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Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per la generazione e la risoluzione dei problemi di xenotrapianti di leucemia linfoblastica acuta umana (ALL) da linee cellulari e materiale fresco del paziente in embrioni di zebrafish transitoriamente immunosoppressi, insieme a linee guida per la valutazione della risposta ai farmaci mediante citometria a flusso. La pipeline sperimentale può essere adattata anche per i tumori solidi.
Lo xenotrapianto di pesce zebra è una tecnica fondamentale per studiare la patogenesi del cancro umano e prevedere le risposte individuali ai farmaci. Questo documento introduce un protocollo semplificato (ZefiX) per l'espansione di campioni di pazienti affetti da leucemia linfoblastica acuta precursore delle cellule B primarie (BCP-ALL) o di linee cellulari immortalizzate in embrioni di zebrafish immunosoppressi transitoriamente, utilizzando la citometria a flusso per l'analisi ad alta risoluzione di singole cellule delle risposte al trattamento. Rispetto agli attecchimenti tumorali solidi, le cellule leucemiche traggono vantaggio in modo significativo da una soppressione basata su oligonucleotidi morfolino antisenso dei fattori differenzianti dei macrofagi e dei neutrofili durante il test. L'analisi con citometria a flusso di cellule di trapianto dissociate consente una valutazione precisa della conta cellulare, del tasso di proliferazione e della vitalità dopo il trattamento su base per singola cellula. Questo approccio è stato convalidato utilizzando terapie mirate come venetoclax e dasatinib, con risultati di trattamento confrontati con le cartelle cliniche di campioni di pazienti correlati e i tradizionali controlli di coltura 2D. In particolare, il protocollo viene completato entro 7 giorni, in linea con le tempistiche del processo decisionale clinico. La metodologia è adattabile per testare farmaci selezionati in vari tipi di cancro, compresi i tumori solidi, supportando così strategie terapeutiche personalizzate. Tuttavia, dovrebbero essere prese in considerazione limitazioni sul numero di farmaci che possono essere valutati, probabilmente a causa di vincoli farmacocinetici negli embrioni di zebrafish.
Lo xenotrapianto di pesce zebra è diventato un modello cruciale in vivo per comprendere la patogenesi del cancro e prevedere le risposte ai farmaci 1,2,3,4,5. I modelli animali rimangono fondamentali per i test preclinici sui farmaci e il modello zebrafish offre vantaggi significativi rispetto ad altri sistemi in vivo, tra cui un'elevata produttività e l'efficienza dei costi 6,7,8. Questo modello potrebbe anche aiutare a prevedere la risposta al trattamento personalizzata, comprese le terapie a bersaglio molecolare e la terapia cellulare CAR-T 9,10,11,12.
La BCP-ALL può trarre particolare beneficio dallo xenotrapianto di zebrafish, poiché l'espansione delle cellule primarie dei pazienti in coltura rimane impegnativa13. C'è un innegabile bisogno di nuovi approcci terapeutici nella LLA. Nonostante un alto tasso di remissione dell'80%-85% nei bambini con BCP-ALL, i tassi di sopravvivenza a lungo termine per i pazienti con malattia recidivante o refrattaria variano solo tra circa il 30%-60%14,15,16. In tali casi, i test farmacologici che utilizzano la pipeline proposta potrebbero essere integrati nel contesto clinico per identificare la terapia ottimale specifica per il paziente14,15. Questo approccio personalizzato può essere cruciale quando si tratta di più resistenze ai farmaci, riducendo significativamente il carico di trattamento per i pazienti evitando farmaci inefficaci o non ottimali con gravi effetti collaterali.
Diverse caratteristiche rendono lo xenotrapianto di embrioni di pesce zebra un modello adatto. Le somiglianze genetiche tra l'uomo e il pesce zebra - 70% di omologia genetica e 84% di geni legati alla malattia condivisi - supportano gli studi sull'interazione gene-farmaco17. L'utilizzo di un embrione ospite transgenico può quindi rivelare predisposizioni genetiche che influenzano la suscettibilità ai farmaci18. In alternativa, le cellule con specifiche modificazioni genetiche possono essere trapiantate per valutare se la sensibilità o la resistenza al farmaco si allinea con i risultati in vitro . Gli xenotrapianti di embrioni di pesce zebra forniscono anche informazioni sui potenziali effetti sistemici dei farmaci. Sebbene lo sviluppo degli organi negli embrioni di 2-3 giorni non sia completamente maturo, gli organi sono localizzati correttamente e condividono in parte la composizione cellulare con le loro controparti adulte19.
Ulteriori vantaggi di questo modello includono che sono necessarie solo poche cellule tumorali per l'attecchimento, il mantenimento degli embrioni ospiti è semplice, poiché non è richiesta alcuna alimentazione entro i primi 5 giorni di vita e il successo dell'iniezione può essere valutato rapidamente grazie alla trasparenza e alle dimensioni degli embrioni. Una caratteristica unica è che solo l'immunità innata è attiva in questa fase dello sviluppo, facilitando un attecchimento efficiente20. Nel protocollo ZefiX qui descritto (vedi riassunto in Figura 1), l'immunodeficienza è ulteriormente potenziata sopprimendo il sistema immunitario innato durante i primi 4 giorni di vita utilizzando oligonucleotidi antisenso Morpholino stabili che hanno come bersaglio spi1 e csf3r, che bloccano la differenziazione dei macrofagi e dei neutrofili 21,22,23.
Questo protocollo differisce anche dai precedenti protocolli di xenotrapianto di zebrafish, che sono stati sviluppati principalmente per innesti tumorali solidi e utilizzano tipicamente metodi di valutazione della risposta ai farmaci basati sull'imaging a montaggio intero. ZefiX è ottimizzato per le cellule tumorali liquide, come le cellule BCP-ALL, ed è stato utilizzato con successo per espandere il materiale fresco o congelato del paziente21. ZefiX può anche essere adattato per le cellule tumorali aderenti selezionando enzimi appropriati per la dissociazione tissutale.
Un altro grande vantaggio è l'analisi a valle che utilizza la citometria a flusso, che offre diversi vantaggi: (i) un gran numero di cellule del trapianto può essere elaborato rapidamente, consentendo una solida analisi statistica a livello di singola cellula, (ii) il tasso di proliferazione e la vitalità possono essere valutati simultaneamente nelle singole cellule e (iii) i citometri a flusso sono comunemente disponibili in contesti di ricerca clinica, Consentire la valutazione della risposta ai farmaci delle cellule del trapianto a livello di singola cellula entro poche ore. Per garantire la riproducibilità, questo protocollo fornisce una pipeline standardizzata dalla preparazione al trapianto fino all'analisi della citometria a flusso, consentendo la previsione della risposta ai farmaci nelle cellule ALL entro una settimana.
Tutti gli esperimenti sul pesce zebra sono conformi alle linee guida dell'Istituto di ricerca per la medicina sperimentale della Charité-Universitätsmedizin di Berlino e alle autorità ufficiali. Tutti gli studi hanno coinvolto embrioni di pesce zebra < 6 giorni dopo la fecondazione (dpf), esentandoli dalla legge sulla protezione degli animali. Il pesce zebra (Danio rerio) è stato allevato e mantenuto presso la struttura per animali della Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlino, Germania, secondo protocolli standard. Sono stati alloggiati a 28 °C con un ciclo di luce di 14 ore e buio di 10 ore. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati pesci selvatici di ceppi AB o TüLF.
NOTA: Stabilire le condizioni di trattamento ottimali per ciascun farmaco desiderato prima dell'applicazione di ZefiX include diversi passaggi necessari. Innanzitutto, determinare la concentrazione inibitoria semimassima (IC50) di ciascun farmaco utilizzando una linea cellulare adatta all'interno di un sistema di coltura 2D convenzionale. Sulla base dell'esperienza precedente, le concentrazioni efficaci del farmaco per il trattamento con ZefiX possono essere 5 volte - 50 volte superiori a quelle utilizzate in condizioni tipiche di coltura cellulare21,24. Prima di trattare gli embrioni trapiantati, è essenziale valutare la tossicità all'interno degli embrioni ospiti non trapiantati utilizzando l'intervallo di concentrazione stabilito. Dopo aver valutato la tossicità, esporre gli embrioni trapiantati in linea cellulare a una varietà di concentrazioni di farmaci circa 50 volte il valore IC50 precedentemente determinato in coltura 2D. Se le cellule trapiantate non mostrano alcuna risposta a dosaggi fino a 100 volte l'IC50, il farmaco può essere considerato inefficace per ZefiX. Per migliorare potenzialmente l'efficacia, un'opzione è quella di precondizionare le cellule del trapianto con il farmaco poco prima del loro trapianto in embrioni25. Vedere la Tabella 1 per tutte le soluzioni utilizzate qui.
1. Giorno 1: Preparazione per l'esperimento
2. Giorno 2: Iniezione di Morpholino
3. Giorno 3: De-corionazione
4. Giorno 4: Xenotrapianto e trattamento farmacologico
5. Trapianto
6. Giorno 7
Per una valutazione scientifica dettagliata del protocollo ZefiX, compreso lo xenotrapianto e il trattamento farmacologico di campioni di cellule primarie BCP-ALL appena congelate, fare riferimento al manoscritto21 precedentemente pubblicato. L'approvazione per l'uso di campioni di pazienti nella ricerca per la sperimentazione preclinica di farmaci è stata concessa nell'ambito di studi aggiuntivi allo studio ALL-REZ BFM 2002 (NCT00114348) e al registro e alla biobanca ALL-REZ BFM (EA2/055/12) dai comitati etici locali per la ricerca medica, nonché allo studio internazionale IntReALL SR 2010 (NCT01802814) dall'autorità nazionale. Il consenso informato è stato ottenuto dai pazienti e/o dai loro tutori attraverso il rispettivo studio o registro in cui sono stati arruolati.
La Figura 2 illustra un esempio di allineamento dell'embrione in una capsula di agarosio prima dell'iniezione, che aiuta a semplificare il processo di iniezione. L'iniezione deve essere eseguita con l'angolo raffigurato per mirare con precisione alla cavità che circonda il cuore in via di sviluppo. Inoltre, la Figura 2C fornisce un riferimento di embrioni 2 dpf iniettati con successo contenenti cellule di trapianto umano (blu), che sono stati marcati con CTV prima dell'iniezione. Sono stati esclusi gli embrioni con esiti di iniezione diversi da quelli mostrati nella Figura 2C , con particolare attenzione a evitare la perforazione del sacco vitellino per garantire la vitalità delle cellule del trapianto durante i successivi tre giorni di incubazione.
Dopo il periodo di incubazione di tre giorni, gli embrioni ospiti vengono processati in gruppi di 10 per l'analisi della citometria a flusso. Dopo la dissociazione enzimatica, le sospensioni cellulari vengono colorate con un anticorpo anti-CD19 umano e due marcatori vitali: l'annessina V per le cellule apoptotiche precoci e 7AAD per le cellule apoptotiche e necrotiche tardive.
La Figura 3 presenta i dati della citometria a flusso delle cellule BCP-ALL espanse ZefiX da un paziente con BCP-ALL. I pannelli A, A', A'' e A''' mostrano i dati raccolti a 0 dpi il giorno del trapianto. La Figura 3A mostra i valori di fluorescenza CTV e CD19 per un totale di 10.000 cellule come riferimento per la strategia di gating applicata alle sospensioni cellulari ospite-innesto a 3 dpi (Figura 3C). Nella Figura 3A, i detriti sono esclusi attraverso il gating regolare delle celle utilizzando l'area di dispersione diretta (FSC-A) e l'area di dispersione laterale (SSC-A). Nella Figura 3A'', le singole celle sono separate dai doppietti utilizzando un grafico dell'altezza SSC (SSC-H) rispetto a SSC-A. Questa popolazione di singole cellule viene utilizzata per la valutazione della vitalità nella Figura 3A''', dove le cellule vitali (Q4) sono distinte dalle cellule apoptotiche precoci (Q3, valori più elevati di Annexina V) e dalle cellule apoptotiche o necrotiche tardive (Q2, livelli più elevati di 7AAD).
Per confronto, le cellule dei pazienti coltivate in condizioni 2D convenzionali vengono analizzate anche mediante citometria a flusso dopo tre giorni (Figure 3B, B', B'', B'''), seguendo la stessa strategia di gating. La vitalità delle cellule del paziente dopo 72 ore in coltura 2D è calcolata da Q2 nella Figura 2B' ' e Q4 nella Figura 2B''': (95,0%/100)*61,9% = 58,8%.
Nella Figura 3C, il materiale di partenza è la sospensione cellulare da embrioni ospiti contenenti cellule del trapianto. A differenza delle misurazioni in vitro, tutte le cellule nella provetta vengono analizzate mediante citometria a flusso. Le cellule del trapianto CD19 e CTV-positive sono gated per separarle dalle cellule di pesce CD19 e CTV-negative. La popolazione di cellule intatte dell'innesto viene ulteriormente analizzata nella Figura 3C', dove i detriti sono esclusi. La vitalità delle singole cellule del trapianto viene quindi valutata utilizzando la stessa strategia di gating delle Figure 3B.
I risultati indicano che la percentuale di singole cellule vitali espanse negli embrioni è del 95,2%, che è 1,6 volte superiore alla vitalità delle cellule coltivate in un piatto (Figura 3B'''). I tassi di divisione cellulare sono stati calcolati in vivo e in vitro analizzando la diminuzione dell'intensità di fluorescenza del CTV in ciascuna popolazione da 0 dpi a 3 dpi (Figura 3D). Il numero di divisioni cellulari è stato determinato utilizzando la formula nella Sezione 6.4.1 e la media geometrica di ciascuna curva CTV (Figura 3D). I tassi di divisione calcolati (2,59 divisioni in vivo e 2,77 divisioni in vitro) suggeriscono che le cellule vitali si dividono a un tasso simile in entrambe le condizioni nell'arco di tre giorni.
Infine, il numero medio di cellule del trapianto intatte per embrione dopo tre giorni è stato determinato dividendo il numero di cellule del trapianto intatte (esclusi i detriti, Figura 3C') per il numero di embrioni raggruppati in una provetta21.
In conclusione, i campioni freschi di BCP-ALL trapiantati in embrioni di zebrafish mostrano una maggiore vitalità dopo tre giorni rispetto alla coltura convenzionale in una piastra e le cellule vitali si dividono a una velocità comparabile in entrambe le condizioni.
Figura 1. Flusso di lavoro della pipeline ALL-ZefiX. Creato nel https://BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Disposizione dell'iniezione. (A) La disposizione degli embrioni come illustrato facilita l'iniezione. Gli embrioni possono essere disposti utilizzando una pinza o con una punta per pipetta microloader da 20 μl che è stata tagliata per avere una punta di 2,5 - 3 cm di lunghezza. (B) Rappresentazione schematica dell'angolo di iniezione raccomandato per innestare le cellule nel pericardio di 2 embrioni dpf. (C) Ausili visivi per stimare correttamente la quantità di cellule tumorali trapiantate. Questa immagine mostra un embrione di 48 hpf a 3 ore dopo l'iniezione con cellule tumorali umane precedentemente marcate con CellTrace Violet). Creato nel https://BioRender.com. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Strategia di gating e analisi della citometria a flusso di un campione fresco congelato derivato da un paziente di cellule blastiche BCP-ALL isolate dopo coltura 2D di attecchimento in embrioni di zebrafish. (A, B) Le cellule del paziente sono state marcate con CellTrace Violet (CTV) prima della coltura. Le cellule sono state coltivate su plastica per colture tissutali a 37 °C per 0 ore (A) o 72 ore (B) prima dell'analisi di citometria a flusso. (C) Cellule di pazienti marcate con CTV e cresciute a 35 °C per 72 ore come innesti in embrioni di zebrafish ospite. Un gruppo di 10 embrioni è stato raggruppato prima della dissociazione di singole cellule per l'analisi della citometria a flusso. È stata applicata la strategia di gating in (B) ed è stata identificata e quantificata la frazione di cellule dell'innesto vitale. Per fare ciò, le cellule del trapianto CTV-positive (Q2) sono state separate dalle cellule di zebrafish autofluorescenti (Q1/4) per selezionare la popolazione di cellule del trapianto per l'analisi. L'intensità della marcatura CTV è stata analizzata in questa popolazione di cellule di innesto. (D) Conta cellulare e intensità media delle marcature CTV solo dalla selezione di cellule vitali. Si noti lo spostamento dell'intensità CTV dopo 3 giorni (3 dpi). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Tabella delle soluzioni utilizzate. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 2: Campioni misurati mediante citometria a flusso. Clicca qui per scaricare questa tabella.
Gli embrioni di zebrafish sono diventati un modello di xenotrapianto sempre più popolare per lo screening farmacologico e la ricerca sul cancro grazie alla loro elevata capacità di produzione e al rapporto costo-efficacia. Questi xenotrapianti sono promettenti come pilastro fondamentale della medicina traslazionale, aiutando la ricerca preclinica e il processo decisionale 9,21. Tuttavia, i modelli di xenotrapianto di zebrafish per l'espansione e il trattamento delle cellule della leucemia umana rimangono sottorappresentati rispetto all'ampio corpus di lavoro sugli innesti tumorali solidi. Questo protocollo offre una guida dettagliata per sfruttare gli xenotrapianti di zebrafish nella ricerca sulla leucemia, pur rimanendo adattabile per l'uso nei tumori solidi.
Ottenere un trapianto coerente di cellule tumorali può essere impegnativo, evidenziando la necessità di un'analisi standardizzata e di una maggiore affidabilità statistica. Questo protocollo affronta questi problemi presentando una pipeline completa per la preparazione, il trapianto e l'analisi della citometria a flusso a valle, insieme a raccomandazioni per la risoluzione dei problemi.
Iniezione di morfolino per la soppressione immunitaria transitoria
Gli embrioni di zebrafish si affidano al loro sistema immunitario innato durante i primi giorni di sviluppo, che definisce il periodo di tempo per questa pipeline sperimentale20. I macrofagi primitivi emergono intorno a 12 hpf, con alcuni che si differenziano in neutrofili di 33 hpf 20,31,32. Le cellule T entrano in circolo a circa 8 giorni dopo la fecondazione 20,33. I macrofagi e i neutrofili, come parte della risposta immunitaria innata, sono stati implicati nella ridotta sopravvivenza delle cellule BCP-ALL osservata tre giorni dopo il trapianto in studi precedenti21.
La soppressione immunitaria temporale mediata da morfolino, mirata a spi1 e csf3r, inibisce efficacemente la differenziazione di macrofagi e neutrofili, portando a un migliore attecchimento delle cellule BCP-ALL senza influire sulla vitalità dell'embrione21. Sebbene questo metodo non possa raggiungere l'esaurimento permanente, poiché il knockout completo di spi1 e csf3r è letale, rimane l'approccio migliore per questa pipeline.
La calibrazione dei volumi di iniezione utilizzando un reticolo e l'erogazione precisa nel sacco vitellino allo stadio di una cellula garantiscono iniezioni costanti di Morpholino con alti tassi di sopravvivenza. Alternative come le iniezioni di clodronato liposomiale (clodrosoma) per la deplezione dei macrofagi si sono dimostrate promettenti, ma richiedono un'ulteriore convalida per questa pipeline34,35.
Preparazione delle cellule
Una popolazione cellulare sufficientemente densa e vitale è fondamentale per il successo dell'espansione di BCP-ALL in questo protocollo. CellTrace Violet (CTV) viene utilizzato per la marcatura fluorescente per valutare il successo dell'impianto a 0 dpi e per monitorare i tassi di proliferazione durante l'esperimento. A differenza di altre marcature, la CTV non altera il comportamento cellulare, consentendo un'analisi precisa della proliferazione a livello di singola cellula. Ciò offre vantaggi rispetto alla colorazione con anticorpi Ki-67, che cattura solo le cellule durante la proliferazione, ma non le cellule divise che sono già uscite dal ciclo cellulare.
La CTV supera anche CellTracker CM-DiI (DiI) nel riflettere la vitalità cellulare. DiI e i suoi derivati sono fluorofori più stabili, spesso persistenti oltre la morte cellulare, il che può confondere i risultati sperimentali2. Inoltre, l'inclusione di un anticorpo specifico per BCP-ALL contro CD19 nella citometria a flusso consente un'identificazione precisa delle cellule del trapianto. Gli anticorpi specifici per l'uomo, come l'anti-HLA, possono fungere da alternative per altri tipi di cellule tumorali36.
Trapianto di cellule tumorali
L'attecchimento costante richiede una diluizione e una concentrazione ottimali della sospensione cellulare. La sospensione deve mantenere una densità sufficiente evitando viscosità che compromette l'iniezione. Questo protocollo dà la priorità all'iniezione nella cavità pericardica o nello spazio perivitellino (PVS) rispetto al sacco vitellino, poiché questi siti offrono una migliore vascolarizzazione e condizioni meno ipossiche37. Il trapianto del sacco vitellino, sebbene accessibile, spesso comporta alti tassi di mortalità e scarsa vitalità cellulare21.
L'intasamento dell'ago dovuto alle microparticelle rimane una sfida procedurale. Il filtraggio della sospensione cellulare e la ricalibrazione dei volumi di iniezione dopo aver tagliato gli aghi ostruiti sono passaggi essenziali. Solo gli embrioni con pericardia densamente riempita dovrebbero essere utilizzati per i successivi trattamenti farmacologici21,36.
La temperatura di incubazione suggerita di 35 °C bilancia la temperatura naturale delle cellule tumorali umane (37 °C) e la temperatura standard di stabulazione del pesce zebra (28 °C)21. Gli embrioni di zebrafish si adattano a questa temperatura con deformazioni minime dello sviluppo e l'ambiente migliora la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule fresche derivate dai pazienti38.
Trattamento della tossicodipendenza
I modelli di xenotrapianto di zebrafish sono stati sviluppati per facilitare lo screening dei farmaci ad alto rendimento. Tuttavia, il trattamento farmacologico rimane uno degli aspetti più impegnativi del test ZefiX. Molti farmaci standard e terapie mirate non raggiungono efficacemente le cellule del trapianto in vivo. Potrebbe anche richiedere il test di un pannello più ampio di concentrazioni di farmaci. Esempi di successo, come venetoclax e dasatinib, richiedono concentrazioni significativamente più elevate rispetto ai saggi di coltura 2D convenzionali21.
In alternativa, il pretrattamento delle cellule in vitro prima del trapianto consente anche di studiare alcuni effetti sistemici e localizzati. Ad esempio, questo approccio può essere adatto per i trattamenti basati sul virus adeno-associato (AAV) nel glioblastoma39.
Se gli effetti del trattamento farmacologico sono osservati in vitro ma non in vivo utilizzando questa pipeline, un'alternativa potrebbe essere, ad esempio, il trapianto nello stadio di 1k cellule (3 hpf) o nello stadio di blastula e iniziare il trattamento farmacologico a 24 hpf40,41. Ciò potrebbe consentire ai farmaci di raggiungere le cellule del trapianto che non hanno successo in embrioni di 48 ore o alla co-iniezione di cellule e farmaci allo stesso tempo25.
Analisi di dissociazione e citometria a flusso
La dissociazione tissutale è fondamentale per analizzare il numero totale di cellule del trapianto e interpretare in modo affidabile i risultati sperimentali. Una combinazione di dissociazione meccanica ed enzimatica garantisce una sospensione di una singola cellula di alta qualità, mantenendo l'integrità delle proteine sulla superficie cellulare. La regolazione delle condizioni di dissociazione (ad esempio, la composizione enzimatica, il pipettaggio o l'uso di un omogeneizzatore Dounce) può essere necessaria per diversi tipi di cancro.
I campioni devono essere filtrati per evitare l'intasamento del citometro a flusso e le proteine appiccicose o i lipidi possono essere mitigati con EDTA o deyolking dell'embrione prima della dissociazione.
Sommario
Il protocollo ZefiX fornisce una pipeline sperimentale rapida ed economica per la ricerca preclinica sul cancro, gli studi di resistenza ai farmaci e le valutazioni personalizzate dei trattamenti. Sebbene i modelli di xenotrapianto di zebrafish abbiano limitazioni e non possano adattarsi a tutti i tipi di farmaci, questo protocollo standardizzato consente l'espansione in vivo di cellule e linee cellulari di leucemia di pazienti freschi. Adattabile ad altri tipi di cancro, offre uno strumento promettente per la previsione rapida e personalizzata della risposta ai farmaci entro i tempi del processo decisionale clinico.
Tutti gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) nell'ambito del Collaborative Research Center CRC1588, progetto numero 493872418 e dalla Dr. Kleist Stiftung, Berlino, nonché dalla Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung (R03/2016), dalla Berliner Krebsgesellschaft (HEFF201633KK) e dal German Cancer Consortium (DKTK, Joint Funding Call 2016). Ringraziamo Julia Köppke e Mareike Wolff per la loro lettura critica del manoscritto.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Petri dish (10 cm) | Greiner | P7237 | |
7-AAD viability staining solution | Invitrogen | 00-6993-50 | |
Agarose (LE, analytic grade) | Biozym | 840004 | |
Air pressure injector | Narishige | IM400 | with external gas supply |
Alexa Fluor 488 anti-human CD19 antibody | Biolegend | 302219 | |
Annexin binding buffer | Biolegend | 422201 | Or see solutions for preparation |
APC annexin V | Biolegend | 640941 | |
Capillaries (10 cm, OD 1.0 mm, with filaments) | WPIINC | TW100F-4 | 1.0 OD; 0.75 ID |
Cell culture flask (T-175) | Sarstedt | 83,39,12,002 | |
CellTrace Violet | Invitrogen | C34557 | |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Roth | A994.1 | |
Dispase II | Sigma Aldrich | D4693-1g | |
DNase I | AppliChem GmbH | A3778 | |
Eppendorf tubes (1.5 ml) | Eppendorf | 30120086 | |
FACS tube (Polystyrene round botton Tube with Cell strainer Cap, 5 ml) | Falcon | 352235 | |
Falcon tubes (50 ml) | Falcon | 352070 | |
Fetal calf serum (FCS) | Sigma Aldrich | C8056 | |
Fine mesh filter (10 µm) | PluriStrainer | 435001050 | |
Fine mesh filter (20 µm) | PluriStrainer | 431002040 | |
Flow cytometer | Becton Dickinson | BD LSRFortessa X-20 | |
Fluorescent stereomicroscope | Leica | ||
Fluorescent stereomicroscope with camera | Leica | M165 FC | Camera: DFC7000 T |
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, Calcium and Magnesium free ) | Sigma Aldrich | 88284 | |
Injection mold (Zebrafish MI/Transplant KIT) | World Precision Instruments | Z-MOLDS | |
Injection needles (without filament) | Biomedical instruments | VZIPbl-20-10-55 | Zebrafish injection pipette, blunt, OD: 20μm ± 1, TL:~10mm, PL: 55mm, Glass: BM100T-10P |
Macro-centrifuge | Eppendorf | ||
Micro-centrifuge | |||
Morpholino (csf3r) | Gene Tools LLC | csf3r (GAAGCACAAGCGA GACGGATGCCA) | |
Morpholino (spi1) | Gene Tools LLC | spi1(GATATACTGATAC TCCATTGGTGGT) | |
Papain | Sigma Aldrich | P3125 | |
Penicillin-Streptomycin (Penstrep; 10.000 U/ml) | Gibco | 15140122 | |
Plates (4-well) | Greiner Bio one | 657160 | |
Plates (96-well) | Greiner Bio one | 657180 | |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium | Gibco | 21875-034 | |
Tricaine (MS-222) | Sigma Aldrich | E10521-50G | Ethy-3 aminobenzoate methanesulfenate |
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