Previsione rapida della risposta ai farmaci in vivo utilizzando innesti di cellule leucemiche in embrioni di zebrafish

Riepilogo

Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la generazione e la risoluzione dei problemi di xenotrapianti di leucemia linfoblastica acuta umana (ALL) da linee cellulari e materiale fresco del paziente in embrioni di zebrafish transitoriamente immunosoppressi, insieme a linee guida per la valutazione della risposta ai farmaci mediante citometria a flusso. La pipeline sperimentale può essere adattata anche per i tumori solidi.

Abstract

Lo xenotrapianto di pesce zebra è una tecnica fondamentale per studiare la patogenesi del cancro umano e prevedere le risposte individuali ai farmaci. Questo documento introduce un protocollo semplificato (ZefiX) per l'espansione di campioni di pazienti affetti da leucemia linfoblastica acuta precursore delle cellule B primarie (BCP-ALL) o di linee cellulari immortalizzate in embrioni di zebrafish immunosoppressi transitoriamente, utilizzando la citometria a flusso per l'analisi ad alta risoluzione di singole cellule delle risposte al trattamento. Rispetto agli attecchimenti tumorali solidi, le cellule leucemiche traggono vantaggio in modo significativo da una soppressione basata su oligonucleotidi morfolino antisenso dei fattori differenzianti dei macrofagi e dei neutrofili durante il test. L'analisi con citometria a flusso di cellule di trapianto dissociate consente una valutazione precisa della conta cellulare, del tasso di proliferazione e della vitalità dopo il trattamento su base per singola cellula. Questo approccio è stato convalidato utilizzando terapie mirate come venetoclax e dasatinib, con risultati di trattamento confrontati con le cartelle cliniche di campioni di pazienti correlati e i tradizionali controlli di coltura 2D. In particolare, il protocollo viene completato entro 7 giorni, in linea con le tempistiche del processo decisionale clinico. La metodologia è adattabile per testare farmaci selezionati in vari tipi di cancro, compresi i tumori solidi, supportando così strategie terapeutiche personalizzate. Tuttavia, dovrebbero essere prese in considerazione limitazioni sul numero di farmaci che possono essere valutati, probabilmente a causa di vincoli farmacocinetici negli embrioni di zebrafish.

Introduzione

Lo xenotrapianto di pesce zebra è diventato un modello cruciale in vivo per comprendere la patogenesi del cancro e prevedere le risposte ai farmaci 1,2,3,4,5. I modelli animali rimangono fondamentali per i test preclinici sui farmaci e il modello zebrafish offre vantaggi significativi rispetto ad altri sistemi in vivo, tra cui un'elevata produttività e l'efficienza dei costi ^6,7,8.  Questo modello potrebbe anche aiutare a prevedere la risposta al trattamento personalizzata, comprese le terapie a bersaglio molecolare e la terapia cellulare CAR-T 9,10,11,12.

La BCP-ALL può trarre particolare beneficio dallo xenotrapianto di zebrafish, poiché l'espansione delle cellule primarie dei pazienti in coltura rimane impegnativa¹³. C'è un innegabile bisogno di nuovi approcci terapeutici nella LLA. Nonostante un alto tasso di remissione dell'80%-85% nei bambini con BCP-ALL, i tassi di sopravvivenza a lungo termine per i pazienti con malattia recidivante o refrattaria variano solo tra circa il 30%-60%14,15,16. In tali casi, i test farmacologici che utilizzano la pipeline proposta potrebbero essere integrati nel contesto clinico per identificare la terapia ottimale specifica per il paziente^14,15. Questo approccio personalizzato può essere cruciale quando si tratta di più resistenze ai farmaci, riducendo significativamente il carico di trattamento per i pazienti evitando farmaci inefficaci o non ottimali con gravi effetti collaterali.

Diverse caratteristiche rendono lo xenotrapianto di embrioni di pesce zebra un modello adatto. Le somiglianze genetiche tra l'uomo e il pesce zebra - 70% di omologia genetica e 84% di geni legati alla malattia condivisi - supportano gli studi sull'interazione gene-farmaco¹⁷. L'utilizzo di un embrione ospite transgenico può quindi rivelare predisposizioni genetiche che influenzano la suscettibilità ai farmaci¹⁸. In alternativa, le cellule con specifiche modificazioni genetiche possono essere trapiantate per valutare se la sensibilità o la resistenza al farmaco si allinea con i risultati in vitro . Gli xenotrapianti di embrioni di pesce zebra forniscono anche informazioni sui potenziali effetti sistemici dei farmaci. Sebbene lo sviluppo degli organi negli embrioni di 2-3 giorni non sia completamente maturo, gli organi sono localizzati correttamente e condividono in parte la composizione cellulare con le loro controparti adulte¹⁹.

Ulteriori vantaggi di questo modello includono che sono necessarie solo poche cellule tumorali per l'attecchimento, il mantenimento degli embrioni ospiti è semplice, poiché non è richiesta alcuna alimentazione entro i primi 5 giorni di vita e il successo dell'iniezione può essere valutato rapidamente grazie alla trasparenza e alle dimensioni degli embrioni. Una caratteristica unica è che solo l'immunità innata è attiva in questa fase dello sviluppo, facilitando un attecchimento efficiente²⁰. Nel protocollo ZefiX qui descritto (vedi riassunto in Figura 1), l'immunodeficienza è ulteriormente potenziata sopprimendo il sistema immunitario innato durante i primi 4 giorni di vita utilizzando oligonucleotidi antisenso Morpholino stabili che hanno come bersaglio spi1 e csf3r, che bloccano la differenziazione dei macrofagi e dei neutrofili 21,22,23.

Questo protocollo differisce anche dai precedenti protocolli di xenotrapianto di zebrafish, che sono stati sviluppati principalmente per innesti tumorali solidi e utilizzano tipicamente metodi di valutazione della risposta ai farmaci basati sull'imaging a montaggio intero. ZefiX è ottimizzato per le cellule tumorali liquide, come le cellule BCP-ALL, ed è stato utilizzato con successo per espandere il materiale fresco o congelato del paziente²¹. ZefiX può anche essere adattato per le cellule tumorali aderenti selezionando enzimi appropriati per la dissociazione tissutale.

Un altro grande vantaggio è l'analisi a valle che utilizza la citometria a flusso, che offre diversi vantaggi: (i) un gran numero di cellule del trapianto può essere elaborato rapidamente, consentendo una solida analisi statistica a livello di singola cellula, (ii) il tasso di proliferazione e la vitalità possono essere valutati simultaneamente nelle singole cellule e (iii) i citometri a flusso sono comunemente disponibili in contesti di ricerca clinica, Consentire la valutazione della risposta ai farmaci delle cellule del trapianto a livello di singola cellula entro poche ore. Per garantire la riproducibilità, questo protocollo fornisce una pipeline standardizzata dalla preparazione al trapianto fino all'analisi della citometria a flusso, consentendo la previsione della risposta ai farmaci nelle cellule ALL entro una settimana.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sul pesce zebra sono conformi alle linee guida dell'Istituto di ricerca per la medicina sperimentale della Charité-Universitätsmedizin di Berlino e alle autorità ufficiali. Tutti gli studi hanno coinvolto embrioni di pesce zebra < 6 giorni dopo la fecondazione (dpf), esentandoli dalla legge sulla protezione degli animali. Il pesce zebra (Danio rerio) è stato allevato e mantenuto presso la struttura per animali della Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlino, Germania, secondo protocolli standard. Sono stati alloggiati a 28 °C con un ciclo di luce di 14 ore e buio di 10 ore. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati pesci selvatici di ceppi AB o TüLF.

NOTA: Stabilire le condizioni di trattamento ottimali per ciascun farmaco desiderato prima dell'applicazione di ZefiX include diversi passaggi necessari. Innanzitutto, determinare la concentrazione inibitoria semimassima (IC50) di ciascun farmaco utilizzando una linea cellulare adatta all'interno di un sistema di coltura 2D convenzionale. Sulla base dell'esperienza precedente, le concentrazioni efficaci del farmaco per il trattamento con ZefiX possono essere 5 volte - 50 volte superiori a quelle utilizzate in condizioni tipiche di coltura cellulare^21,24. Prima di trattare gli embrioni trapiantati, è essenziale valutare la tossicità all'interno degli embrioni ospiti non trapiantati utilizzando l'intervallo di concentrazione stabilito. Dopo aver valutato la tossicità, esporre gli embrioni trapiantati in linea cellulare a una varietà di concentrazioni di farmaci circa 50 volte il valore IC50 precedentemente determinato in coltura 2D. Se le cellule trapiantate non mostrano alcuna risposta a dosaggi fino a 100 volte l'IC50, il farmaco può essere considerato inefficace per ZefiX. Per migliorare potenzialmente l'efficacia, un'opzione è quella di precondizionare le cellule del trapianto con il farmaco poco prima del loro trapianto in embrioni²⁵. Vedere la Tabella 1 per tutte le soluzioni utilizzate qui.

1. Giorno 1: Preparazione per l'esperimento

1. Preparazione del terreno E3: Preparare 2 L di terreno E3 autoclavato da utilizzare per il mantenimento dell'embrione.
2. Preparazione degli oligonucleotidi morfolino antisenso (MO): preparare una soluzione madre da 50 μM contenente entrambi i MO in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL utilizzando acqua priva di nucleasi. Conservare la soluzione madre a temperatura ambiente (RT). Preparare i MO per l'iniezione incubando la soluzione su un blocco riscaldante a 65 °C per 10 minuti.
   NOTA: I MO sono diretti contro spi1 e csf3r per inibire la differenziazione delle cellule macrofagiche e neutrofile, come descritto nei riferimenti 22,23,26.
3. Preparazione delle piastre di iniezione
   1. Per preparare 4-5 piastre, sciogliere l'agarosio all'1% in terreno E3 per creare una soluzione da 100 mL. Per le piastre da trapianto, versare ~20 ml di soluzione in ciascuna piastra di Petri da 10 cm, assicurandosi che siano riempite a metà. Agitare per distribuire uniformemente il liquido.
   2. Per le piastre di iniezione Morpholino, posizionare lo stampo a iniezione sull'agarosio liquido in due piastre di Petri, assicurandosi che non si formino bolle. Coprite le stoviglie inclinando i coperchi e lasciatele a RT fino a quando l'agarosio non si sarà solidificato. Una volta solidificato, togliete lo stampo e riponete le piastre capovolte a 4 °C in un sacchetto di plastica sigillato.
4. Preparazione degli aghi per iniezione
   1. Per le iniezioni di Morpholino: generare aghi da capillari di 10 cm utilizzando un estrattore di aghi e rompere le punte per ottenere un diametro stimato di 10 μm (come descritto in²⁷).
   2. Per il trapianto di cellule: utilizzare aghi per iniezione pre-estratti con estremità smussata disponibili in commercio con un diametro esterno di 20 μm.
5. Coltura cellulare con trapianto: cellule divise (ad es. Nalm6) con l'obiettivo di una densità target del 70%-80% il giorno 4 in un pallone di coltura cellulare T175 con terreno RPMI integrato con il 10% di FCS e l'1% di P/S (RMI-completo). Dividere le cellule 3-4 volte prima dell'uso per garantire un corretto tasso di proliferazione.
   NOTA: Per la preparazione di materiale paziente fresco o fresco/congelato per il trapianto, le istruzioni sono disponibili al passaggio 4.3. Le cellule vengono quindi preparate il giorno del trapianto.
6. Allevamento di pesci zebra: Sistemare il pesce zebra di tipo selvatico in vasche di riproduzione nel pomeriggio, mantenendo separati maschi e femmine.
   NOTA: I pesci zebra sono stati allevati e messi in scena come descritto nel riferimento²⁸. I riferimenti temporali (hpf o dpf) denotano ore o giorni dopo la fecondazione.

2. Giorno 2: Iniezione di Morpholino

1. Integrare 500 ml di terreno E3 autoclavato con penicillina/streptomicina all'1% (E3/P/S) e riempire due piastre di Petri da 10 cm. Estrarre la piastra di iniezione dal frigorifero per preriscaldarla a RT.
2. Apertura del cancello sfalsato delle vasche di riproduzione in modo che la fecondazione possa avvenire solo in una frazione di vasche alla volta (a seconda della velocità di iniezione) per garantire microiniezioni tempestive della soluzione di Morpholino negli embrioni di zebrafish allo stadio di una cellula^28,29. Inizia aprendo uno o due cancelli a seconda della velocità dell'iniettore, quando un lotto di uova viene prontamente iniettato apri un altro cancello o due cancelli e così via.
3. Trasferire gli ovuli fecondati in lotti da 100 con il minor liquido possibile nella piastra di iniezione precedentemente realizzata. Allineare gli embrioni nelle scanalature della piastra.
4. Iniettare 1 nL di una miscela da 50 μM di entrambi i morfolini nella cellula o nel sacco vitellino appena sotto la cellula durante lo stadio²⁹ di una cellula. Iniettare un numero sufficiente di ovuli per le procedure successive (ad esempio, per una piastra da 96 pozzetti, iniettare fino a 200 ovuli per avere un backup sufficiente per un potenziale abbandono prima del trapianto).
5. Trasferire le uova iniettate in piastre di Petri contenenti E3/P/S. Incubare le uova iniettate a 28 °C. Conservare le uova non iniettate come pesce di controllo per l'analisi di citometria a flusso a 5 dpf. Conservare il fluido E3/P/S rimanente a 4 °C.

3. Giorno 3: De-corionazione

1. De-corionazione di embrioni di zebrafish: De-corionato manualmente gli embrioni quando hanno più di 24 hpf utilizzando due pinze di precisione²⁹.
   1. Rimuovere gli embrioni morti che non mostrano battito cardiaco o movimento e appaiono opachi o gli embrioni con forme irregolari dai piatti con una pipetta Pasteur.
   2. Pizzica il corion con una pinza di precisione per tenerlo in posizione. Pizzica proprio accanto alla punta della pinza di precisione, tenendo l'embryo in posizione con la seconda pinza, e separa con cautela il corion per rilasciare l'embrione
      NOTA: Per dechorionate embrioni di età inferiore a 24 hpf, devono essere tenuti su un piatto rivestito di agarosio per evitare che si attacchino alla plastica. La decorionazione manuale è preferita in quanto è più delicata per gli embrioni. Un metodo alternativo di de-corionazione enzimatica è descritto altrove³⁰.
2. Incubare gli embrioni decorionati a 28 °C per una notte.

4. Giorno 4: Xenotrapianto e trattamento farmacologico

1. Preparazione degli embrioni ospiti: Togliere dal frigorifero le piastre di agarosio preparate e l'E3/P/S e lasciarle raggiungere la RT. Esaminare gli embrioni per lo stadio di sviluppo appropriato a 48 hpf utilizzando uno stereomicroscopio. Includere nel flusso di lavoro solo embrioni correttamente stadiati e morfologicamente tipici, come descritto altrove²⁹. Conta tutti gli embrioni sani e pianifica ulteriori trattamenti. Conservare non più di 100 embrioni per piastra di Petri da 10 cm a 28 °C per evitare velocità di sviluppo irregolari causate dalla carenza di ossigeno.
   NOTA: Seguire il passaggio 4.2. per linee cellulari. Per il materiale fresco/congelato, procedere direttamente al passaggio 4.3.
2. Preparazione di linee cellulari
   1. Per preparare le cellule BCP-ALL marcate in fluorescenza per la citometria a flusso e il trapianto, lavare le cellule (dal passaggio 1.5) con 1x PBS: centrifugare a 350 x g per 5 minuti e risospendere in 20 mL di PBS.
   2. Contare le cellule e trasferire 3 x 10⁵ cellule non colorate in una provetta FACS per l'analisi di citometria a flusso del giorno 0 (0 giorni dopo l'iniezione, dpi). Conservare con ghiaccio.
   3. Piastra 3 x 10⁵ celle in 3 mL di RPMI-complete in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e mantenere a 37 °C per un controllo a 3 dpi.
   4. Trasferire 1 x 10⁷ cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL per la marcatura CTV. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a RT, versare il surnatante (utilizzare una pipetta per il resto) e risospendere il pellet in 2,5 mL di PBS (RT) con 1 μL di soluzione madre CTV.
   5. Incubare per 5 minuti al buio a 37 °C, interrompere la reazione con 12,5 mL di RPMI-complete, quindi incubare per 10 minuti al buio a 37 °C.
   6. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a RT e lavare una volta con 10 mL di RPMI-complete. Centrifugare nuovamente e risospendere in 10 mL di RPMI-complete.
   7. Filtrare le celle utilizzando un filtro da 10 μm centrifugando a 350 x g per 5 minuti. Risospendere il pellet, contare le cellule e trasferire 3 x 10⁵ cellule marcate con CTV in una provetta FACS. Piastra 3x 10^5 cellule con 3 mL di RPMI-complete in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e mantenerle a 37°C per un controllo della proliferazione di 3 dpi. Conservare le cellule rimanenti in 1 mL di PBS su ghiaccio fino al trapianto.
3. Preparazione del materiale fresco/congelato del paziente
   1. Preriscaldare due provette da centrifuga da 15 mL con 10 mL di RPMI-complete ciascuna a 37 °C. Scongelare un flaconcino contenente 5-10 x 10⁶ cellule in un bagno d'acqua a 37 °C.
   2. Una volta che rimane solo una piccola quantità di ghiaccio, trasferire le celle nella provetta da centrifuga con il terreno preriscaldato. Centrifugare a 350 x g per 5 minuti a RT, scartare il surnatante e risospendere il pellet nella seconda provetta di RPMI-complete preriscaldato.
   3. Conta le cellule vitali usando il blu di tripano. Aliquotare 1x 10^5 cellule in una provetta da centrifuga da 1,5 mL e centrifugare questa aliquota di cellule in una provetta FACS a 350 x g per 5 minuti a RT, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 300 μL di PBS.
   4. Conservare l'aliquota risospesa su ghiaccio come controllo non trattato per l'analisi di citometria a flusso.
      NOTA: Se la dimensione del campione lo consente, mantenere un controllo non trattato in coltura per la misurazione della citometria a flusso il giorno 7.
   5. Aggiungere 1 μL della soluzione madre di CTV a 2,5 mL di PBS (RT) per ogni 1 x 10⁶ cellule. Regolare il volume della soluzione madre CTV se sono disponibili meno cellule.
   6. Incubare le cellule con CTV per 5 minuti a 37 °C al buio, arrestare la reazione aggiungendo 12,5 mL di RPMI completo preriscaldato (37 °C) e incubare per 10 minuti al buio a 37 °C.
   7. Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 minuti a RT e lavare le cellule una volta con 10 mL di RPMI-complete. Centrifugare nuovamente a 350 x g per 5 minuti a RT e risospendere le cellule in 10 mL di RPMI-complete.
   8. Filtrare la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga fresca da 50 mL utilizzando un filtro da 10 μm e centrifugare a 350 x g per 5 minuti.
   9. Non gettare il surnatante. Risospendere il pellet e contare le cellule. Trasferire 3 x 10⁵ cellule marcate con CTV in una provetta FACS.
   10. Centrifugare le cellule rimanenti a 350 x g per 5 minuti a RT e scartare il surnatante. Risospendere le cellule rimanenti in 1 mL di PBS e conservarle in ghiaccio fino all'uso nel trapianto.
       NOTA: Se rimane un numero sufficiente di cellule CTV-positive, queste possono essere mantenute in coltura 2D parallelamente agli xenotrapianti per il confronto del tasso di proliferazione.
4. Misurazione della citometria a flusso
   NOTA: La citometria a flusso a 0 dpi deve essere eseguita da una seconda persona per ridurre al minimo il tempo in cui le cellule rimangono sul ghiaccio prima del trapianto. Prima della prima misurazione della citometria a flusso utilizzando il pannello di colorazione designato (CTV, CD19-Alexa488, APC-Annexin V e 7AAD), eseguire un test di compensazione seguendo le istruzioni del produttore.
   1. Preparare due provette FACS come segue: Provetta 1: Celle di controllo non colorate; Provetta 2: Cellule colorate con CTV, CD19, 7AAD e Annessina.
      NOTA: Colorazione ed etichette: CellTrace Violet (CTV) identifica le cellule del trapianto marcate rispetto alle cellule di pesce ospite e valuta il tasso di proliferazione dopo 3 giorni. L'anticorpo CD19, un marcatore della superficie cellulare, funge da marcatore aggiuntivo per l'identificazione delle cellule del trapianto di BCP-ALL umano. Per altri tipi di cancro, possono essere necessari anticorpi marcatori alternativi. L'annessina V segna l'apoptosi allo stadio iniziale per la valutazione della vitalità cellulare. 7AAD contrassegna l'apoptosi o la necrosi in fase avanzata per la valutazione della vitalità cellulare.
   2. Centrifugare le provette (una contenente cellule colorate con CTV e l'altra non colorata) a 350 x g per 5 minuti a RT e scartare il surnatante dalla provetta 1. Risospendere il pellet in 310 μl di tampone legante l'annessina (ABB).
   3. Tubo 2: Eseguire la colorazione degli anticorpi e della vitalità come descritto di seguito.
      NOTA: Questo protocollo di colorazione è ottimizzato per la colorazione delle cellule B CD19. Per altri anticorpi umani utilizzati per marcare diversi tipi di cellule, il protocollo potrebbe richiedere un adattamento.
      1. Aggiungere 98 μl di ABB alla provetta 2 (contenente cellule marcate con CTV). Aggiungere 2 μl di anticorpo CD19-Alexa488 (diluizione 1:50) ai 98 μl di ABB aggiunti. Mescola bene.
      2. Incubare la miscela a 4 °C per 30 minuti e aggiungere 500 μL di ABB per arrestare la reazione. Centrifugare la provetta a 350 x g per 5 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e ripetere la fase di lavaggio.
      3. Risospendere il pellet cellulare in 100 μL di ABB e procedere alla colorazione con 7AAD e APC-Annessina V. Eseguire la colorazione 7AAD e APC Annexin V e la misurazione della citometria a flusso come descritto di seguito.
      4. Aggiungere 5 μl di 7AAD e 5 μl di APC-annessina V alle cellule risospese. Agitare delicatamente per mescolare. Incubare la provetta per 15 minuti al buio a RT. Aggiungere 200 μl di ABB per raggiungere un volume finale di 310 μl.
      5. Eseguire l'analisi di citometria a flusso il giorno del trapianto nel seguente ordine per evitare la contaminazione incrociata: cellule di controllo non colorate (provetta 1), cellule marcate con CTV colorate con Alexa488-CD19, APC-annessina V e 7AAD (provetta 2). Registrare almeno 10.000 eventi per campione per un'analisi sufficiente.

5. Trapianto

1. Piastra per trapianto: Preparare due piastre di Petri da 10 cm riempite con E3/P/S e metterle nell'incubatrice a 28 °C per almeno 30 minuti per preriscaldare.
2. Preparazione delle cellule: Centrifugare le cellule a 350 x g per 5 minuti a RT, scartare il surnatante e rimuovere il liquido rimanente utilizzando una micropipetta. Aggiungere PBS per ottenere un volume finale di 20 μl. Mantenere la sospensione cellulare concentrata sul ghiaccio.
   NOTA: Le cellule non devono rimanere sul ghiaccio per più di 2 ore durante la procedura di trapianto.
3. Preparazione dell'ago da trapianto e dell'embrione ospite
   1. Trasferire 25-30 embrioni in una delle piastre di Petri preriscaldate contenenti E3/P/S utilizzando una pipetta di vetro Pasteur come controllo. Caricare 4 μl della sospensione cellulare nell'ago da trapianto utilizzando una punta per micro caricatore.
      NOTA: Il caricamento dovrebbe procedere senza intoppi entro 1-2 minuti. In caso contrario, aggiungere con cautela altro PBS alla sospensione cellulare.
   2. Calibrare la pressione di iniezione e la lunghezza dell'impulso regolando il microiniettore. Regolare fino a quando un'iniezione espelle circa 1.000 cellule ALL o 2 nL di sospensione cellulare (per 1x 10⁷ cellule in 20 μL). Per stimare 1.000 cellule, espellere un volume della sospensione su una superficie di agarosio ricoperta di terreno. Conta 100 cellule in una piccola area, estrapola la loro distribuzione alla popolazione cellulare totale e stima il numero totale.
   3. Preparare 50 ml di E3 contenente tricaina (concentrazione finale: 80 mg/L). Trasferire gli embrioni ospiti nella soluzione di tricaina e incubare per almeno 2 minuti per garantire un'anestesia adeguata. L'embrione viene adeguatamente anestetizzato quando non è osservabile alcuna risposta motoria
      NOTA: È possibile utilizzare una punta o una pinza per micro caricatore per avvicinarsi e/o toccare con cautela l'embrione.
   4. Trasferire 15-20 embrioni dechorionati su una piastra per iniezione rivestita di agarosio (vedere le istruzioni di preparazione precedenti) utilizzando meno liquido possibile per evitare che gli embrioni scivolino.
   5. Disporre gli embrioni come illustrato nella Figura 2A. Iniettare circa 1.000 cellule BCP-ALL CTV-positive nella cavità pericardica. Introdurre l'ago con un angolo di 45° rispetto alla direzione dorso-caudale, come mostrato nella Figura 2B per iniettare le cellule.
      NOTA: Utilizzare aghi pre-tirati, con estremità smussata disponibili in commercio con un diametro di apertura di 20 μm, progettati specificamente per piccole cellule leucemiche (vedere l'elenco dei materiali). Se l'ago si ostruisce, tagliarlo se necessario, ma ricalibrare il volume di iniezione e il numero di cellule in seguito.
   6. Una volta iniettati tutti i 15-20 embrioni, trasferirli nella capsula di Petri preriscaldata riempita con E3/P/S e mantenerli a 28 °C.
   7. Ripetere i passaggi fino a quando non vengono trapiantati circa 100-150 embrioni per un test di trattamento farmacologico, che dovrebbe includere tre concentrazioni di farmaco e un controllo.
   8. Incubare sia gli embrioni trapiantati che i controlli non trapiantati a 28 °C per 1-3 ore prima di iniziare il trattamento farmacologico.
4. Trattamento farmacologico in vivo (piastra a 96 pozzetti)
   1. Utilizzando la stereomicroscopia fluorescente, esaminare gli embrioni per confermare l'attecchimento riuscito (Figura 2C). Assicurarsi che il tuorlo sia integro, poiché l'ambiente del tuorlo potrebbe essere tossico per l'innesto di cellule²¹. Scartare gli embrioni con cellule nel tuorlo.
   2. Preparare 2,5 mL di una soluzione concentrata 2x per ciascuna condizione del farmaco da testare in E3/P/S con DMSO allo 0,5%. Inoltre, preparare una soluzione di controllo del veicolo da 5 ml contenente lo 0,5% di DMSO in E3/P/S.
   3. Aggiungere 100 μl di E3/P/S + 0,5% di DMSO a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Questo passaggio impedisce il trasferimento involontario di quantità minime di farmaco tra i pozzetti.
   4. Trasferisci con cura un embrione innestato in ogni pozzetto. Usa una pipetta di vetro Pasteur per prelevare ogni embrione nel minor numero possibile di terreno E3.
   5. Lasciare che l'embrione affondi sul fondo della punta della pipetta inclinando delicatamente la pipetta e rilasciarla nel pozzetto usando la forza capillare. Evitare di toccare il fluido nel pozzetto durante il trasferimento.
   6. Aggiungere soluzioni farmacologiche alla piastra: Riempire 24 pozzetti (2 file) della piastra a 96 pozzetti con 100 μl della soluzione di controllo del veicolo o di una delle tre soluzioni farmacologiche concentrate 2x.
      NOTA: Le concentrazioni efficaci del farmaco devono essere determinate in esperimenti precedenti specifici per ciascun farmaco testato.
   7. Mantenere gli embrioni a 35 °C per 72 ore, compresi gli embrioni non trapiantati, che serviranno come controlli per l'analisi di citometria a flusso il giorno 7.

6. Giorno 7

1. Dissociazione embrione/trapianto
   1. Screening della piastra a 96 pozzetti mediante stereomicroscopia per identificare e selezionare embrioni sani di zebrafish. Raggruppare in modo casuale 10 embrioni ospiti sani di ciascuna condizione in una provetta per microcentrifuga da 1,5 ml (idealmente ottenendo 2 provette per condizione).
   2. Rimuovere quanto più liquido possibile da ogni provetta contenente embrioni e sacrificare gli embrioni mediante shock ipotermico incubando le provette su ghiaccio per 1 ora.
   3. Aggiungere 500 μl di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) priva di calcio e magnesio in ciascuna provetta. Dissociare meccanicamente gli embrioni e le cellule del trapianto mediante triturazione utilizzando un puntale per micropipetta da 200 μl, pipettando su e giù di circa 15 volte.
   4. Pellettare i frammenti di tessuto mediante centrifugazione a 350 x g per 5 minuti a RT. Nel frattempo, preparare le provette FACS con un tappo del filtro a maglia fine da 35 μm contenente 2 mL di PBS per condizione (4 provette in totale).
   5. Risospendere ogni pellet in 500 μL di miscela enzimatica (0,01% papaina, 0,1% dispasi II, 0,01% desossiribonucleasi I e 12,4 mM di MgSO₄ in HBSS privo di calcio e magnesio) per la dissociazione enzimatica. Incubare a RT per 15 min.
   6. Durante l'incubazione, pipettare ripetutamente la miscela su e giù ogni 5 minuti utilizzando lo stesso puntale per pipetta per ogni singola provetta per evitare la perdita di tessuto.
2. Misurazione della citometria a flusso
   1. Trasferire le cellule dissociate nel tappo del filtro a maglia fine da 35 μm delle provette FACS e centrifugare a 350 x g per 5 minuti.
   2. Durante la centrifugazione, preparare una miscela master per la colorazione superficiale delle cellule B CD19. Combinare 98 μL di ABB con 2 μL di anticorpo CD19 anti-umano Alexa Fluor 488 per ogni condizione.
   3. Scartare il surnatante dal pellet di cella dissociata e risospendere il pellet in 100 μl della miscela master di colorazione CD19.
   4. Eseguire il protocollo di colorazione CD19, 7AAD e APC Annexin V per tutti i campioni ZefiX, comprese 3 x 10^{cellule 5} CTV-positive da colture cellulari parallele, se disponibili.
   5. Eseguire l'analisi di citometria a flusso seguendo l'ordine e registrare il numero di eventi descritti nella Tabella 2. Analizzare tutti i campioni contenenti cellule ospite e innesto nel modo più completo possibile per valutare il numero totale di cellule dell'innesto.
3. Analisi dei risultati utilizzando software commerciali.
   1. Strategia di gating per il campione di coltura cellulare: aprire il software e caricare i file FCS nell'area di lavoro. Crea un grafico a punti con CD19 e CTV per assicurarti che il segnale si sovrapponga e per confermare la presenza delle cellule tumorali. Quindi, crea un dot plot con FSC-A (asse x) e SSC-A (asse y) per distinguere le celle intatte (Q2) dai detriti (Q4; Figura 3A').
   2. Utilizzare la popolazione di celle intatte per creare un nuovo grafico con SSC-H (asse x) e SSC-A (asse y) per identificare le singole celle (Figura 3A'').
   3. Crea un altro grafico a punti con l'annessina V (asse x) e 7AAD (asse y) utilizzando la popolazione di singole celle (Figura 3A'''). Distinguere le cellule in quattro popolazioni: Cellule vitali: Annessina V negativa, 7AAD negativa (Q4); Cellule apoptotiche precoci: Annessina V positiva, 7AAD negativa (Q3); Cellule apoptotiche/necrotiche tardive: Annessina V positiva, 7AAD positiva (Q2); Cellule necrotiche: Annessina V negativa, 7AAD positiva (Q1).
   4. Ripetere questi passaggi per campioni a 3 dpi (Figura 3B).
   5. Strategia di gating per le cellule embrionali del trapianto e dell'ospite
      1. Separare le cellule del trapianto umano dalle cellule ospiti utilizzando un grafico a punti con CTV (asse x) e CD19 (asse y). Identificare e isolare le cellule del trapianto doppio positivo di CTV/CD19 (Figura 3C).
      2. Applicare la stessa strategia di gating descritta per le cellule di coltura a 3 dpi (Figura 3B' - B''') alla popolazione di cellule del trapianto. Copia la strategia di gating per coerenza.
      3. Unire tutte le popolazioni cellulari negative all'annessina V e 7AAD in un istogramma con i valori CTV sull'asse x (Figura 3D). Calcolare la media geometrica per tutti e cinque i campioni per determinare i tassi di proliferazione.
4. Calcoli per la valutazione della risposta al trattamento
   1. Per determinare il numero di divisioni cellulari dopo 3 giorni, utilizzare la formula:
      n = log₂ (I₀/I)
      Dove, I₀ = Intensità iniziale della fluorescenza CTV (media geometrica, 0 dpi), I = Intensità della fluorescenza CTV a 72 h, n = Numero di divisioni cellulari.
      Esempio: cellule di pazienti appena congelate divise 2,6x in ZefiX log₂(88317/14644) = 2,6
      e 2,8x nel registro delle colture 2D₂(88317/12992) = 2,8
   2. Per determinare il numero totale di cellule del trapianto per pesce dopo 3 giorni, dividere il numero totale di cellule tumorali (comprese le cellule apoptotiche ma esclusi i detriti) per il numero di pesci raggruppati nel campione (tipicamente n = 10).
   3. Per determinare la vitalità delle cellule del trapianto CTV-positive dopo 3 giorni, utilizzare la formula:
      V = (C/100) x A
      Dove: V = vitalità, C = frazione di singole cellule intatte senza detriti (in percentuale), A = frazione di annessina V- e cellule 7AAD-negative (in percentuale).

Risultati

Per una valutazione scientifica dettagliata del protocollo ZefiX, compreso lo xenotrapianto e il trattamento farmacologico di campioni di cellule primarie BCP-ALL appena congelate, fare riferimento al manoscritto²¹ precedentemente pubblicato. L'approvazione per l'uso di campioni di pazienti nella ricerca per la sperimentazione preclinica di farmaci è stata concessa nell'ambito di studi aggiuntivi allo studio ALL-REZ BFM 2002 (NCT00114348) e al registro e alla bi...

Discussione

Gli embrioni di zebrafish sono diventati un modello di xenotrapianto sempre più popolare per lo screening farmacologico e la ricerca sul cancro grazie alla loro elevata capacità di produzione e al rapporto costo-efficacia. Questi xenotrapianti sono promettenti come pilastro fondamentale della medicina traslazionale, aiutando la ricerca preclinica e il processo decisionale ^9,21. Tuttavia, i modelli di xenotrapianto di zebrafish ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri dish  (10 cm)	Greiner	P7237
7-AAD viability staining solution	Invitrogen	00-6993-50
Agarose (LE, analytic grade)	Biozym	840004
Air pressure injector	Narishige	IM400	with external gas supply
Alexa Fluor 488 anti-human CD19 antibody	Biolegend	302219
Annexin binding buffer	Biolegend	422201	Or see solutions for preparation
APC annexin V	Biolegend	640941
Capillaries (10 cm, OD 1.0 mm, with filaments)	WPIINC	TW100F-4	1.0 OD; 0.75 ID
Cell culture flask (T-175)	Sarstedt	83,39,12,002
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Roth	A994.1
Dispase II	Sigma Aldrich	D4693-1g
DNase I	AppliChem GmbH	A3778
Eppendorf tubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
FACS tube (Polystyrene round botton Tube with Cell strainer Cap, 5 ml)	Falcon	352235
Falcon tubes (50 ml)	Falcon	352070
Fetal calf serum (FCS)	Sigma Aldrich	C8056
Fine mesh filter (10 µm)	PluriStrainer	435001050
Fine mesh filter (20 µm)	PluriStrainer	431002040
Flow cytometer	Becton Dickinson	BD LSRFortessa X-20
Fluorescent stereomicroscope	Leica
Fluorescent stereomicroscope with camera	Leica	M165 FC	Camera: DFC7000 T
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, Calcium and Magnesium free )	Sigma Aldrich	88284
Injection mold (Zebrafish MI/Transplant KIT)	World Precision Instruments	Z-MOLDS
Injection needles (without filament)	Biomedical instruments	VZIPbl-20-10-55	Zebrafish injection pipette, blunt, OD: 20μm ± 1, TL:~10mm, PL: 55mm, Glass: BM100T-10P
Macro-centrifuge	Eppendorf
Micro-centrifuge
Morpholino (csf3r)	Gene Tools LLC	csf3r (GAAGCACAAGCGA GACGGATGCCA)
Morpholino (spi1)	Gene Tools LLC	spi1(GATATACTGATAC TCCATTGGTGGT)
Papain	Sigma Aldrich	P3125
Penicillin-Streptomycin (Penstrep; 10.000 U/ml)	Gibco	15140122
Plates (4-well)	Greiner Bio one	657160
Plates (96-well)	Greiner Bio one	657180
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Gibco	21875-034
Tricaine  (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-50G	Ethy-3 aminobenzoate methanesulfenate