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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methodik zur Rekapitulation der durch das Down-Syndrom (DS) beeinträchtigten Neurogenese unter Verwendung von humanen DS-iPSCs. Das Protokoll identifizierte einen biphasischen Zellzyklusdefekt als Ursache für eine gestörte Neurogenese beim Down-Syndrom. Es bietet eine robuste Plattform für das Verständnis zellulärer und molekularer Mechanismen, die der abnormalen Neurogenese im Zusammenhang mit DS zugrunde liegen.

Zusammenfassung

Das Down-Syndrom (DS), das durch eine zusätzliche Kopie des Chromosoms 21 verursacht wird, ist eine der Hauptursachen für geistige Behinderung. Einer der Schlüsselfaktoren, die zu dieser geistigen Behinderung beitragen, ist eine gestörte Neurogenese, die ab dem fetalen Stadium beobachtet wird. Um diese neurologischen Entwicklungsstörungen zu untersuchen, stellen humaninduzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs), die mit Zellen von DS-Patienten erzeugt wurden, ein wertvolles und relevantes Modell dar. In dieser Arbeit wird ein umfassendes Protokoll zur Rekapitulation der DS-beeinträchtigten Neurogenese beschrieben, die während der DS-fetalen Stadien beobachtet wurde. Dieses Protokoll verwendet ein Paar DS-hiPSCs mit drei Kopien des Chromosoms 21 und seine isogenen euploiden hiPSCs mit zwei Kopien des Chromosoms 21. Wichtig ist, dass das hier beschriebene Protokoll die DS-beeinträchtigte Neurogenese rekapituliert und feststellte, dass ein biphasischer Zellzyklusdefekt, d.h. eine verminderte Proliferation von DS-neuralen Vorläuferzellen (NPC) während der frühen Phase des neurogenen Stadiums, gefolgt von einer erhöhten Proliferation von DS-NPC während der späten Phase des neurogenen Stadiums, die Ursache für die DS-beeinträchtigte Neurogenese ist. Eine erhöhte Proliferation von DS-NPCs in der späten Phase des neurogenen Stadiums führt zu einem verzögerten Verlassen des Zellzyklus, was zu einer verminderten Generierung postmitotischer Neuronen aus DS-NPCs führt. Dieses Protokoll umfasst detaillierte Schritte für die Aufrechterhaltung von hiPSCs, ihre Differenzierung in neuronale Linien, die während des neurogenen Stadiums einen biphasischen Zellzyklusdefekt aufweisen, und die anschließende Validierung der reduzierten neuronalen Differenzierung in DS-Zellen. Durch die Befolgung dieser Methodik können Forscher ein robustes experimentelles System entwickeln, das die neurologischen Entwicklungsbedingungen von DS nachahmt und es ihnen ermöglicht, die spezifischen Veränderungen in der Gehirnentwicklung zu untersuchen, die durch Trisomie 21 verursacht werden.

Einleitung

Das Down-Syndrom (DS) oder Trisomie 21 ist die häufigste Chromosomenanomalie und die Hauptursache für geistige Behinderung (ID)1. Eine gestörte Neurogenese während der Entwicklung des DS-Fötus ist eine der Ursachen für geistige Behinderung bei DS2. DS-fetale Studien am Menschen zeigen eine Verringerung des Gehirngewichts und -volumens, reduzierte Neuronen, erhöhte Astrozyten 3,4 und eine abnormale Verteilung der Neuronen in den Schichten II und IV 5,6. Darüber hinaus ist die zweite Phase der kortikalen Entwicklung, d.h. das Auftreten der Laminierung, in DS7 sowohl verzögert als auch unorganisiert.

Neuroentwicklungsstörungen bei DS wurden hauptsächlich mit Mausmodellen von DS wie Ts65Dn, Ts1Rhr und Ts1cjeuntersucht 8. Diese Mäusemodelle waren jedoch nicht in der Lage, verschiedene Phänotypen, die in DS-Studien beobachtet wurden, aufgrund physiologischer und entwicklungsbedingter Unterschiede zwischen Mäusen und Menschen vollständig zu rekapitulieren9, was zu fehlgeschlagenen klinischen Studien führte10. Die Erfindung induzierter pluripotenter Stammzellen11,12 bot die Möglichkeit, die neurologische Beeinträchtigung des Down-Syndroms anhand von Zellen zu modellieren, die direkt von Personen mit DS stammten. Frühere Versuche, DS-Neuroentwicklungsdefekte mit humanen iPS-Zellen zu modellieren, führten jedoch zu widersprüchlichen Ergebnissen und konnten die neurologischen Entwicklungsdefekte, die in den DS-Hirnschnitten13, 14, 15, 16 beobachtet wurden, nicht vollständig erklären. Zum Beispiel fand ein von Shi et al. veröffentlichter Bericht DS-bedingte Alzheimer-Phänotypen, berichtete aber über keinen Unterschied in der DS-Neurogenese im Vergleich zu euploiden Kontrollen15. In ähnlicher Weise berichteten Weick et al. über eine verminderte synaptische Aktivität, aber eine normale Neurogenese bei DS im Vergleich zu euploiden Kontrollen16. Die in diesen Veröffentlichungen berichtete normale Neurogenese bei DS stimmte jedoch nicht mit den Beobachtungen aus DS-Hirnschnitten des Fötus überein. Später berichtete ein Bericht von Hibaoui et al. über eine verminderte Neurogenese bei DS, was mit den Beobachtungen aus dem DS-fetalen Gehirnabschnittübereinstimmte 14. Dieser Bericht und ein anderer aktueller Bericht beschreiben jedoch die verminderte Proliferation von DS-NPCs als Ursache für die verminderte Neurogenese in DS14,17. Allerdings konnte nur eine verminderte Proliferation von DS-NPCs die Zunahme der Astrogliazellen und die verzögerte Entstehung der Laminierung während der Entwicklung des DS-fetalen Gehirns nicht erklären.

In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit wurde ein humanes iPSC-basiertes DS-beeinträchtigtes Neurogenesemodell entwickelt, das eine reduzierte Neurogenese zeigt. Dieses Modell ergab, dass eine gestörte Neurogenese bei DS auf biphasische Zellzyklusdefekte während des neurogenen Stadiums zurückzuführen ist (das Stadium, in dem neurale Vorläuferzellen aus pluripotenten Stammzellen erzeugt werden). Während der ersten Phase im neurogenen Stadium zeigten DS-NPCs eine reduzierte Proliferation im Vergleich zu isogenen euploiden Nervenzellen, gefolgt von einer erhöhten Proliferation von DS-NPCs im Vergleich zu isogenen euploiden Zellen in der späten Phase des neurogenen Stadiums18.

In diesem Manuskript wurde ein detailliertes Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Differenzierung von Down-Syndrom-hiPSCs und ihren isogenen euploiden hiPSCs in kortikale Neuronen beschrieben. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, ein detailliertes, schrittweises Protokoll für die Differenzierung eines Paares von DS-hiPSCs und seiner isogenen euploiden hiPSCs in kortikale Neuronen bereitzustellen, wobei der Schwerpunkt auf der Modellierung der mit DS assoziierten Neurogenesedefekte liegt. Dieses Protokoll soll ein robustes und reproduzierbares System zur Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen bieten, die Anomalien zugrunde liegen, die eine DS-beeinträchtigte Neurogenese verursachen.

Der Grundgedanke hinter der Entwicklung dieses Protokolls besteht darin, die Differenzierung von pluripotenten Stammzellen in kortikale Neuronen unter Verwendung von Prinzipien der Entwicklungsneurobiologie zu ermöglichen und so die Identifizierung von Phänotypen zu ermöglichen, die aufgrund von Krankheiten/Störungen entstehen. Ziel war es, einen minimalistischen Ansatz für die neuronale Differenzierung von iPSCs zu verfolgen, indem Verbindungen wie cAMP oder DAPT vermieden wurden, die Krankheitsphänotypen maskieren könnten, die aufgrund von Defekten im Ca++ -Kanal bzw. NOTCH-Signalweg entstehen. In ähnlicher Weise wurde auch die Verwendung von Ascorbinsäure, BDNF und GDNF vermieden, die andere neurologische krankheitsbedingte Phänotypen maskieren können, indem sie die Neurogenese potenzieren.

Die Vorteile dieser Technik gegenüber alternativen Methoden liegen in der robusten Rekapitulation neurologischer Phänotypen, die in DS-fetalen Hirnschnitten beobachtet wurden. Bemerkenswert ist, dass das humane iPSC-basierte System im Vergleich zu Mausmodellen Unterschiede zwischen den Spezies eliminiert und ein relevanteres Modell für die Untersuchung humanspezifischer neurologischer Entwicklungsprozesse darstellt9 , aber bisher nicht in der Lage war, die DS-beeinträchtigte Neurogenese, die ab den DS-Fetalstadien beobachtet wurde, zu rekapitulieren. Darüber hinaus reduziert die Verwendung isogener Paare von hiPSCs die Variabilität und erhöht die Zuverlässigkeit der beobachteten phänotypischen Unterschiede. Dieses Protokoll wird von besonderem Interesse für Forscher sein, die sich mit neurologischen Entwicklungsstörungen und der menschlichen Neurogenese befassen. Es ist besonders relevant für diejenigen, die humanspezifische Aspekte von DS modellieren möchten oder an der Entwicklung therapeutischer Interventionen interessiert sind, die auf die mit Trisomie 21 verbundenen Neurogenesedefekte abzielen.

Protokoll

Das folgende Protokoll wurde mit zwei Paaren des Down-Syndroms und seinen isogenen euploiden humanen iPSCs befolgt. Ein Paar wurde unter Verwendung der retroviralen Verabreichungsmethode der Reprogrammierung19 erzeugt, und ein zweites Paar (NSi003-A und NSi003-B) wurde unter Verwendung der nicht-integrierenden Sendai-Virus-Verabreichungsmethode20 erzeugt. Das Protokoll besteht im Großen und Ganzen aus zwei Phasen: dem neurogenen Stadium (Stadium 1) und dem Stadium der neuronalen Differenzierung (Stadium 2). Darüber hinaus werden im neurogenen Stadium zwei Phasen beobachtet, die auf den Unterschieden in der Proliferation des Down-Syndroms und der isogenen euploiden Zelllinien basieren, d.h. die frühe und die späte Phase. Die Einzelheiten zu den in dieser Studie verwendeten Reagenzien, Medien und Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Kultur und Erhaltung von HiPSCs des Down-Syndroms und isogenen euploiden hiPSCs

  1. Feeder-Beschichtung für hiPSCs
    HINWEIS: Die Qualität und Dichte des Feeders sind für eine gute Qualität der menschlichen iPS-Kultur äußerst wichtig.
    1. Fügen Sie 2 ml 0,1 % Gelatine hinzu, um eine 6-Well-Platte mindestens 1-2 h bei 37 °C zu beschichten, bevor Sie sie mit Feeder-Zellen aussäen.
    2. Bewahren Sie die mit Gelatine beschichtete Platte mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in der Zellkulturhaube auf, bevor Sie die Zellen plattieren.
    3. Warmes Medium für embryonale Fibroblasten (MEF) der Maus zur Verwendung zur Wiederbelebung im Perlbad/Wasserbad.
    4. Aliquotieren Sie 5 mL MEF-Medium in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen.
    5. Nehmen Sie ein Fläschchen mit Feederzellen aus dem Flüssigstickstofftank (LN2-Tank).
      HINWEIS: Die Feederzellen wurden durch Behandlung von embryonalen Fibroblasten von E13.5 Maus mit 10 μg/ml Mitomycin C für 3 Stunden gewonnen, gefolgt von 2-3 maligem Waschen mit DPBS18. Feederzellen können direkt oder eingefroren in einem LN2-Tank für die zukünftige Verwendung verwendet werden. Alle Mäuse wurden nach Genehmigung durch die Ethikkommission für Anstaltstiere verwendet.
    6. Bewahren Sie das Fläschchen bei 37 °C im Wasserbad mit einem schwimmenden Gestell auf, bis ein kleines Stück Eis übrig bleibt.
    7. Nehmen Sie das Fläschchen in die Biosicherheitswerkbank und sterilisieren Sie es mit Alkohol, bevor Sie es in die Biosicherheitswerkbank legen.
    8. Geben Sie Tropfen für Tropfen 1 ml warmes MEF-Medium (siehe Materialtabelle) hinzu.
    9. Nehmen Sie das Medium vorsichtig aus dem Fläschchen und gießen Sie es Tropfen für Tropfen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit MEF-Medien.
    10. Bei Raumtemperatur 5 min bei 200 x g zentrifugieren.
    11. Der Überstand wird mit einem Vakuum-Absaugsystem (VAS) abgesaugt.
    12. Fügen Sie 1 ml MEF-Medium hinzu und pipettieren Sie vorsichtig 3-4 Mal auf und ab.
    13. Nehmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Tote Zellen wurden mit Trypanblau ausgeschlossen.
    14. Platte: 3,1-3,3 x 10:5 lebende Feederzellen pro Well einer 6-Well-Platte oder 2 x 106 Zellen pro 6-Well-Platte in MEF-Medium.
    15. Halten Sie die Platte im CO2 -Inkubator über Nacht bei 37 °C und 85 % Luftfeuchtigkeit. Schütteln Sie die Platte im CO2 -Inkubator vorne-hinten und seitlich 2-3 Mal, um eine homogene Verteilung der Feederzellen zu erreichen.
  2. Wiederbelebung von Down-Syndrom-hiPSCs und isogenen euploiden hiPSCs
    HINWEIS: Erwärmen Sie das erforderliche Volumen des hiPSC-Mediums in einem 37 °C heißen Bead-Bad.
    Wiederbelebungsmedium für humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSC): Geben Sie frisch 25 ng/ml basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (bFGF) und 10 μM Rock-Inhibitor (RI) (Y-27632 2HCl) in das hiPSC-Medium.
    1. Entfernen Sie das MEF-Medium aus der Vertiefung der Zufuhr und waschen Sie die Futterbehälter einmal, indem Sie vorsichtig 1 ml/Vertiefung warmes DMEM/F12 von den Seiten der Vertiefung hinzufügen. Aspirieren Sie das Medium und fügen Sie 2 ml/Well warmes hiPSC-Wiederbelebungsmedium hinzu. Lassen Sie die Platte mindestens 2 Stunden im Inkubator, bevor Sie hiPSCs plattieren.
    2. Nehmen Sie ein Fläschchen mit hiPS-Zellen heraus.
    3. Bewahren Sie das Fläschchen auf einem schwimmenden Gestell in einem 37 °C warmen Wasserbad auf, bis ein kleines Stück Eis übrig bleibt.
    4. Bevor Sie das Fläschchen in die Biosicherheitswerkbank bringen, sterilisieren Sie es mit 70% Alkohol.
    5. Fügen Sie 1 ml warmes hiPSC-Wiederbelebungsmedium hinzu.
    6. Nehmen Sie das Medium vorsichtig aus dem Fläschchen und gießen Sie es Tropfen für Tropfen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 5 ml hiPS-Wiederbelebungsmedium.
    7. Bei Raumtemperatur 2 min bei 100 x g zentrifugieren.
    8. Saugen Sie den Überstand mit VAS an und lösen Sie das Pellet durch leichtes Klopfen auf das Rohr.
    9. Gießen Sie 500 μl hiPSC-Medium mit 10 μM RI und gießen Sie es über die Dosierplatte mit dem hiPSC-Wiederbelebungsmedium. Beschriften Sie die Platte mit dem Namen der Zelle, der Durchgangsnummer, dem Namen des Forschers und dem Datum.
    10. Beobachten Sie die hiPSC-Kolonien unter einem inversen Mikroskop bei 4-facher Vergrößerung; Es sollten Zellklumpen vorhanden sein.
    11. Während Sie die Platte im CO2 -Inkubator halten, schütteln Sie die Platte 2-3 Mal von vorne, hinten und seitlich, um eine homogene Verteilung der Zellen zu erreichen. Stören Sie die Platte nicht für 24 Stunden.
    12. Am nächsten Tag könnten einige Völker wie Futterstellen aussehen, und andere würden schwimmen. Ohne Aspiration eines Mediums wird frisches hiPS-Medium zugegeben, das mit 25 ng/ml bFGF und 10 μM RI ergänzt wird.
    13. Am zweiten Tag nach der Wiederbelebung würden die meisten Kolonien an der Oberfläche befestigt sein. Komplettes Medium durch hiPSC-Medium mit 25 ng/mL bFGF austauschen. In den folgenden Tagen werden hiPS-Kolonien sichtbar sein.
      HINWEIS: Es dauert mindestens eine Woche, bis hiPSCs wiederbelebt werden und Kolonien mit glatten, gut definierten Grenzen, einheitlicher Zellmorphologie und einem dichten Koloniezentrum bilden.
  3. Passagierende Down-Syndrom-hiPSCs und isogene euploide hiPSCs an Feedern
    HINWEIS: Alle Reagenzien sollten warm sein, bevor sie beginnen. Vermeiden Sie übermäßiges Pipettieren von Zellen. Gehen Sie sehr schonend mit den Zellen um.
    1. Passage HiPSCs, wenn die meisten Kolonien ineinander übergehen oder wenn zu viele differenzierte Kolonien entstehen. In der Regel muss die Spaltung innerhalb von 5-7 Tagen nach der ersten Passage durchgeführt werden.
    2. Beleben Sie ein Fläschchen mit Futterautomaten einen Tag vor dem Teilen.
    3. Geben Sie eine Wäsche mit 1 ml/Vertiefung warmem DMEM/F12 in die Feeder und fügen Sie 2 ml/Vertiefung warmes hiPSCs-Medium hinzu, ergänzt mit 25 ng/ml bFGF. Lassen Sie die Platte mindestens 2 Stunden lang bei 37 °C im CO2 -Inkubator, bevor Sie hiPSCs plattieren.
    4. Beobachten Sie die Platte mit hiPS-Zellen auf differenzierte Kolonien und entfernen Sie die differenzierte Kolonie durch Verschrotten mit einer 200-μl-Pipette unter einem Stereomikroskop.
    5. Geben Sie hiPSCs eine Wäsche mit 1 mL/gut warmem DMEM/F12.
    6. Gießen Sie 1 ml/Vertiefung mit 1 mg/ml Kollagenaselösung. Lassen Sie die Platte 8-10 Minuten lang im Inkubator und beobachten Sie dann unter einem inversen Mikroskop die losen Ränder der Bienenvölker.
    7. Aspirieren Sie die Kollagenase und geben Sie 2 Wäschen DMEM/F12. Geben Sie dann 1 ml/Vertiefung hiPSC Medium hinzu.
    8. Schneiden Sie die Kolonien vorsichtig 8-10 Mal horizontal und vertikal in einer Vertiefung mit der Spitze einer 2-ml-Spritze. Beobachten Sie die Völker unter einem inversen Mikroskop, um zu überprüfen, ob die meisten Völker auf die richtige Größe zugeschnitten wurden.
    9. Wenn die Bienenvölker ausreichend geschnitten sind, heben Sie die Bienenvölker vorsichtig mit einem Zellheber an.
    10. Pipettieren Sie die Kolonien vorsichtig mit einer 1-ml-Spitze in der Vertiefung, 5-8 Mal, je nach Größe der Kolonien.
    11. Sammeln Sie alle Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 100 x g.
    12. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette, lösen Sie das Zellpellet durch vorsichtiges Klopfen auf das Röhrchen und fügen Sie 200 μl hiPSC-Medium mit 25 ng/mL bFGF und 10 μM RI hinzu. Pipettieren Sie 2-3 Mal mit der 200 μL Pipette und fügen Sie 300 μL mehr hiPSC Medium mit 25 ng/mL bFGF und 10 μM RI hinzu.
    13. Plattieren Sie nun diese Zellen vorsichtig über die Feeder, die hiPSC-Medium + 25 ng/ml bFGF enthalten. Eine Vertiefung kann in 1:2 oder 1:3 aufgeteilt werden, abhängig von der Anzahl der vorhandenen Völker nach der Entfernung differenzierter Völker. Beschriften Sie die Platte mit dem Namen der Zelle, der Durchgangsnummer, dem Namen des Forschers und dem Datum.
    14. Während Sie die Platte im CO2 -Inkubator halten, schütteln Sie die Platte 2-3 Mal von vorne, hinten und seitlich, um eine homogene Verteilung der Zellen zu erreichen.
    15. Am nächsten Tag waschen Sie einmal sanft mit warmem DMEM/F12 und fügen Sie 2,5 mL hiPSC-Medium mit 25 ng/mL bFGF hinzu.
  4. Einfrierender Down-Syndrom-hiPSCs und isogener euploider hiPSCs aus Feedern
    HINWEIS: Ein Überpipettieren von humanen iPS-Zellen sollte während des Einfriervorgangs vermieden werden.
    1. Splitten Sie hiPSCs, wenn sie sich noch in ihrer logarithmischen Phase befinden, d.h. 4-5 Tage nach der Passage.
    2. Beobachten Sie die Platte mit hiPSCs auf differenzierte Kolonien und entfernen Sie die differenzierten Kolonien mit einer 200-μl-Pipette unter einem Stereomikroskop.
    3. Geben Sie hiPSCs eine Wäsche mit 1 mL/gut warmem DMEM/F12.
    4. Fügen Sie 1 ml/Well 1 mg/ml Kollagenaselösung hinzu. Lassen Sie die Platte 8-10 Minuten lang im Inkubator und beobachten Sie dann unter einem inversen Mikroskop, ob die Ränder der Völker angehoben werden.
    5. Aspirieren Sie die Kollagenase und geben Sie 2 Wäschen DMEM/F12. Geben Sie dann 1 ml/Vertiefung hiPSC Medium hinzu.
    6. Heben Sie die Kolonien vorsichtig mit einem Zellheber an.
    7. Pipettieren Sie die Kolonien vorsichtig in der Vertiefung mit einer 1-ml-Spitze 5-8 Mal, je nach Größe der Völker.
    8. Sammeln Sie alle Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 2 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 100 x g.
    9. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette, lösen Sie das Zellpellet durch vorsichtiges Klopfen auf das Röhrchen und fügen Sie 1 ml hiPSC-Medium ohne Antibiotikum hinzu, das mit 25 ng/mL bFGF gemäß der Anzahl der Vertiefungen ergänzt wird. Geben Sie die Zellen in Kryoröhrchen ab.
    10. Geben Sie hiPSC Medium ohne Antibiotikum, ergänzt mit 25 ng/ml bFGF und 20 % DMSO in die Kryoröhrchen, um eine Endkonzentration von 10 % DMSO zu erreichen.
    11. Stellen Sie die Kryofläschchen in ein frostiges Wasser mit einem Isopropanolbad, um ein langsames Einfrieren zu gewährleisten.
    12. Den Frost über Nacht bei -80 °C halten. Füllen Sie die Fläschchen am nächsten Tag in den LN2-Tank um.

2. Neuronale Differenzierung

HINWEIS: Vorbereitung des Feeder-Conditioned Medium (FCM): Verwenden Sie einen T-75-Kolben und eine Platte mit 4 x 106 Feederzellen pro Kolben. Am nächsten Tag fügen Sie 40 mL hiPSC-Medium mit 4 ng/mL bFGF hinzu. Sammle 7 Tage lang. Lagern Sie jede Tagessonde bei -20 °C für bis zu 1 Monat. Eine 15 cm große Schale mit 10 ml 0,1 % Gelatine bei 37 °C für mindestens 2 Stunden bestreichen, bevor die Zellen dissoziiert werden. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte 1 Tag vor der Dissoziation der Zellen mit einer hESC-qualifizierten Basalmembranmatrix (im Folgenden als "qualifizierte Matrix" bezeichnet). Bei der Dissoziation von Zellen im gesamten Protokoll fügen Sie 10 μM RI zur Zellablösungslösung (siehe Materialtabelle), DPBS und dem Beschichtungsmedium (FCM, ergänzt mit 25 ng/ml bFGF) hinzu. Bereiten Sie für jede Differenzierung frisches Feeder-konditioniertes Medium (FCM) vor. Vermeiden Sie übermäßiges Pipettieren von hiPS-Zellen.

  1. Day In vitro (DIV) 2: Herstellung von Einzelzellen und Aussaat von hiPSCs für die Neurodifferenzierung
    1. 10 μM RI werden in hiPSC-Medien gegeben, die mit 25 ng/ml bFGF, DPBS, Zellablösungslösung und Feeder-konditioniertem Medium, ergänzt mit 25 ng/ml bFGF, ergänzt werden. Erwärmen Sie alle diese Reagenzien auf 37 °C.
    2. Nehmen Sie eine 6-Well-Platte mit iPSCs auf die Feeder, entfernen Sie differenzierte Kolonien und fügen Sie frisches hiPSC-Medium hinzu, das mit 25 ng/ml bFGF und 10 μM RI ergänzt wird. Bewahren Sie die Platte 2 Stunden im Inkubator auf.
    3. Nehmen Sie die iPSCs-Platte nach 2 h heraus und waschen Sie sie einmal mit DPBS ohne Ca++ und Mg++.
    4. Fügen Sie 1 ml/Well-Zellablösungslösung (+ 10 μM RI) hinzu und lassen Sie die Platte 12-14 Minuten lang im CO2 -Inkubator.
    5. Nach 12-14 Minuten beobachten Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop; Die meisten Zellen beginnen, sich von der Platte zu lösen. Wenn noch einige Zellen anhaften, klopfen Sie vorsichtig von den Seiten auf die Platte.
    6. Verdünnen Sie die Zellablösungslösung durch Zugabe von 3 ml/Well DPBS mit Ca++ und Mg++ (+ 10 μM RI). Führen Sie mit einer 5-ml-Pipette 2-3 Mal sanftes Pipettieren durch und vermeiden Sie dabei Blasen, die Klumpen aufbrechen.
    7. Die Zellen werden durch ein 40 μM Sieb geleitet.
    8. Sammeln Sie die Zellen in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
    9. 5 min bei Raumtemperatur bei 200 x g zentrifugieren und das Medium mit VAS schonend ansaugen.
    10. Resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL hiPSC-Medium (+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM RI). Geben Sie die Zellen für 1,5 h in eine mit 0,1 % gelatinebeschichtete 15-cm-Schale, um Feeder zu entfernen, da Feeder im Vergleich zu hiPSCs eine bevorzugte Haftung auf der gelatinebeschichteten Oberfläche aufweisen.
    11. Nach 1,5 h das Medium mit den Zellen schonend auffangen und bei Raumtemperatur 5 min bei 200 x g zentrifugieren. Aspirieren Sie Medien mit VAS.
    12. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 mL FCM (+ 25 ng/mL bFGF + 10 μM RI) und nehmen Sie die Zellzahl vor.
    13. Unter Verwendung von FCM (+ 25 ng/ml bFGF + 10 μM RI) wird eine Zellsuspension von 30.000 bis 50.000 Zellen/ml hergestellt und eine 5-ml-Zellsuspension/60-mm-Platte oder 2 ml/Vertiefung einer 6-Well-Platte oder 500 μl/Vertiefung einer 24-Well-Platte ausgesät. Die Platten sollten mit einer qualifizierten Matrize beschichtet werden (siehe Materialtabelle).
  2. DIV 0: (~48 h später): Wechsel des Feeder-konditionierten Mediums auf NPC-Medium (DDM + B27 ohne Vitamin A + N2) (siehe Materialtabelle).
  3. DIV 2: NPC-Medium mit 0,125 μM Dorsomorphin jeden zweiten Tag bis DIV 18 hinzufügen.
  4. DIV 18: NPC-Medien ohne Dorsomorphin hinzufügen und jeden zweiten Tag bis DIV 28 auffüllen.
  5. DIV 28-30: Herstellung einzelner Zellen und Seeding von NPCs für Stufe 2
    1. Nehmen Sie bei DIV 28 die Platte (mit NPCs) heraus und ersetzen Sie das Medium durch NPC-Medien (+ 10 μM RI). Legen Sie die Platte für 2 h in den CO2 -Inkubator.
    2. Nach 2 h das Medium ansaugen und einmal mit DPBS (ohne Ca++ und Mg++) waschen.
    3. Fügen Sie 1 ml/Well-Zellablösungslösung (+ 10 μM RI) hinzu und lassen Sie die Platte 14 Minuten lang im Inkubator.
    4. Nach 14 min beobachten Sie die Zellen unter einem inversen Mikroskop bei 4x. Die meisten Zellen beginnen, sich von der Platte zu lösen. Wenn noch einige Zellen anhaften, klopfen Sie vorsichtig von den Seiten auf die Platte.
    5. Verdünnen Sie die Zellablösung, indem Sie 3 ml/Well DPBS mit Ca++ und Mg++ (+ 10 μM RI) hinzufügen. Führen Sie mit einer 5-ml-Pipette 2-3 Mal sanftes Pipettieren durch und vermeiden Sie dabei Blasen, die Klumpen aufbrechen.
    6. Durch ein 40-μM-Sieb führen, das auf ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen aufgesetzt ist.
    7. Bei Raumtemperatur 5 min bei 200 x g zentrifugieren. Medien schonend mit VAS ansaugen.
    8. Resuspendieren Sie die Zellen in DDM + B27 mit Vitamin A (+ 10 μM RI).
    9. Zählen Sie die lebenden Zellen mit Trypanblau mit einem Hämozytometer.
    10. 50.000 Zellen/Well auf einer qualifizierten matrixbeschichteten Platte (1x) der 48-Well-Platte aussäen.
  6. DIV 33: Wechsel des Mediums zum neuronalen Differenzierungsmedium (siehe Materialtabelle). Wechseln Sie das Medium alle 5 Tage. Füllen Sie die Medien bis DIV 85/90 auf.

3. Immunzytochemie (ICC)

HINWEIS: Fügen Sie in allen Phasen genügend Puffer hinzu, um die Zellen abzudecken und ein Austrocknen der Vertiefung während des Aspirierens während der Waschphase zu vermeiden.

  1. Nehmen Sie die differenzierte Zellplatte außerhalb des Zellkulturbereichs heraus.
  2. Saugen Sie das Medium an und waschen Sie es mit DPBS.
  3. Zur Fixierung geben Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in die Zellen. Decken Sie die Platte mit Alufolie ab und legen Sie sie für 30 min bei 37 °C auf einen Wippenschüttler.
  4. Aspirieren Sie PFA und geben Sie drei Wäschen von je 15 Minuten mit DPBS (ohne Ca++ und Mg++).
  5. Blockierungspuffer (3 % BSA + 5 % Eselserum (oder Seren aus dem Wirtstier des Sekundärantikörpers) + 0,2 % Triton-X in DPBS) für 1 h bei Raumtemperatur zugeben.
  6. 250 μl/Vertiefung Primärantikörper [Ki67 (1:100 Verdünnung), TUBB3 (1:500 Verdünnung), PAX6 (1:100)] zugeben und über Nacht bei 4 °C auf einem Wippenschüttler inkubieren. Die Verdünnung erfolgte in einer Blocklösung.
  7. Nach der Inkubation des primären Antikörpers dreimal mit DPBS waschen.
  8. 250 μl/Vertiefung Sekundärantikörper (verdünnt 1:250 in 3 % BSA + 0,2 % Triton-X in DPBS) 1 h lang bei Raumtemperatur zugeben.
  9. Nach der Inkubation von Sekundärantikörpern 3 Mal mit DPBS waschen.
  10. Geben Sie DAPI (1: 1000 Verdünnung von 5 mg/ml Stamm in DPBS) für 15 min bei Raumtemperatur zu. Dreimal mit DPBS waschen. Lassen Sie die letzte Wäsche in der Kulturplatte und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop.

4. Bilderfassung und -analyse

  1. Nehmen Sie Bilder mit dem Fluoreszenzmikroskop mit 20-facher Auflösung auf.
  2. Nehmen Sie Bilder von Ki67 sowie TUBB3-Färbebilder mit einem Anregungsfilter von 540 nm, PAX6 mit einem Anregungsfilter von 488 nm und DAPI-Bilder mit einem Anregungsfilter von 358 nm auf.
  3. Erfassen Sie Bilder aus zehn verschiedenen Zufallsfeldern für die Analyse.
  4. Analysieren Sie ICC-Bilder mit der ImageJ-Software.
  5. Führen Sie für die TUBB3- und PAX6-Analyse einen Schwellenwert für alle Bilder für die roten bzw. grünen Signale und die blaue Signalintensität für DAPI durch. Die mittlere Intensität der roten Pixel von TUBB3 und der grünen Pixel von PAX6 wurde mit der mittleren Intensität der blauen Pixel von DAPI normiert.
  6. Für die Ki67-Analyse zählen Sie die Zellen mit der automatischen Zellzählerfunktion in der ImageJ-Software. Normalisieren Sie die Anzahl der Ki67-positiven Zellen mit der Anzahl der DAPI-positiven Zellen.
  7. Führen Sie statistische Analysen mit Hilfe von Statistik- und Grafiksoftware durch, indem Sie die beiden Gruppen mit ungepaarten t-Tests vergleichen. Die Daten sollten als Mittelwert ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten ausgedrückt werden. Ein p-Wert von weniger als 0,05 gilt als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Singularisierte humane iPSCs wurden als Einzelzellsuspensionen auf qualifizierte matrixbeschichtete Schalen ausgeimpft, und die Differenzierung wurde durch die Entfernung von bFGF eingeleitet. Um die nicht-ektodermale Differenzierung zu hemmen, wurde Dorsomorphin, ein BMP-Signalinhibitor, aus DIV 2-1821 zugesetzt. Zur weiteren Differenzierung von Vorläuferzellen aus dem neurogenen Stadium wurden Einzelzellsuspensionen mit geringer Dichte auf der qualifizierten Ma...

Diskussion

In dieser Arbeit wird ein effizientes ungerichtetes monolayer-kortikales Neurodifferenzierungsprotokoll für ein isogenes Paar aus euploiden hiPSCs und DS hiPSCs beschrieben. Da die Zellen als Monoschichten gezüchtet werden, sind sie stärker Kulturbedingungen ausgesetzt, was nicht in gleichem Maße möglich ist wie die Verwendung von Embryoidkörpern zur Differenzierung von iPSCs, die in der Regel in anderen Protokollen verwendet werden14,16

Offenlegungen

Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.

Danksagungen

Die Autoren danken Prof. Stuart H. Orkin für die Bereitstellung eines Paares von Down-Syndrom und isogenen euploiden hiPSCs. Die Autoren danken auch dem National Centre for Cell Science (BRIC-NCCS) in Pune für die Bereitstellung von Mitteln für die Durchführung dieser Arbeit.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
MEF medium:
DMEM High GlucoseGibco11965-092
FBSVWR97068-08510% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-MercaptoethanolGibco21985-0231X final concentration
hiPSC medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Knockout Serum Replacement (KOSR)Gibco10828-02820% final concentration
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
β-Mercaptoethanol (1000X)Gibco21985-0231X final concentration
DDM medium:
Knockout DMEM/F12Gibco 12660-012
Non-Essential Amino AcidsHycloneSH30238.011X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X final concentration
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X final concentration
Albumax (10%)Invitrogen 11020-0210.5 X of 10% Albumax is final concentration
NPC medium:
DDM medium
N2 SupplementGibco 175020481X final concentration
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AGibco 125870101X final concentration
Neural Differentiation medium (ND):
DDM medium1/2 of volume
Neurobasal MediumGibco 21103-0491/2 of volume
N2 SupplementGibco 175020480.5 X final concentration
B-27 Supplement (50X)Gibco 175040440.5 X final concentration
GlutamaxGibco 350500611X of Neurobasal medium
Penicillin/StreptomycinHycloneSV300101X of Neurobasal medium
Antibodies and reagents for immunostaining:
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G4%
DPBS, no calcium, no magnesiumSigma-AldrichD5652
Triton-X-100 SolutionSigma-AldrichX100-500ML0.20%
BSAHycloneA7979-50ML1.00%
Purified anti-tubulin β-3 (TUBB3) (TUJ1)BioLegend8012021:500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa fluor 594 conjugateLife Tech Invitrogen A212031:250 dilution
Purified Mouse-Anti-Human Ki67BD Pharmingen5506091:100 dilution
Purified anti-PAX6BioLegends9013021:100 dilution
Alexa fluor 488 Donkey (anti-rabbit)Life Tech Invitrogen A212061:250 dilution
DAPI Solution (5 mg/mL)SigmaD95421:1000 dilution
Others
Cell detachment solution (Accutase) Gibco A11105-01Ready to use working solution
Rock inhibitor (RI) Sellechckem Y2763210 mM/ml final concentration
Dorsomorphin Sellechckem S73060.125 nM/ml final concentration
DPBS with calcium and magnisium (DPBS+ Ca, Mg)Gibco 14040133Ready to use working solution
DPBS without calcium and magnisiumGibco 14190136Ready to use working solution
Gelatin Type ASigma G2500-100G0.10%
hESC-qualified basement membrane matrix (Matrigel GFR) Corning 3562301 mg stock vial diluted 1:240
Trypsin 0.05%Gibco25300054
Trypan BlueGibco15250-0610.40%
Basic Fibrablast Growth Factor (bFGF)Peprotech 100-18B25 ng/ml final concentration
Collagenase Gibco 17104-0191mg/ml final concentration

Referenzen

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