JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لإنشاء طعوم بيضاء الدم الليمفاوية الحادة البشرية (ALL) واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من خطوط الخلايا ومواد المريض الطازجة في أجنة أسماك الزرد المثبطة للمناعة بشكل عابر ، جنبا إلى جنب مع إرشادات لتقييم الاستجابة للأدوية باستخدام قياس التدفق الخلوي. يمكن أيضا تكييف خط الأنابيب التجريبي للأورام الصلبة.

Abstract

زرع أسماك الزرد هو تقنية محورية للتحقيق في التسبب في السرطان البشري والتنبؤ باستجابات الأدوية الفردية. يقدم هذا المستند بروتوكولا مبسطا (ZefiX) لتوسيع عينات مرضى ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد (BCP-ALL) أو خطوط الخلايا الخالدة في أجنة أسماك الزرد المثبطة للمناعة بشكل عابر ، باستخدام قياس التدفق الخلوي لتحليل خلية واحدة عالي الدقة لاستجابات العلاج. بالمقارنة مع تطعيم الورم الصلب ، تستفيد خلايا سرطان الدم بشكل كبير من قمع قليل النوكليوتيدات القائم على المورفولينو المضاد للحساسية للبلاعم وعوامل تمايز العدلات أثناء الفحص. يتيح تحليل قياس التدفق الخلوي لخلايا الكسب غير المشروع المنفصلة تقييما دقيقا لعدد الخلايا ومعدل التكاثر والحيوية بعد العلاج على أساس كل خلية. تم التحقق من صحة هذا النهج باستخدام العلاجات المستهدفة مثل فينيتوكلاكس وداساتينيب ، مع نتائج العلاج مقارنة بالسجلات السريرية لعينات المرضى ذات الصلة وضوابط الثقافة ثنائية الأبعاد التقليدية. والجدير بالذكر أن البروتوكول يكتمل في غضون 7 أيام ، بما يتماشى مع الجداول الزمنية لاتخاذ القرار السريري. المنهجية قابلة للتكيف لاختبار أدوية مختارة في أنواع مختلفة من السرطان ، بما في ذلك الأورام الصلبة ، وبالتالي دعم الاستراتيجيات العلاجية الشخصية. ومع ذلك ، يجب النظر في القيود المفروضة على عدد الأدوية التي يمكن تقييمها ، على الأرجح بسبب قيود الحرائك الدوائية في أجنة أسماك الزرد.

Introduction

أصبح زرع أسماك الزرد نموذجا حاسما في الجسم الحي لفهم التسبب في السرطان والتنبؤ باستجابات الأدوية1،2،3،4،5. تظل النماذج الحيوانية حاسمة لاختبار الأدوية قبل السريرية ، ويوفر نموذج أسماك الزرد مزايا كبيرة مقارنة بالأنظمة الأخرى في الجسم الحي ، بما في ذلك الإنتاجية العالية والكفاءة من حيث التكلفة6،7،8.  يمكن أن يساعد هذا النموذج أيضا في تنبؤات الاستجابة الشخصية للعلاج ، بما في ذلك العلاجات الجزيئية المستهدفة والعلاج بالخلايا التائية ذات مستقبلات البرويناتور9،10،11،12.

يمكن أن يستفيد BCP-ALL بشكل خاص من تطعيم زيور أسماك الزرد ، حيث لا يزال توسيع خلايا المريض الأولية في المزرعة يمثل تحديا13. هناك حاجة لا يمكن إنكارها لأساليب علاجية جديدة في ابيضاض الدم اللمفاوي الحاد. على الرغم من ارتفاع معدل مغفرة بنسبة 80٪ -85٪ لدى الأطفال المصابين ب BCP-ALL ، فإن معدلات البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل للمرضى الذين يعانون من مرض انتكاسي أو مقاوم للعلاج تتراوح فقط بين حوالي 30٪ -60٪ 14،15،16. في مثل هذه الحالات ، يمكن دمج اختبار الأدوية باستخدام خط الأنابيب المقترح في البيئة السريرية لتحديد العلاج الأمثل الخاص بالمريض14،15. يمكن أن يكون هذا النهج الشخصي حاسما عند التعامل مع مقاومة الأدوية المتعددة ، مما يقلل بشكل كبير من عبء العلاج على المرضى عن طريق تجنب الأدوية غير الفعالة أو دون المستوى الأمثل ذات الآثار الجانبية الشديدة.

العديد من الميزات تجعل تطعيم جنين الزرد نموذجا مناسبا. أوجه التشابه الجينية بين البشر وأسماك الزرد - 70٪ تماثل جيني و 84٪ جينات مشتركة مرتبطة بالأمراض - تدعم دراسات التفاعل بين الجينات والأدوية17. وبالتالي ، يمكن أن يكشف استخدام جنين مضيف معدل وراثيا عن الاستعدادات الوراثية التي تؤثر على القابلية للإصابةبالمخدرات 18. بدلا من ذلك ، يمكن زرع الخلايا ذات التعديلات الجينية المحددة لتقييم ما إذا كانت حساسية الدواء أو مقاومته تتوافق مع النتائج المختبرية . توفر الطعوم الغريبة لجنين الزرد أيضا نظرة ثاقبة على الآثار الجهازية المحتملة للأدوية. على الرغم من أن نمو الأعضاء في الأجنة البالغة من العمر 2-3 أيام لم ينضج تماما ، إلا أن الأعضاء موضعية بشكل صحيح وتشارك جزئيا في التركيب الخلوي مع نظرائهم البالغين19.

تشمل المزايا الإضافية لهذا النموذج أن هناك حاجة إلى عدد قليل فقط من الخلايا السرطانية للنقش ، والحفاظ على الأجنة المضيفة أمر بسيط ، حيث لا يلزم التغذية خلال الأيام الخمسة الأولى من الحياة ، ويمكن تقييم نجاح الحقن بسرعة بسبب شفافية الأجنة وحجمها. الميزة الفريدة هي أن المناعة الفطرية فقط هي النشطة في هذه المرحلة التنموية ، مما يسهل النقش الفعال20. في بروتوكول ZefiX الموصوف هنا (انظر الملخص في الشكل 1) ، يتم تعزيز نقص المناعة بشكل أكبر عن طريق قمع الجهاز المناعي الفطري خلال الأيام الأربعة الأولى من الحياة باستخدام قليل النوكليوتيدات المورفولينو المضادة للمعنى المستقرة التي تستهدف spi1 و csf3r ، والتي تمنع تمايز البلاعم والعدلات21،22،23.

يختلف هذا البروتوكول أيضا عن بروتوكولات زرع الأجانب السابقة لأسماك الزرد ، والتي تم تطويرها بشكل أساسي لترقيع الورم الصلب وعادة ما تستخدم طرق تقييم الاستجابة للأدوية القائمة على التصوير الكامل. تم تحسين ZefiX للخلايا السرطانية السائلة ، مثل خلايا BCP-ALL ، وقد تم استخدامه بنجاح لتوسيع مواد المريض الطازجة أو المجمدة21. يمكن أيضا تكييف ZefiX للخلايا السرطانية الملتصقة عن طريق اختيار الإنزيمات المناسبة لتفكك الأنسجة.

ميزة رئيسية أخرى هي التحليل النهائي باستخدام قياس التدفق الخلوي ، والذي يوفر العديد من الفوائد: (1) يمكن معالجة عدد كبير من خلايا الكسب غير المشروع بسرعة ، مما يسمح بتحليل إحصائي قوي على مستوى الخلية المفردة ، (2) يمكن تقييم معدل الانتشار والجدوى في وقت واحد في الخلايا الفردية ، و (3) تتوفر مقاييس التدفق الخلوي بشكل شائع في إعدادات البحث السريري ، تمكين تقييم الاستجابة الدوائية لخلايا الكسب غير المشروع على مستوى خلية واحدة في غضون ساعات قليلة. لضمان قابلية التكاثر ، يوفر هذا البروتوكول خط أنابيب موحد من التحضير إلى الزرع إلى تحليل قياس التدفق الخلوي ، مما يسمح بالتنبؤ باستجابة الدواء في جميع الخلايا في غضون أسبوع.

Protocol

تتوافق جميع تجارب أسماك الزرد مع إرشادات معاهد أبحاث الطب التجريبي في برلين والسلطات الرسمية. شملت جميع الدراسات أجنة أسماك الزرد < 6 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، مما أعفيها من قانون حماية. تم إيواؤها عند 28 درجة مئوية مع دورة ضوء 14 ساعة و 10 ساعات مظلمة. تم استخدام الأسماك البرية من سلالات AB أو TüLF في جميع التجارب.

ملاحظة: يتضمن تحديد ظروف العلاج المثلى لكل دواء مرغوب فيه قبل تطبيق ZefiX عدة خطوات ضرورية. أولا ، حدد التركيز المثبط نصف الحد الأقصى (IC50) لكل دواء باستخدام خط خلوي مناسب ضمن نظام ثقافة ثنائي الأبعاد التقليدي. بناء على الخبرة السابقة ، قد تكون تركيزات الأدوية الفعالة لعلاج ZefiX أكبر بمقدار 5 - 50 مرة من تلك المستخدمة في ظروف زراعة الخلاياالنموذجية 21،24. قبل علاج الأجنة المطعمة ، من الضروري تقييم السمية داخل الأجنة المضيفة غير المزروعة باستخدام نطاق التركيز المحدد. بعد تقييم السمية ، قم بتعريض الأجنة المطعمة بخط الخلية لمجموعة متنوعة من تركيزات الأدوية بحوالي 50 ضعفا من قيمة IC50 المحددة مسبقا في ثقافة 2D. إذا لم تظهر الخلايا المطعمة أي استجابة لجرعات تصل إلى 100 ضعف IC50 ، فقد يعتبر الدواء غير فعال ل ZefiX. لتعزيز الفعالية ، يتمثل أحد الخيارات في التكييف المسبق لخلايا الكسب غير المشروع بالدواء قبل وقت قصير من زرعها في الأجنة25. انظر الجدول 1 للاطلاع على جميع الحلول المستخدمة هنا.

1. اليوم 1: التحضير للتجربة

  1. تحضير متوسط E3: قم بإعداد 2 لتر من وسط E3 المعقم لاستخدامه في صيانة الأجنة.
  2. تحضير قليل النوكليوتيدات المورفولينو المضادة للمعنى (MO): قم بإعداد محلول مخزون 50 ميكرومتر يحتوي على كل من MOs في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل باستخدام ماء خال من النوكلياز. قم بتخزين محلول المرق في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بإعداد MOs للحقن عن طريق احتضان المحلول على كتلة تسخين عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يتم توجيه MOs ضد spi1 و csf3r لتثبيط تمايز خلايا البلاعم والعدلات ، كما هو موضح في المراجع22،23،26.
  3. تحضير لوحات الحقن
    1. لتحضير 4-5 أطباق ، قم بإذابة 1٪ agarose في وسط E3 لإنشاء محلول 100 مل. بالنسبة لألواح الزرع ، اسكب ~ 20 مل من المحلول في كل طبق بتري مقاس 10 سم ، مع التأكد من أنها نصف ممتلئة. حرك لتوزيع السائل بالتساوي.
    2. بالنسبة لألواح حقن مورفولينو ، ضع قالب الحقن على سائل الاغاروز في طبقين من بتري ، مع ضمان عدم تكوين فقاعات. غطي الأطباق عن طريق إمالة الأغطية واتركيها في RT حتى يتجمد الاغاروز. بمجرد التصلب ، قم بإزالة القالب وتخزين الألواح رأسا على عقب عند 4 درجات مئوية في كيس بلاستيكي محكم الغلق.
  4. تحضير إبر الحقن
    1. لحقن مورفولينو: قم بتوليد إبر من الشعيرات الدموية مقاس 10 سم باستخدام مجتذب إبرة وقطع الأطراف لتحقيق قطر يقدر ب 10 ميكرومتر (كما هو موضح في27).
    2. لزرع الخلايا: استخدم إبر الحقن ذات النهاية الحادة المسحوبة مسبقا المتوفرة تجاريا بقطر خارجي 20 ميكرومتر.
  5. زراعة خلايا الكسب غير المشروع: خلايا منقسمة (على سبيل المثال ، Nalm6) تهدف إلى كثافة مستهدفة تبلغ 70٪ -80٪ في اليوم 4 في قارورة زراعة الخلايا T175 مع وسط RPMI مكمل بنسبة 10٪ FCS و 1٪ P / S (RPMI-كامل). قم بتقسيم الخلايا 3-4 مرات قبل الاستخدام لضمان معدل التكاثر المناسب.
    ملاحظة: لتحضير مواد المريض الطازجة أو الطازجة / المجمدة للزراعة ، يمكن العثور على التعليمات في الخطوة 4.3. ثم يتم تحضير الخلايا في يوم الزرع.
  6. تربية أسماك الزرد: قم بإعداد أسماك الزرد البرية في أحواض التكاثر في فترة ما بعد الظهر ، مع الحفاظ على فصل الذكور والإناث.
    ملاحظة: تم تربية أسماك الزرد وتنظيمها كما هو موضح في المرجع28. تشير مراجع الوقت (hpf أو dpf) إلى ساعات أو أيام بعد الإخصاب.

2. اليوم 2: حقن مورفولينو

  1. استكمل 500 مل من وسط E3 المعقم ب 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (E3 / P / S) واملأ طبقين بتري مقاس 10 سم. أخرج طبق الحقن من الثلاجة للتسخين المسبق في RT.
  2. فتح بوابة متداخلة لخزانات التكاثر بحيث لا يمكن أن يتم الإخصاب إلا في جزء صغير من الخزانات في وقت واحد (اعتمادا على سرعة الحقن) لضمان الحقن المجهري في الوقت المناسب لمحلول مورفولينو في أجنة أسماك الزرد في مرحلة الخلية الواحدة28،29. ابدأ بفتح بوابة أو بوابتين حسب سرعة الحاقن ، عندما يتم حقن دفعة واحدة من البيض بسهولة ، افتح بوابة أخرى أو بوابتين وهكذا دواليك.
  3. انقل البيض المخصب على دفعات من 100 مع أقل قدر ممكن من السوائل إلى لوحة الحقن المصنوعة مسبقا. قم بمحاذاة الأجنة في أخاديد اللوحة.
  4. حقن 1 نانولتر من مزيج 50 ميكرومتر من كل من مورفولينوس في الخلية أو كيس الصفار أسفل الخلية مباشرة خلال مرحلة الخليةالواحدة 29. حقن بويضات كافية للإجراءات اللاحقة (على سبيل المثال ، بالنسبة لطبق واحد مكون من 96 بئرا ، قم بحقن ما يصل إلى 200 بيضة للحصول على نسخة احتياطية كافية للتسرب المحتمل قبل الزرع).
  5. انقل البيض المحقون إلى أطباق بتري التي تحتوي على E3 / P / S. احتضان البيض المحقون عند 28 درجة مئوية. احتفظ بالبويضات غير المحقونة كأسماك تحكم لتحليل قياس التدفق الخلوي عند 5 dpf. قم بتخزين الوسط المتبقي E3 / P / S عند 4 درجات مئوية.

3. اليوم 3: إزالة المشيمة

  1. إزالة المشيمة من أجنة الزرد: إزالة المشيمة يدويا من الأجنة عندما يكون حجمها أكبر من 24 hpf باستخدام ملقطين دقيقين29.
    1. قم بإزالة أي أجنة ميتة لا تظهر عليها نبضات قلب أو حركة وتبدو معتمة أو أجنة ذات أشكال غير منتظمة من الأطباق باستخدام ماصة باستور.
    2. اضغط على المشيمة بملقط دقيق لتثبيتها في مكانها. اضغط بجوار طرف الملقط الدقيق ، وأمسك الجنين في مكانه باستخدام الملقط الثاني ، واسحب المشيمة بعناية لتحرير الجنين
      ملاحظة: لإزالة الأجنة التي يقل وزنها عن 24 حصانا ، يجب حفظها على طبق مغطى بالأغروز لمنعها من الالتصاق بالبلاستيك. يفضل إزالة المشيمة يدويا لأنه ألطف للأجنة. تم وصف طريقة بديلة لإزالة التشييق الأنزيمي في مكان آخر30.
  2. احتضان الأجنة منزوعة المشيمة عند 28 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

4. اليوم 4: زراعة الأعضاء والعلاج بالعقاقير

  1. تحضير الأجنة المضيفة: قم بإزالة ألواح الاغاروز المحضرة و E3 / P / S من الثلاجة واسمح لها بالوصول إلى RT. فحص الأجنة لمرحلة النمو المناسبة عند 48 hpf باستخدام مجهر استريو. قم فقط بتضمين الأجنة المرحلية بشكل صحيح والنموذجية شكليا في سير العمل ، كما هو موضح في مكان آخر29. عد جميع الأجنة السليمة وخطط لمزيد من العلاج. احتفظ بأكثر من 100 جنين لكل طبق بتري 10 سم عند 28 درجة مئوية لتجنب سرعات النمو غير المتكافئة الناجمة عن نقص الأكسجين.
    ملاحظة: اتبع الخطوة 4.2. لخطوط الخلايا. بالنسبة للمواد الطازجة / المجمدة ، انتقل مباشرة إلى الخطوة 4.3.
  2. تحضير خطوط الخلايا
    1. لتحضير خلايا BCP-ALL المصنفة بالفلورسنت لقياس التدفق الخلوي والزرع ، اغسل الخلايا (من الخطوة 1.5.) باستخدام 1x PBS: جهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليقه في 20 مل من PBS.
    2. عد الخلايا ونقل 3 × 105 خلايا غير ملوثة إلى أنبوب FACS لليوم 0 (0 أيام بعد الحقن ، نقطة في البوصة) تحليل قياس التدفق الخلوي. تخزينها على الثلج.
    3. لوحة 3 × 105 خلايا في 3 مل من RPMI- كاملة في بئر واحد من لوحة 6 آبار والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية للتحكم 3 نقطة في البوصة.
    4. انقل 1 × 107 خلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل لوضع العلامات على CTV. جهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند RT ، اسكب المادة الطافية (استخدم ماصة للباقي) ، وأعد تعليق الحبيبات في 2.5 مل من PBS (RT) مع 1 ميكرولتر من محلول مخزون CTV.
    5. احتضن لمدة 5 دقائق في الظلام عند 37 درجة مئوية ، وأوقف التفاعل ب 12.5 مل من RPMI-complete ، ثم احتضن لمدة 10 دقائق في الظلام عند 37 درجة مئوية.
    6. جهاز طرد مركزي بوزن 350 × جم لمدة 5 دقائق عند RT واغسله مرة واحدة ب 10 مل من RPMI-complete. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى وإعادة التعليق في 10 مل من RPMI-كاملة.
    7. قم بتصفية الخلايا باستخدام مرشح 10 ميكرومتر عن طريق الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات ، وعد الخلايا ، وانقل 3 × 105 خلايا تحمل علامة CTV إلى أنبوب FACS. لوحة 3 × 10 ^ 5 خلايا مع 3 مل من RPMI-كاملة في بئر واحد من صفيحة 6 آبار والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية للتحكم في الانتشار 3 نقاط في البوصة. قم بتخزين الخلايا المتبقية في 1 مل من PBS على الجليد حتى الزرع.
  3. تحضير مواد المريض الطازجة / المجمدة
    1. قم بتسخين أنبوبين للطرد المركزي سعة 15 مل مسبقا مع 10 مل من RPMI- يكتمل كل منهما عند 37 درجة مئوية. قم بإذابة قارورة تحتوي على 5-10 ×10 6 خلايا في حمام مائي 37 درجة مئوية.
    2. بمجرد بقاء كمية صغيرة فقط من الجليد ، انقل الخلايا إلى أنبوب الطرد المركزي باستخدام الوسط الدافئ مسبقا. جهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في RT ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في الأنبوب الثاني من RPMI-Complete الدافئ مسبقا.
    3. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام تريبان بلو. Aliquot 1x 10 ^ 5 خلايا في أنبوب طرد مركزي سعة 1,5 مل وجهاز طرد مركزي هذا الجزء من الخلايا في أنبوب FACS عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في RT ، وتخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 300 ميكرولتر من PBS.
    4. قم بتخزين الكمية المعلقة على الجليد كعنصر تحكم غير معالج لتحليل قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: إذا سمح حجم العينة الكافي ، فحافظ على تحكم غير معالج في المزرعة لقياس قياس التدفق الخلوي في اليوم 7.
    5. أضف 1 ميكرولتر من محلول مخزون CTV إلى 2.5 مل من PBS (RT) لكل 1 × 106 خلايا. اضبط مستوى صوت محلول مخزون CTV في حالة توفر عدد أقل من الخلايا.
    6. احتضان الخلايا باستخدام CTV لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في الظلام ، وأوقف التفاعل بإضافة 12.5 مل من RPM المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) كاملة واحتضانها لمدة 10 دقائق في الظلام عند 37 درجة مئوية.
    7. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في RT واغسل الخلايا مرة واحدة ب 10 مل من RPMI-complete. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في RT وإعادة تعليق الخلايا في 10 مل من RPMI-complete.
    8. قم بتصفية معلق الخلية في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل باستخدام مرشح 10 ميكرومتر وجهاز طرد مركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق.
    9. لا تتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات وعد الخلايا. انقل 3 × 105 خلايا تحمل علامة CTV إلى أنبوب FACS واحد.
    10. الطرد المركزي للخلايا المتبقية عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في RT وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا المتبقية في 1 مل من PBS وخزنها على الثلج حتى استخدامها في الزرع.
      ملاحظة: إذا بقيت خلايا كافية إيجابية CTV ، فيمكن الحفاظ عليها في ثقافة ثنائية الأبعاد موازية للطعوم الغريبة لمقارنة معدل الانتشار.
  4. قياس قياس التدفق الخلوي
    ملاحظة: يجب إجراء قياس التدفق الخلوي عند 0 نقطة في البوصة بواسطة شخص ثان لتقليل الوقت الذي تبقى فيه الخلايا على الجليد قبل الزرع. قبل قياس قياس التدفق الخلوي الأول باستخدام لوحة التلوين المعينة (CTV و CD19-Alexa488 و APC-Annexin V و 7AAD) ، قم بإجراء اختبار تعويض باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
    1. قم بإعداد أنبوبين من FACS على النحو التالي: الأنبوب 1: خلايا التحكم غير الملوثة ؛ الأنبوب 2: الخلايا الملطخة ب CTV و CD19 و 7AAD و Annexin.
      ملاحظة: التلوين والتسميات: يحدد CellTrace Violet (CTV) خلايا الكسب غير المشروع المصنفة مقابل خلايا الأسماك المضيفة ويقيم معدل التكاثر بعد 3 أيام. يعمل الجسم المضاد CD19 ، وهو علامة على سطح الخلية ، كعلامة إضافية لتحديد خلايا الكسب غير المشروع BCP-ALL البشرية. بالنسبة لأنواع السرطان الأخرى ، قد تكون هناك حاجة إلى أجسام مضادة بديلة للعلامات. يشير الملحق V إلى موت الخلايا المبرمج في المرحلة المبكرة لتقييم بقاء الخلية. 7AAD يشير إلى موت الخلايا المبرمج أو النخر في المرحلة المتأخرة لتقييم بقاء الخلية.
    2. أنابيب الطرد المركزي (إحداها تحتوي على خلايا ملطخة ب CTV والأخرى خلايا غير ملطخة) عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في RT وتخلص من المادة الطافية من الأنبوب 1. أعد تعليق الحبيبات في 310 ميكرولتر من المخزن المؤقت الملزم للملحقين (ABB).
    3. الأنبوب 2: قم بإجراء تلطيخ الأجسام المضادة وقابلية البقاء كما هو موضح أدناه.
      ملاحظة: تم تحسين بروتوكول التلوين هذا لتلوين الخلايا البائية CD19. بالنسبة للأجسام المضادة البشرية الأخرى المستخدمة لتصنيف أنواع الخلايا المختلفة ، قد يحتاج البروتوكول إلى التكيف.
      1. أضف 98 ميكرولتر من ABB إلى الأنبوب 2 (الذي يحتوي على خلايا تحمل علامة CTV). أضف 2 ميكرولتر من الجسم المضاد CD19-Alexa488 (تخفيف 1:50) إلى 98 ميكرولتر من ABB المضاف. اخلط جيدا.
      2. احتضان الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة وأضف 500 ميكرولتر من ABB لإيقاف التفاعل. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة المطفية وكرر خطوة الغسيل.
      3. أعد تعليق حبيبات الخلية في 100 ميكرولتر من ABB وانتقل إلى تلطيخ 7AAD و APC-Annexin V. قم بإجراء تلطيخ 7AAD و APC Annexin V وقياس قياس التدفق الخلوي كما هو موضح أدناه.
      4. أضف 5 ميكرولتر من 7AAD و 5 ميكرولتر من APC-Annexin V إلى الخلايا المعلقة. دوامة برفق للخلط. احتضن الأنبوب لمدة 15 دقيقة في الظلام عند RT. أضف 200 ميكرولتر من ABB للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 310 ميكرولتر.
      5. قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي في يوم الزرع بالترتيب التالي لتجنب التلوث المتبادل: خلايا التحكم غير الملوثة (الأنبوب 1) ، والخلايا المسماة CTV الملطخة ب Alexa488-CD19 ، و APC-Annexin V ، و 7AAD (الأنبوب 2). سجل ما لا يقل عن 10,000 حدث لكل عينة لإجراء تحليل كاف.

5. الزرع

  1. لوحة الزرع: قم بإعداد طبقين من بتري مقاس 10 سم مملوءين ب E3 / P / S وضعيه في الحاضنة على حرارة 28 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل للتدفئة المسبقة.
  2. تحضير الخلية: قم بالطرد المركزي للخلايا عند 350 × جم لمدة 5 دقائق عند RT ، وتخلص من المادة الطافية وقم بإزالة أي سائل متبقي باستخدام ماصة دقيقة. أضف PBS لتحقيق حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولتر. احتفظ بتعليق الخلية المركز على الجليد.
    ملاحظة: يجب ألا تبقى الخلايا على الجليد لأكثر من ساعتين أثناء عملية الزرع.
  3. إبرة الزرع وتحضير الأجنة المضيفة
    1. انقل 25-30 جنينا إلى أحد أطباق بتري المسخنة مسبقا التي تحتوي على E3 / P / S باستخدام ماصة باستور زجاجية لتكون بمثابة تحكم. قم بتحميل 4 ميكرولتر من تعليق الخلية في إبرة الزرع باستخدام طرف محمل صغير.
      ملاحظة: يجب أن يستمر التحميل بسلاسة في غضون 1-2 دقيقة. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فأضف المزيد من PBS بعناية إلى تعليق الخلية.
    2. معايرة ضغط الحقن وطول النبضة عن طريق ضبط الحاقن الدقيق. اضبط حتى تطرد حقنة واحدة ما يقرب من 1,000 خلية ALL أو 2 نانولتر من معلق الخلية (ل 1 × 107 خلايا في 20 ميكرولتر). لتقدير 1000 خلية ، طرد حجم من المعلق على سطح الاغاروز المغطى بوسط. عد 100 خلية في منطقة صغيرة ، واستقراء توزيعها على إجمالي عدد الخلايا ، وتقدير العدد الإجمالي.
    3. تحضير 50 مل من E3 المحتوي على التريكيين (التركيز النهائي: 80 مجم / لتر). انقل الأجنة المضيفة إلى محلول التريكيين واحتضانها لمدة دقيقتين على الأقل لضمان التخدير المناسب. يتم تخدير الجنين بشكل صحيح عندما لا يمكن ملاحظة أي استجابة حركية
      ملاحظة: يمكن استخدام طرف اللودر الصغير أو الملقط للاقتراب من الجنين و / أو لمسه بعناية.
    4. انقل 15-20 جنينا ممزقا إلى طبق حقن مغطى بالأغروز (انظر تعليمات التحضير السابقة) باستخدام أقل قدر ممكن من السوائل لمنع الأجنة من الانزلاق.
    5. رتب الأجنة كما هو موضح في الشكل 2 أ. حقن ما يقرب من 1,000 خلية BCP-ALL إيجابية CTV في تجويف التامور. أدخل الإبرة بزاوية 45 درجة من الاتجاه الظهري الذيلي، كما هو موضح في الشكل 2 ب لحقن الخلايا.
      ملاحظة: استخدم الإبر المسحوبة مسبقا والغير الحادة المتوفرة تجاريا بقطر فتح 20 ميكرومتر ، مصممة خصيصا لخلايا سرطان الدم الصغيرة (انظر قائمة المواد). إذا أصبحت الإبرة مسدودة ، فقم بقصها حسب الضرورة ، ولكن أعد معايرة حجم الحقن وعدد الخلايا بعد ذلك.
    6. بمجرد حقن جميع الأجنة البالغ عددها 15-20 جنينا ، انقلها إلى طبق بتري المسخن مسبقا المملوء ب E3 / P / S واحتفظ بها عند 28 درجة مئوية.
    7. كرر الخطوات حتى يتم زرع ما يقرب من 100 - 150 جنينا لاختبار علاج دوائي واحد ، والذي يجب أن يتضمن ثلاثة تركيزات دوائية وعنصر تحكم واحد.
    8. احتضان كل من الأجنة المزروعة والضوابط غير المزروعة عند 28 درجة مئوية لمدة 1-3 ساعات قبل بدء العلاج الدوائي.
  4. العلاج الدوائي في الجسم الحي (لوحة 96 بئر)
    1. باستخدام الفحص المجهري الفلوري ، قم بفحص الأجنة لتأكيد النقش الناجح (الشكل 2 ج). تأكد من أن صفار البيض سليم ، لأن بيئة الصفار قد تكون سامة لتطعيم الخلايا21. تخلص من الأجنة التي تحتوي على خلايا في صفار البيض.
    2. تحضير 2.5 مل من محلول مركز 2x لكل حالة دوائية ليتم اختبارها في E3 / P / S مع 0.5٪ DMSO. بالإضافة إلى ذلك ، قم بإعداد محلول التحكم في السيارة سعة 5 مل يحتوي على 0.5٪ DMSO في E3 / P / S.
    3. أضف 100 ميكرولتر من E3 / P / S + 0.5٪ DMSO إلى كل بئر من صفيحة 96 بئرا. تمنع هذه الخطوة النقل غير المقصود للحد الأدنى من كميات الدواء بين الآبار.
    4. انقل جنينا واحدا مطعما بعناية إلى كل بئر. استخدم ماصة باستور زجاجية لالتقاط كل جنين في أقل قدر ممكن من وسط E3.
    5. اسمح للجنين بالغرق في قاع طرف الماصة عن طريق إمالة الماصة برفق وإطلاقها في البئر باستخدام قوى الشعيرات الدموية. تجنب لمس الوسط في البئر أثناء النقل.
    6. أضف محاليل الدواء إلى اللوحة: املأ 24 بئرا (صفين) من الصفيحة المكونة من 96 بئرا ب 100 ميكرولتر إما من محلول التحكم في السيارة أو أحد المحاليل الدوائية الثلاثة المركزة 2x.
      ملاحظة: يجب تحديد تركيزات الدواء الفعالة في التجارب السابقة الخاصة بكل دواء يتم اختباره.
    7. حافظ على الأجنة عند 35 درجة مئوية لمدة 72 ساعة ، بما في ذلك الأجنة غير المزروعة ، والتي ستكون بمثابة عناصر تحكم لتحليل قياس التدفق الخلوي في اليوم 7.

6. اليوم 7

  1. تفكك الجنين / الكسب غير المشروع
    1. فحص الصفيحة المكونة من 96 بئرا باستخدام الفحص المجهري لتحديد واختيار أجنة أسماك الزرد السليمة. قم بتجميع 10 أجنة مضيفة صحية بشكل عشوائي من كل حالة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل (ينتج عنه أنبوبين من الناحية المثالية لكل حالة).
    2. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من السوائل من كل أنبوب يحتوي على جنين والتضحية بالأجنة عن طريق صدمة منخفضة الحرارة عن طريق احتضان الأنابيب على الجليد لمدة ساعة واحدة.
    3. أضف 500 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم (HBSS) إلى كل أنبوب. قم بفصل الأجنة وخلايا الكسب غير المشروع ميكانيكيا عن طريق الخلية باستخدام طرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر ، مع سحب العينات لأعلى ولأسفل 15 مرة تقريبا.
    4. حبيبات شظايا الأنسجة عن طريق الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق في RT. في غضون ذلك ، قم بإعداد أنابيب FACS بغطاء مصفاة مرشح شبكي دقيق 35 ميكرومتر يحتوي على 2 مل من PBS لكل حالة (إجمالي 4 أنابيب).
    5. أعد تعليق كل حبيبات في 500 ميكرولتر من مزيج الإنزيم (0.01٪ غراء ، 0.1٪ ديسباز II ، 0.01٪ ديوكسيربونوكلياز I ، و 12.4 ملي مولار MgSO4 في HBSS الخالي من الكالسيوم والمغنيسيوم) للتفكك الأنزيمي. احتضن في RT لمدة 15 دقيقة.
    6. أثناء الحضانة، قم بتمرير الماصة لأعلى ولأسفل كل 5 دقائق بشكل متكرر باستخدام نفس طرف الماصة لكل أنبوب على حدة لتجنب فقدان الأنسجة.
  2. قياس قياس التدفق الخلوي
    1. انقل الخلايا المنفصلة إلى غطاء مصفاة مرشح شبكي دقيق 35 ميكرومتر لأنابيب FACS وأجهزة الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. أثناء الطرد المركزي ، قم بإعداد مزيج رئيسي لتلوين سطح الخلايا البائية CD19. اجمع بين 98 ميكرولتر من ABB مع 2 ميكرولتر من الجسم المضاد Alexa Fluor 488 CD19 المضاد للإنسان لكل حالة.
    3. تخلص من المادة الطافية من حبيبات الخلية المنفصلة وأعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من مزيج التلوين الرئيسي CD19.
    4. قم بإجراء بروتوكول تلطيخ CD19 و 7AAD و APC Annexin V لجميع عينات ZefiX ، بما في ذلك 3 × 105 خلايا إيجابية CTV من زراعة الخلايا المتوازية إن وجدت.
    5. قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي باتباع الترتيب وتسجيل عدد الأحداث الموضحة في الجدول 2. قم بتشغيل جميع العينات التي تحتوي على الخلايا المضيفة والطعم بشكل كامل قدر الإمكان لتقييم إجمالي أعداد خلايا الطعم.
  3. تحليل النتائج باستخدام البرامج التجارية.
    1. استراتيجية البوابات لعينة زراعة الخلايا: افتح البرنامج وقم بتحميل ملفات FCS في مساحة العمل. قم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام CD19 و CTV للتأكد من تداخل الإشارة وتأكيد وجود الخلايا السرطانية. بعد ذلك ، قم بإنشاء مخطط نقطي باستخدام FSC-A (المحور x) و SSC-A (المحور y) لتمييز الخلايا السليمة (Q2) عن الحطام (Q4 ؛ الشكل 3 أ).
    2. استخدم مجموعة الخلايا السليمة لإنشاء مخطط جديد باستخدام SSC-H (المحور السيني) و SSC-A (المحور y) لتحديد الخلايا المفردة (الشكل 3 أ').
    3. قم بإنشاء مخطط نقطي آخر باستخدام الملحق V (المحور x) و 7AAD (المحور y) باستخدام مجموعة الخلايا المفردة (الشكل 3 أ ''). تمييز الخلايا إلى أربعة مجموعات سكانية: الخلايا القابلة للحياة: الملحق الخامس سلبي ، 7AAD سلبي (Q4) ؛ الخلايا المبرمج المبكرة: الملحق الخامس إيجابي ، 7AAD سلبي (Q3) ؛ الخلايا المبرمجة / النخرية المتأخرة: الملحق الخامس إيجابي ، 7AAD إيجابي (Q2) ؛ الخلايا النخرية: الملحق الخامس سلبي ، 7AAD إيجابي (Q1).
    4. كرر هذه الخطوات لعينات 3 نقاط في البوصة (الشكل 3 ب).
    5. استراتيجية البوابات للخلايا الجنينية المميزة والمضيفة
      1. افصل خلايا الكسب غير المشروع البشري عن الخلايا المضيفة باستخدام مخطط نقطي مع CTV (المحور السيني) و CD19 (المحور الصادي). تحديد وعزل خلايا الكسب غير المشروع الإيجابية المزدوجة CTV / CD19 (الشكل 3 ج).
      2. قم بتطبيق نفس استراتيجية البوابات الموضحة لخلايا مزرعة 3 نقاط في البوصة (الشكل 3 ب '- ب''") على مجموعة خلايا الكسب غير المشروع. انسخ استراتيجية البوابات من أجل الاتساق.
      3. ادمج جميع مجموعات الخلايا السلبية Annexin V و 7AAD في رسم بياني بقيم CTV على المحور x (الشكل 3 د). احسب المتوسط الهندسي لجميع العينات الخمس لتحديد معدلات الانتشار.
  4. حسابات تقييم الاستجابة للعلاج
    1. لتحديد عدد انقسامات الخلايا بعد 3 أيام ، استخدم الصيغة:
      ن = السجل2 (I0 / I)
      حيث ، أنا0 = شدة مضان CTV الأولية (المتوسط الهندسي ، 0 نقطة في البوصة) ، I = شدة مضان CTV عند 72 ساعة ، ن = عدد انقسامات الخلايا.
      مثال: خلايا المرضى المجمدة حديثا مقسمة 2.6x في ZefiX log2 (88317/14644) = 2.6
      و 2.8x في سجل الثقافةثنائية الأبعاد 2 (88317/12992) = 2.8
    2. لتحديد العدد الإجمالي لخلايا الكسب غير المشروع لكل سمكة بعد 3 أيام ، قسم العدد الإجمالي للخلايا السرطانية (بما في ذلك الخلايا موت الخلايا المبرمجة ، ولكن باستثناء الحطام) على عدد الأسماك المجمعة في العينة (عادة ن = 10).
    3. لتحديد صلاحية خلايا الكسب غير المشروع الإيجابية ل CTV بعد 3 أيام ، استخدم الصيغة:
      V = (C / 100) × A
      حيث: V = الجدوى ، C = جزء من الخلايا المفردة السليمة بدون حطام (كنسبة مئوية) ، A = جزء من الخلايا الملحقة V و 7AAD السلبية (كنسبة مئوية).

النتائج

للحصول على تقييم علمي مفصل لبروتوكول ZefiX ، بما في ذلك الطعم الغريب والعلاج الدوائي لعينات خلايا BCP-ALL الأولية المجمدة حديثا ، يرجى الرجوع إلى المخطوطة المنشورةسابقا 21. تم منح الموافقة على استخدام عينات المرضى في البحث لاختبار الأدوية قبل السريرية كجزء من ال?...

Discussion

أصبحت أجنة أسماك الزرد نموذجا شائعا بشكل متزايد لفحص الأدوية وأبحاث السرطان نظرا لقدرتها العالية على الإنتاجية وفعاليتها من حيث التكلفة. تحمل هذه الطعوم الغريبة وعدا كركيزة حاسمة للطب الانتقالي ، حيث تساعد في البحث قبل السريري واتخاذ القرار9،

Disclosures

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) داخل مركز البحوث التعاوني CRC1588 ، المشروع رقم 493872418 ومؤسسة الدكتور كلايست ، برلين ، وكذلك من قبل مؤسسة Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung (R03 / 2016) ، Berliner Krebsgesellschaft (HEFF201633KK) واتحاد السرطان الألماني (DKTK ، نداء التمويل المشترك 2016). نشكر جوليا كوبكي وماريكي وولف على قراءتهما النقدية للمخطوطة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Petri dish  (10 cm)GreinerP7237
7-AAD viability staining solution Invitrogen00-6993-50
Agarose (LE, analytic grade)Biozym 840004
Air pressure injectorNarishigeIM400 with external gas supply
Alexa Fluor 488 anti-human CD19 antibody Biolegend302219
Annexin binding bufferBiolegend422201Or see solutions for preparation
APC annexin V Biolegend640941
Capillaries (10 cm, OD 1.0 mm, with filaments)WPIINCTW100F-41.0 OD; 0.75 ID
Cell culture flask (T-175)Sarstedt83,39,12,002
CellTrace Violet InvitrogenC34557
Dimethyl sulphoxide (DMSO)RothA994.1
Dispase II Sigma AldrichD4693-1g
DNase IAppliChem GmbHA3778
Eppendorf tubes (1.5 ml)Eppendorf30120086
FACS tube (Polystyrene round botton Tube with Cell strainer Cap, 5 ml)Falcon352235
Falcon tubes (50 ml)Falcon352070
Fetal calf serum (FCS)Sigma AldrichC8056
Fine mesh filter (10 µm)PluriStrainer435001050
Fine mesh filter (20 µm)PluriStrainer431002040
Flow cytometer Becton DickinsonBD LSRFortessa X-20
Fluorescent stereomicroscopeLeica
Fluorescent stereomicroscope with cameraLeicaM165 FCCamera: DFC7000 T
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, Calcium and Magnesium free )Sigma Aldrich88284
Injection mold (Zebrafish MI/Transplant KIT)World Precision Instruments Z-MOLDS
Injection needles (without filament)Biomedical instrumentsVZIPbl-20-10-55Zebrafish injection pipette, blunt, OD: 20μm ± 1, TL:~10mm, PL: 55mm, Glass: BM100T-10P
Macro-centrifugeEppendorf
Micro-centrifuge
Morpholino (csf3r)Gene Tools LLCcsf3r (GAAGCACAAGCGA
GACGGATGCCA)
Morpholino (spi1)Gene Tools LLCspi1(GATATACTGATAC
TCCATTGGTGGT)
PapainSigma AldrichP3125
Penicillin-Streptomycin (Penstrep; 10.000 U/ml)Gibco15140122
Plates (4-well)Greiner Bio one 657160
Plates (96-well)Greiner Bio one 657180
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumGibco21875-034
Tricaine  (MS-222)Sigma AldrichE10521-50GEthy-3 aminobenzoate methanesulfenate

References

  1. Fontana, C. M., Van Doan, H. Zebrafish xenograft as a tool for the study of colorectal cancer: a review. Cell Death Dis. 15, 1-12 (2024).
  2. Sturtzel, C., et al. Refined high-content imaging-based phenotypic drug screening in zebrafish xenografts. NPJ Precis Oncol. 7 (1), 1-16 (2023).
  3. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24, 2288 (2023).
  4. Gamble, J. T., Elson, D. J., Greenwood, J. A., Tanguay, R. L., Kolluri, S. K. The zebrafish xenograft models for investigating cancer and cancer therapeutics. Biology. 10 (4), 252 (2021).
  5. Costa, B., Estrada, M. F., Mendes, R. V., Fior, R. Zebrafish avatars towards personalized medicine-A comparative review between avatar models. Cells. 9 (2), 293 (2020).
  6. Wang, W., et al. Progress in building clinically relevant patient-derived tumor xenograft models for cancer research. Animal Model Exp Med. 6 (5), 381-398 (2023).
  7. Xiao, J., Glasgow, E., Agarwal, S. Zebrafish xenografts for drug discovery and personalized medicine. Trend Cancer. 6 (7), 569-579 (2020).
  8. Fazio, M., Ablain, J., Chuan, Y., Langenau, D. M., Zon, L. I. Zebrafish patient avatars in cancer biology and precision cancer therapy. Nat Rev Cancer. 20 (5), 263-273 (2020).
  9. Costa, B., et al. Zebrafish avatar-test forecasts clinical response to chemotherapy in patients with colorectal cancer. Nat Comm. 15 (1), 4771 (2024).
  10. Grissenberger, S., et al. Chapter 8 - Preclinical testing of CAR T cells in zebrafish xenografts. Method Cell Biol. 167, 133-147 (2022).
  11. Yan, C., et al. Single-cell imaging of T cell immunotherapy responses in vivo. J Exp Med. 218 (10), 20210314 (2021).
  12. Pascoal, S., et al. A preclinical embryonic zebrafish xenograft model to investigate CAR T cells in vivo. Cancers. 12 (3), 567 (2020).
  13. Pal, D., et al. Long-term in vitro maintenance of clonal abundance and leukaemia-initiating potential in acute lymphoblastic leukaemia. Leukemia. 30 (8), 1691-1700 (2016).
  14. Beneduce, G., et al. Blinatumomab in children and adolescents with relapsed/refractory B cell precursor acute lymphoblastic leukemia: A real-life multicenter retrospective study in seven AIEOP (Associazione Italiana di Ematologia e Oncologia Pediatrica) Centers. Cancers. 14 (2), 426 (2022).
  15. Xie, J., et al. Short-course blinatumomab for refractory/relapse precursor B acute lymphoblastic leukemia in children. Front Pediatr. 11, 1187607 (2023).
  16. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419 (2022).
  17. Howe, K. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  18. Lee, H. C., Lin, C. Y., Tsai, H. J. Zebrafish, an in vivo platform to screen drugs and proteins for biomedical use. Pharmaceuticals. 14 (6), 500 (2021).
  19. Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Investigation. 122 (7), 2337-2343 (2012).
  20. Miao, K. Z., Kim, G. Y., Meara, G. K., Qin, X., Feng, H. Tipping the scales with zebrafish to understand adaptive tumor immunity. Front Cell Dev Biol. 9, 660969 (2021).
  21. Gauert, A., et al. Fast, in vivo model for drug-response prediction in patients with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Cancers. 12 (7), 1883 (2020).
  22. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. Mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  23. Pase, L., et al. Neutrophil-delivered myeloperoxidase dampens the hydrogen peroxide burst after tissue wounding in zebrafish. Current Biol. 22 (19), 1818-1824 (2012).
  24. Wijk, R. C. V., et al. Mechanistic and quantitative understanding of pharmacokinetics in Zebrafish larvae through nanoscale blood sampling and metabolite modeling of paracetamol. J Pharmacol Exp Ther. 371 (1), 15-24 (2019).
  25. Lázaro-Navarro, J., et al. Inhibiting casein kinase 2 sensitizes acute lymphoblastic leukemia cells to venetoclax via MCL1 degradation. Blood Advances. 5 (24), 5501 (2021).
  26. Rhodes, J., et al. Interplay of pu.1 and gata1 determines myelo-erythroid progenitor cell fate in zebrafish. Developmental Cell. 8 (1), 97-108 (2005).
  27. Zakaria, Z. Z., Eisa-Beygi, S., Benslimane, F. M., Ramchandran, R., Yalcin, H. C. Design and microinjection of Morpholino antisense oligonucleotides and mRNA into zebrafish embryos to elucidate specific gene function in heart dvelopment. J Vis Exp. (186), e63324 (2022).
  28. . ZFIN: Zebrafish Book: Contents Available from: https://zfin.org/zf_info/zfbook/cont.html (2025)
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. Hasegawa, E. H., Gist H Farr, I. I. I., Maves, L. Comparison of pronase versus manual dechorionation of zebrafish embryos for small molecule treatments. J Dev Biol. 11 (2), 16 (2023).
  31. Wattrus, S. J., Zon, L. I. Stem cell safe harbor: the hematopoietic stem cell niche in zebrafish. Blood Adv. 2 (21), 3063-3069 (2018).
  32. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. J Leukocyte Biol. 98 (4), 523-537 (2015).
  33. Page, D. M., et al. An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish. Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).
  34. Nguyen-Chi, M., et al. TNF signaling and macrophages govern fin regeneration in zebrafish larvae. Cell Death Dis. 8 (8), e2979-e2979 (2017).
  35. Rosowski, E. E. Determining macrophage versus neutrophil contributions to innate immunity using larval zebrafish. Dis Models Mech. 13 (1), dmm041889 (2020).
  36. Rebelo de Almeida, C., et al. Zebrafish xenografts as a fast screening platform for bevacizumab cancer therapy. Comm Biol. 3 (1), 1-13 (2020).
  37. Pringle, E. S., et al. The zebrafish xenograft platform-A novel tool for modeling KSHV-associated diseases. Viruses. 12 (1), 12 (2020).
  38. Pype, C., et al. Incubation at 32.5 °C and above causes malformations in the zebrafish embryo. Reprod Toxicol. 56, 56-63 (2015).
  39. Xu, X., et al. Adeno-associated virus (AAV)-based gene therapy for glioblastoma. Cancer Cell Int. 21 (1), 76 (2021).
  40. Siebert, J., et al. Rhabdomyosarcoma xenotransplants in zebrafish embryos. Pediat Blood Cancer. 70 (1), e30053 (2023).
  41. van Bree, N., et al. Development of an orthotopic medulloblastoma zebrafish model for rapid drug testing. Neuro-Oncol. noae210, (2024).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

219

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved