ב-3% BSA + 0.2% טריטון-X ב-DPBS) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
  9. יש לשטוף 3 פעמים עם DPBS לאחר דגירה משנית של נוגדנים.
  10. הוסף DAPI (1: דילול 1000 של מלאי 5 מ"ג/מ"ל ב-DPBS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שוטפים שלוש פעמים עם DPBS. השאירו את הכביסה האחרונה בצלחת התרבות והתבוננו תחת המיקרוסקופ.

4. רכישת תמונות וניתוח

  1. צלם תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה של פי 20.
  2. צלם תמונות של Ki67, כמו גם תמונות צביעה של TUBB3 באמצעות מסנן עירור של 540 ננומטר, PAX6 באמצעות מסנן עירור של 488 ננומטר ותמונות DAPI באמצעות מסנן עירור של 358 ננומטר.
  3. צלם תמונות מעשרה שדות אקראיים שונים לניתוח.
  4. נתח תמונות ICC באמצעות תוכנת ImageJ.
  5. לניתוח TUBB3 ו-PAX6, בצע סף של כל התמונות עבור האותות האדומים והירוקים, בהתאמה, ועוצמת האות הכחול עבור DAPI. העוצמה הממוצעת של הפיקסלים האדומים של TUBB3 והפיקסלים הירוקים של PAX6 נורמלה עם העוצמה הממוצעת של הפיקסלים הכחולים של DAPI.
  6. לניתוח Ki67, ספור את התאים באמצעות תכונת מונה התאים האוטומטי בתוכנת ImageJ. נרמל את מספר התאים החיוביים ל- Ki67 עם מספר התאים החיוביים ל- DAPI.
  7. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות תוכנות סטטיסטיקה וגרפים על ידי השוואה בין שתי הקבוצות באמצעות מבחני t לא מזווגים. יש לבטא את הנתונים כממוצע ± SEM משלושה ניסויים בלתי תלויים. ערך p של פחות מ-0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.

תוצאות

iPSCs אנושיים יחידים נזרעו על כלים מצופים מטריצה מוסמכים כתרחיפים חד-תאיים, וההתמיינות החלה על ידי הסרת bFGF. כדי לעכב התמיינות שאינה אקטודרמלית, דורסומורפין, מעכב איתות BMP, נוסף מ-DIV 2-1821. להמשך התמיינות של תאי אב מהשלב הנוירוגני, תרחיפים של תאים בודדים צופו מחדש ב...

Discussion

בעבודה זו, מתואר פרוטוקול נוירו-דיפרנציאציה חד-שכבתית יעיל לא מכוון עבור זוג איזוגני של hiPSCs Euploid ו-DS hiPSCs. מכיוון שהתאים גדלים כחד-שכבתיים, הם חשופים יותר לתנאי תרבית, מה שאינו אפשרי באותה מידה כמו שימוש בגופים עובריים להבדיל iPSCs, המשמשים בדרך כלל בפרוטוקולים אחרים

Disclosures

למחברים אין ניגוד אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מודים לפרופ' סטיוארט ה. אורקין על שסיפק לנו זוג של תסמונת דאון ו-hiPSCs איזוגניים אופלואידים. המחברים מודים גם למרכז הלאומי למדעי התא (BRIC-NCCS), פונה, על מתן המימון לביצוע עבודה זו.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
MEF medium:
DMEM High GlucoseGibco11965-092
FBSVWR97068-08510% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-MercaptoethanolGibco21985-0231X final concentration
hiPSC medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Knockout Serum Replacement (KOSR)Gibco10828-02820% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-Mercaptoethanol (1000X)Gibco21985-0231X final concentration
DDM medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
Albumax (10%)Invitrogen 11020-0210.5 X of 10% Albumax is final concentration
NPC medium:
DDM medium
N2 SupplementGibco 175020481X final concentration
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AGibco 125870101X final concentration
Neural Differentiation medium (ND):
DDM medium1/2 of volume
Neurobasal MediumGibco 21103-0491/2 of volume
N2 SupplementGibco 175020480.5 X final concentration
B-27 Supplement (50X)Gibco 175040440.5 X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X of Neurobasal medium
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X of Neurobasal medium
Antibodies and reagents for immunostaining:
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G4%
DPBS, no calcium, no magnesiumSigma-AldrichD5652
Triton-X-100 SolutionSigma-AldrichX100-500ML0.20%
BSAHycloneA7979-50ML1.00%
Purified anti-tubulin β-3 (TUBB3) (TUJ1)BioLegend8012021:500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa fluor 594 conjugateLife Tech Invitrogen A212031:250 dilution
Purified Mouse-Anti-Human Ki67BD Pharmingen5506091:100 dilution
Purified anti-PAX6BioLegends9013021:100 dilution
Alexa fluor 488 Donkey (anti-rabbit)Life Tech Invitrogen A212061:250 dilution
DAPI Solution (5 mg/mL)SigmaD95421:1000 dilution
Others
Cell detachment solution (Accutase) Gibco A11105-01Ready to use working solution
Rock inhibitor (RI) Sellechckem Y2763210 mM/ml final concentration
Dorsomorphin Sellechckem S73060.125 nM/ml final concentration
DPBS with calcium and magnisium (DPBS+ Ca, Mg)Gibco 14040133Ready to use working solution
DPBS without calcium and magnisiumGibco 14190136Ready to use working solution
Gelatin Type ASigma G2500-100G0.10%
hESC-qualified basement membrane matrix (Matrigel GFR) Corning 3562301 mg stock vial diluted 1:240
Trypsin 0.05%Gibco25300054
Trypan BlueGibco15250-0610.40%
Basic Fibrablast Growth Factor (bFGF)Peprotech 100-18B25 ng/ml final concentration
Collagenase Gibco 17104-0191mg/ml final concentration

References

  1. Chapman, R. S., Hesketh, L. J. Behavioral phenotype of individuals with Down syndrome. Ment Retard Dev Disabil Res Rev. 6 (2), 84-95 (2000).
  2. Haydar, T. F., Reeves, R. H. Trisomy 21 and early brain development. Trends Neurosci. 35 (2), 81-91 (2012).
  3. Wisniewski, K. E. Down syndrome children often have brain with maturation delay, retardation of growth, and cortical dysgenesis. Am J Med Genet Suppl. 7, 274-281 (1990).
  4. Guidi, S., et al. Neurogenesis impairment and increased cell death reduce total neuron number in the hippocampal region of fetuses with Down syndrome. Brain Pathol. 18 (2), 180-197 (2008).
  5. Lott, I. T. Neurological phenotypes for Down syndrome across the life span. Prog Brain Res. 197, 101-121 (2012).
  6. Stagni, F., Giacomini, A., Emili, M., Guidi, S., Bartesaghi, R. Neurogenesis impairment: An early developmental defect in Down syndrome. Free Radic Biol Med. 114, 15-32 (2018).
  7. Golden, J. A., Hyman, B. T. Development of the superior temporal neocortex is anomalous in trisomy 21. J Neuropathol Exp Neurol. 53 (5), 513-520 (1994).
  8. Gupta, M., Dhanasekaran, A. R., Gardiner, K. J. Mouse models of Down syndrome: Gene content and consequences. Mamm Genome. 27 (11-12), 538-555 (2016).
  9. Wu, Y., West, N. R., Bhattacharyya, A., Wiseman, F. K. Cell models for Down syndrome-Alzheimer's disease research. Neuronal Signal. 6 (1), NS20210054 (2022).
  10. Zhao, X., Bhattacharyya, A. Human models are needed for studying human neurodevelopmental disorders. Am J Hum Genet. 103 (6), 829-857 (2018).
  11. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  12. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  13. Briggs, J. A., et al. Integration-free induced pluripotent stem cells model genetic and neural developmental features of Down syndrome etiology. Stem Cells. 31 (3), 467-478 (2013).
  14. Hibaoui, Y., et al. Modeling and rescuing neurodevelopmental defect of Down syndrome using induced pluripotent stem cells from monozygotic twins discordant for trisomy 21. EMBO Mol Med. 6 (2), 259-277 (2014).
  15. Shi, Y., et al. A human stem cell model of early Alzheimer's disease pathology in Down syndrome. Sci Transl Med. 4 (124), 124ra29 (2012).
  16. Weick, J. P., et al. Deficits in human trisomy 21 iPSCs and neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (24), 9962-9967 (2013).
  17. Meharena, H. S., et al. Down syndrome-induced senescence disrupts the nuclear architecture of neural progenitors. Cell Stem Cell. 29 (1), 116-130.e7 (2022).
  18. Sharma, V., et al. Biphasic cell cycle defect causes impaired neurogenesis in Down syndrome. Front Genet. 13, 1007519 (2022).
  19. Maclean, G. A., et al. Altered hematopoiesis in trisomy 21 as revealed through in vitro differentiation of isogenic human pluripotent cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (43), 17567-17572 (2012).
  20. Nehra, S., Sharma, V., Umrani, M., Singhal, N. Generation of integration-free Down syndrome and isogenic euploid human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 67, 103041 (2023).
  21. Yu, P. B., et al. Dorsomorphin inhibits BMP signals required for embryogenesis and iron metabolism. Nat Chem Biol. 4 (1), 33-41 (2008).
  22. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nat Neurosci. 15 (3), 477-486 (2012).
  23. Espuny-Camacho, I., et al. Pyramidal neurons derived from human pluripotent stem cells integrate efficiently into mouse brain circuits in vivo. Neuron. 77 (3), 440-456 (2013).
  24. Gaspard, N., et al. Generation of cortical neurons from mouse embryonic stem cells. Nat Protoc. 4 (10), 1454-1463 (2009).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HiPSCs21

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved