Schnelle in vivo Vorhersage des Ansprechens auf Medikamente mit Hilfe von Leukämiezelltransplantaten in Zebrafischembryonen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Generierung und Fehlerbehebung von Xenotransplantaten der akuten lymphatischen Leukämie (ALL) beim Menschen aus Zelllinien und frischem Patientenmaterial in transient immunsupprimierten Zebrafischembryonen sowie Richtlinien für die Beurteilung des Ansprechens auf das Arzneimittel mittels Durchflusszytometrie. Die experimentelle Pipeline kann auch für solide Tumore angepasst werden.

Zusammenfassung

Die Zebrafisch-Xenotransplantation ist eine zentrale Technik zur Untersuchung der Pathogenese von Krebs beim Menschen und zur Vorhersage individueller Arzneimittelreaktionen. In diesem Dokument wird ein optimiertes Protokoll (ZefiX) für die Erweiterung von primären B-Zell-Vorläufern von Patienten mit akuter lymphatischer Leukämie (BCP-ALL) oder immortalisierten Zelllinien in transient immunsupprimierten Zebrafischembryonen vorgestellt, wobei die Durchflusszytometrie für die hochauflösende Einzelzellanalyse des Ansprechens auf die Behandlung verwendet wird. Im Vergleich zu soliden Tumortransplantationen profitieren Leukämiezellen signifikant von einer Morpholino-Antisense-Oligonukleotid-basierten Unterdrückung von Makrophagen- und Neutrophilen-Differenzierungsfaktoren während des Assays. Die durchflusszytometrische Analyse von dissoziierten Transplantatzellen ermöglicht eine präzise Bewertung der Zellzahl, der Proliferationsrate und der Vitalität nach der Behandlung auf Zellbasis. Dieser Ansatz wurde mit gezielten Therapeutika wie Venetoclax und Dasatinib validiert, wobei die Behandlungsergebnisse mit klinischen Aufzeichnungen verwandter Patientenproben und traditionellen 2D-Kulturkontrollen verglichen wurden. Bemerkenswert ist, dass das Protokoll innerhalb von 7 Tagen abgeschlossen wird, was mit den klinischen Entscheidungsfristen übereinstimmt. Die Methodik ist anpassungsfähig, um ausgewählte Medikamente bei verschiedenen Krebsarten, einschließlich solider Tumore, zu testen und so personalisierte therapeutische Strategien zu unterstützen. Es sollte jedoch eine Begrenzung der Anzahl der Arzneimittel in Betracht gezogen werden, die wahrscheinlich auf pharmakokinetische Einschränkungen bei Zebrafischembryonen zurückzuführen sind.

Einleitung

Die Zebrafisch-Xenotransplantation ist zu einem wichtigen In-vivo-Modell für das Verständnis der Krebspathogenese und die Vorhersage des Ansprechens auf Medikamente^geworden 1,2,3,4,5. Tiermodelle sind nach wie vor von entscheidender Bedeutung für präklinische Arzneimitteltests, und das Zebrafischmodell bietet erhebliche Vorteile gegenüber anderen In-vivo-Systemen, einschließlich eines hohen Durchsatzes und einer Kosteneffizienz ^6,7,8.  Dieses Modell könnte auch personalisierte Vorhersagen des Ansprechens auf die Behandlung unterstützen, einschließlich molekularer zielgerichteter Therapien und CAR-T-Zelltherapie 9,10,11,12.

BCP-ALL kann besonders von der Xenotransplantation von Zebrafischen profitieren, da die Expansion von primären Patientenzellen in Kultur nach wie vor eine Herausforderung darstellt¹³. Es besteht ein unbestreitbarer Bedarf an neuartigen Behandlungsansätzen bei ALL. Trotz einer hohen Remissionsrate von 80%-85% bei Kindern mit BCP-ALL liegen die Langzeitüberlebensraten bei Patienten mit rezidivierter oder refraktärer Erkrankung nur zwischen etwa 30%-60%14,15,16. In solchen Fällen könnten Arzneimitteltests mit der vorgeschlagenen Pipeline in das klinische Umfeld integriert werden, um die optimale patientenspezifische Therapie zu identifizieren^14,15. Dieser personalisierte Ansatz kann bei der Behandlung mehrerer Arzneimittelresistenzen von entscheidender Bedeutung sein und die Behandlungsbelastung für Patienten erheblich reduzieren, indem unwirksame oder suboptimale Medikamente mit schweren Nebenwirkungen vermieden werden.

Mehrere Merkmale machen die Zebrafischembryo-Xenotransplantation zu einem geeigneten Modell. Die genetischen Ähnlichkeiten zwischen Mensch und Zebrafisch - 70 % genetische Homologie und 84 % gemeinsame krankheitsbedingte Gene - unterstützen Studien zu Gen-Arzneimittel-Wechselwirkungen¹⁷. Die Verwendung eines transgenen Wirtsembryos kann somit genetische Prädispositionen aufdecken, die sich auf die Empfindlichkeit gegenüber Arzneimitteln auswirken¹⁸. Alternativ können Zellen mit spezifischen genetischen Modifikationen transplantiert werden, um zu beurteilen, ob die Empfindlichkeit oder Resistenz des Medikaments mit den In-vitro-Befunden übereinstimmt. Xenotransplantate von Zebrafischembryonen geben auch Aufschluss über die möglichen systemischen Wirkungen von Medikamenten. Obwohl die Organentwicklung bei 2-3 Tage alten Embryonen noch nicht vollständig ausgereift ist, sind die Organe korrekt lokalisiert und teilen sich teilweise die zelluläre Zusammensetzung mit ihren erwachsenen Gegenstücken¹⁹.

Weitere Vorteile dieses Modells sind, dass nur wenige Krebszellen für die Transplantation benötigt werden, die Erhaltung der Wirtsembryonen einfach ist, da innerhalb der ersten 5 Lebenstage keine Fütterung erforderlich ist, und der Injektionserfolg aufgrund der Transparenz und Größe der Embryonen schnell beurteilt werden kann. Ein einzigartiges Merkmal ist, dass in diesem Entwicklungsstadium nur die angeborene Immunität aktiv ist, was eine effiziente Transplantation ermöglicht²⁰. In dem hier beschriebenen ZefiX-Protokoll (siehe Zusammenfassung in Abbildung 1) wird die Immundefizienz durch Unterdrückung des angeborenen Immunsystems während der ersten 4 Lebenstage mit stabilen Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden verstärkt, die auf spi1 und csf3r abzielen und die Differenzierung von Makrophagen und Neutrophilen blockieren 21,22,23.

Dieses Protokoll unterscheidet sich auch von früheren Zebrafisch-Xenotransplantationsprotokollen, die in erster Linie für solide Tumortransplantate entwickelt wurden und in der Regel auf der Grundlage von Whole-Mount-Bildgebung Methoden zur Bewertung des Wirkstoffansprechens verwenden. ZefiX ist für flüssige Krebszellen, wie z. B. BCP-ALL-Zellen, optimiert und wurde erfolgreich zur Erweiterung von frischem oder frisch gefrorenem Patientenmaterial eingesetzt²¹. ZefiX kann auch für adhärente Krebszellen angepasst werden, indem geeignete Enzyme für die Gewebedissoziation ausgewählt werden.

Ein weiterer großer Vorteil ist die nachgelagerte Analyse mittels Durchflusszytometrie, die mehrere Vorteile bietet: (i) Eine große Anzahl von Transplantatzellen kann schnell verarbeitet werden, was eine robuste statistische Analyse auf Einzelzellebene ermöglicht, (ii) die Proliferationsrate und die Lebensfähigkeit können gleichzeitig in einzelnen Zellen beurteilt werden, und (iii) Durchflusszytometer sind in der klinischen Forschung üblich. Ermöglicht die Bewertung des Wirkstoffansprechens von Transplantatzellen auf Einzelzellebene innerhalb weniger Stunden. Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, bietet dieses Protokoll eine standardisierte Pipeline von der Vorbereitung über die Transplantation bis hin zur Durchflusszytometrie-Analyse, die eine Vorhersage des Ansprechens auf das Arzneimittel in ALLEN Zellen innerhalb einer Woche ermöglicht.

Protokoll

Alle Zebrafischversuche entsprechen den Richtlinien der Charité-Universitätsmedizin Berlin, den Leitlinien der Forschungsinstitute für Experimentelle Medizin und den offiziellen Behörden. Alle Studien betrafen Zebrafischembryonen < 6 Tagen nach der Befruchtung (dpf), wodurch sie vom Tierschutzgesetz ausgenommen sind. Zebrafische (Danio rerio) wurden in der Tierklinik der Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlin, Deutschland, nach Standardprotokollen aufgezogen und gehalten. Sie wurden bei 28 °C mit einem 14 h Licht- und 10 h Dunkelzyklus untergebracht. Für alle Experimente wurden Wildtyp-Fische der Stämme AB oder TüLF verwendet.

HINWEIS: Die Festlegung optimaler Behandlungsbedingungen für jedes gewünschte Medikament vor seiner ZefiX-Anwendung umfasst mehrere notwendige Schritte. Bestimmen Sie zunächst die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) jedes Medikaments unter Verwendung einer geeigneten Zelllinie innerhalb eines konventionellen 2D-Kultursystems. Basierend auf früheren Erfahrungen können die wirksamen Wirkstoffkonzentrationen für die ZefiX-Behandlung 5x - 50x höher sein als die unter typischen Zellkulturbedingungen verwendeten^21,24. Vor der Behandlung von transplantierten Embryonen ist es wichtig, die Toxizität der nicht transplantierten Wirtsembryonen anhand des festgelegten Konzentrationsbereichs zu bewerten. Nach der Bewertung der Toxizität sind in Zelllinien transplantierte Embryonen einer Vielzahl von Arzneimittelkonzentrationen auszusetzen, die etwa das 50-fache des zuvor in 2D-Kultur bestimmten IC50-Werts betragen. Wenn die transplantierten Zellen auf Dosierungen bis zum 100-fachen des IC50 nicht ansprechen, kann das Medikament für ZefiX als unwirksam angesehen werden. Um die Wirksamkeit möglicherweise zu verbessern, besteht eine Möglichkeit darin, Transplantatzellen kurz vor ihrer Transplantation in Embryonen mit dem Medikament vorzukonditionieren²⁵. In Tabelle 1 finden Sie alle hier verwendeten Lösungen.

1. Tag 1: Vorbereitung auf das Experiment

1. Vorbereitung des E3-Mediums: Bereiten Sie 2 l autoklaviertes E3-Medium für die Embryonerhaltung vor.
2. Herstellung von Morpholino-Antisense-Oligonukleotiden (MO): Bereiten Sie eine 50-μM-Stammlösung mit beiden MOs in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen unter Verwendung von nukleasefreiem Wasser vor. Lagern Sie die Stammlösung bei Raumtemperatur (RT). Die MO werden für die Injektion vorbereitet, indem die Lösung auf einem Heizblock bei 65 °C 10 Minuten lang inkubiert wird.
   HINWEIS: Die MOs sind gegen spi1 und csf3r gerichtet, um die Differenzierung von Makrophagen- und Neutrophilenzellen zu hemmen, wie in den Referenzen 22,23,26 beschrieben.
3. Vorbereitung von Injektionsplatten
   1. Um 4-5 Platten herzustellen, lösen Sie 1% Agarose in E3-Medium auf, um eine 100-ml-Lösung zu erhalten. Gießen Sie für Transplantationsplatten ~20 ml der Lösung in jede 10 cm große Petrischalen und stellen Sie sicher, dass sie zur Hälfte gefüllt sind. Schwenken, um die Flüssigkeit gleichmäßig zu verteilen.
   2. Für Morpholino-Injektionsplatten stellen Sie die Spritzgussform in zwei Petrischalen auf die flüssige Agarose, wobei Sie darauf achten, dass sich keine Blasen bilden. Decken Sie die Schalen ab, indem Sie die Deckel kippen, und lassen Sie sie auf RT, bis die Agarose fest geworden ist. Sobald sie erstarrt sind, entfernen Sie die Form und lagern Sie die Platten kopfüber bei 4 °C in einer verschlossenen Plastiktüte.
4. Vorbereitung der Injektionsnadeln
   1. Für die Morpholino-Injektion: Erzeugen Sie mit einem Nadelzieher Nadeln aus 10 cm Kapillaren und brechen Sie die Spitzen ab, um einen geschätzten Durchmesser von 10 μm zu erreichen (wie in²⁷ beschrieben).
   2. Für die Zelltransplantation: Verwenden Sie handelsübliche vorgezogene stumpfe Injektionsnadeln mit einem Außendurchmesser von 20 μm.
5. Transplantatzellkultur: Geteilte Zellen (z. B. Nalm6) mit dem Ziel einer Zieldichte von 70 %-80 % an Tag 4 in einem T175-Zellkulturkolben mit RPMI-Medium, ergänzt mit 10 % FCS und 1 % P/s (RPMI-vollständig). Teilen Sie die Zellen vor der Verwendung 3-4 Mal, um eine angemessene Proliferationsrate zu gewährleisten.
   HINWEIS: Für die Vorbereitung von frischem oder frischem/gefrorenem Patientenmaterial für die Transplantation finden Sie Anweisungen in Schritt 4.3. Am Tag der Transplantation werden dann die Zellen präpariert.
6. Zebrafischzucht: Wildtyp-Zebrafische nachmittags in Aufzuchtbecken aufsetzen und dabei Männchen und Weibchen getrennt halten.
   HINWEIS: Zebrafische wurden wie in Referenz²⁸ beschrieben aufgezogen und in Szene gesetzt. Zeitangaben (hpf oder dpf) bezeichnen Stunden oder Tage nach der Befruchtung.

2. Tag 2: Morpholino-Injektion

1. 500 ml autoklaviertes E3-Medium mit 1 % Penicillin/Streptomycin (E3/P/S) ergänzen und zwei 10 cm Petrischalen füllen. Die Injektionsplatte aus dem Kühlschrank nehmen, um sie bei RT vorzuwärmen.
2. Die Öffnung der Zuchtbecken ist gestaffelt, so dass die Befruchtung jeweils nur in einem Bruchteil der Tanks erfolgen kann (abhängig von der Injektionsgeschwindigkeit), um eine rechtzeitige Mikroinjektion von Morpholino-Lösung in Zebrafischembryonen im Einzelzellstadium^{zu gewährleisten 28,29}. Beginnen Sie damit, je nach Geschwindigkeit des Injektors ein oder zwei Tore zu öffnen, wenn die eine Charge Eier leicht injiziert ist, öffnen Sie ein weiteres Tor oder zwei Tore und so weiter.
3. Übertragen Sie befruchtete Eier in Chargen von 100 Stück mit so wenig Flüssigkeit wie möglich in die zuvor hergestellte Injektionsplatte. Richten Sie die Embryonen in den Rillen der Platte aus.
4. Injizieren Sie 1 nL einer 50-μM-Mischung aus beiden Morpholinos in die Zelle oder den Dottersack direkt unter der Zelle während des Ein-Zell-Stadiums²⁹. Injizieren Sie ausreichend Eizellen für nachfolgende Eingriffe (z. B. injizieren Sie für eine 96-Well-Platte bis zu 200 Eizellen, um vor der Transplantation genügend Sicherheit für einen möglichen Aussetzer zu haben).
5. Die injizierten Eier werden in Petrischalen mit E3/P/S umgefüllt. Die injizierten Eier werden bei 28 °C inkubiert. Nicht injizierte Eier werden als Kontrollfische für die Durchflusszytometrie-Analyse bei 5 dpf aufbewahrt. Das restliche E3/P/S-Medium bei 4 °C lagern.

3. Tag 3: Dechorionation

1. Dechorionation von Zebrafischembryonen: Embryonen, die älter als 24 hpf sind, werden mit zwei Präzisionszangen²⁹ manuell dechorioniert.
   1. Entfernen Sie tote Embryonen, die keinen Herzschlag oder Bewegung zeigen und undurchsichtig erscheinen, oder Embryonen mit unregelmäßigen Formen mit einer Pasteur-Pipette aus der Schale.
   2. Kneifen Sie das Chorion mit einer Präzisionszange zusammen, um es an Ort und Stelle zu halten. Kneifen Sie direkt neben der Spitze der Präzisionszange, halten Sie den Embryo mit der zweiten Pinzette an Ort und Stelle, und ziehen Sie das Chorion vorsichtig auseinander, um den Embryo freizugeben
      HINWEIS: Um Embryonen unter 24 hpf zu dechorionieren, sollten sie auf einer mit Agarose überzogenen Schale aufbewahrt werden, um zu verhindern, dass sie am Kunststoff kleben. Die manuelle Dechorionation wird bevorzugt, da sie schonender für die Embryonen ist. Ein alternatives enzymatisches Dechorionierungsverfahren wird an anderer Stelle^{beschrieben 30}.
2. Inkubieren Sie dechorionierte Embryonen über Nacht bei 28 °C.

4. Tag 4: Xenotransplantation und medikamentöse Behandlung

1. Präparation der Wirtsembryonen: Nehmen Sie die vorbereiteten Agaroseplatten und E3/P/S aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie RT erreichen. Screenen Sie die Embryonen mit einem Stereomikroskop bei 48 hpf auf das entsprechende Entwicklungsstadium. Es sollten nur ordnungsgemäß inszenierte und morphologisch typische Embryonen in den Arbeitsablauf einbezogen werden, wie an anderer Stelle^{beschrieben 29}. Zählen Sie alle gesunden Embryonen und planen Sie die weitere Behandlung. Halten Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro 10 cm Petrischale bei 28 °C, um ungleichmäßige Entwicklungsgeschwindigkeiten durch Sauerstoffmangel zu vermeiden.
   HINWEIS: Befolgen Sie Schritt 4.2. für Zelllinien. Für frisches/gefrorenes Material fahren Sie direkt mit Schritt 4.3 fort.
2. Aufbereitung von Zelllinien
   1. Um fluoreszenzmarkierte BCP-ALL-Zellen für die Durchflusszytometrie und Transplantation vorzubereiten, waschen Sie die Zellen (aus Schritt 1.5.) mit 1x PBS: zentrifugieren Sie 5 min lang bei 350 x g und resuspendieren Sie sie in 20 mL PBS.
   2. Zählen Sie die Zellen und übertragen Sie 3 x 10⁵ ungefärbte Zellen in ein FACS-Röhrchen für die Durchflusszytometrie-Analyse an Tag 0 (0 Tage nach der Injektion, dpi). Auf Eis lagern.
   3. Platte: 3 x 10⁵ Zellen in 3 ml RPMI-vollständig in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte und bei 37 °C für 3 dpi-Kontrolle halten.
   4. 1 x 10⁷ Zellen für die CTV-Markierung in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen geben. Zentrifugieren Sie bei 350 x g für 5 min bei RT, gießen Sie den Überstand aus (verwenden Sie eine Pipette für den Rest) und resuspendieren Sie das Pellet in 2,5 mL PBS (RT) mit 1 μl CTV-Stammlösung.
   5. 5 min im Dunkeln bei 37 °C inkubieren, die Reaktion mit 12,5 mL RPMI-complete stoppen und dann 10 min im Dunkeln bei 37 °C inkubieren.
   6. Bei 350 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und einmal mit 10 mL RPMI-complete waschen. Erneut zentrifugieren und in 10 mL RPMI-complete resuspendieren.
   7. Filtrieren Sie die Zellen mit einem 10 μm Filter, indem Sie bei 350 x g für 5 min zentrifugieren. Resuspendieren Sie das Pellet, zählen Sie die Zellen und geben Sie 3 x 10⁵ CTV-markierte Zellen in ein FACS-Röhrchen. Platte 3x 10^5 Zellen mit 3 mL RPMI-vollständig in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte und bei 37°C für 3 dpi Proliferationskontrolle halten. Lagern Sie die restlichen Zellen bis zur Transplantation in 1 ml PBS auf Eis.
3. Aufbereitung von frischem/gefrorenem Patientenmaterial
   1. Zwei 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit je 10 mL RPMI-complete bei 37 °C vorwärmen. Tauen Sie ein Fläschchen mit 5-10 x 10⁶ Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad auf.
   2. Sobald nur noch eine kleine Menge Eis übrig ist, geben Sie die Zellen in das Zentrifugenröhrchen mit dem vorgewärmten Medium. Bei 350 x g für 5 min bei RT zentrifugieren, den Überstand verwerfen und das Pellet in das zweite Röhrchen mit vorgewärmtem RPMI-complete resuspendieren.
   3. Zählen Sie lebensfähige Zellen mit Trypanblau. Aliquotieren Sie 1x 10^5 Zellen in ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie dieses Aliquot von Zellen in einem FACS-Röhrchen bei 350 x g für 5 min bei RT, verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 300 μl PBS.
   4. Lagern Sie das resuspendierte Aliquot auf Eis als unbehandelte Kontrolle für die Durchflusszytometrie-Analyse.
      HINWEIS: Wenn eine ausreichende Probengröße dies zulässt, ist an Tag 7 eine unbehandelte Kontrolle in Kultur für die Durchflusszytometrie-Messung durchzuführen.
   5. Geben Sie 1 μl der CTV-Stammlösung zu 2,5 mL PBS (RT) pro 1 x 10⁶ Zellen. Passen Sie das Volumen der CTV-Stammlösung an, wenn weniger Zellen verfügbar sind.
   6. Die Zellen mit CTV werden 5 min lang bei 37 °C im Dunkeln inkubiert, die Reaktion durch Zugabe von 12,5 mL vorgewärmtem (37 °C) RPMI-complete gestoppt und 10 min im Dunkeln bei 37 °C inkubiert.
   7. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 x g für 5 min bei RT und waschen Sie die Zellen einmal mit 10 mL RPMI-complete. Zentrifugieren Sie erneut bei 350 x g für 5 min bei RT und resuspendieren Sie die Zellen in 10 mL RPMI-complete.
   8. Die Zellsuspension wird mit einem 10 μm Filter in ein frisches 50 mL Zentrifugenröhrchen filtriert und 5 min lang bei 350 x g zentrifugiert.
   9. Entsorgen Sie den Überstand nicht. Resuspendieren Sie das Pellet und zählen Sie die Zellen. Übertragen Sie 3 x 10⁵ CTV-markierte Zellen in ein FACS-Röhrchen.
   10. Die restlichen Zellen werden bei 350 x g für 5 min bei RT zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die restlichen Zellen werden in 1 ml PBS resuspendiert und bis zur Verwendung bei der Transplantation auf Eis gelagert.
       HINWEIS: Wenn genügend CTV-positive Zellen übrig bleiben, können diese in 2D-Kultur parallel zu den Xenotransplantaten zum Vergleich der Proliferationsraten aufbewahrt werden.
4. Durchflusszytometrische Messung
   HINWEIS: Die Durchflusszytometrie bei 0 dpi sollte von einer zweiten Person durchgeführt werden, um die Zeit, die die Zellen vor der Transplantation auf dem Eis verbleiben, zu minimieren. Führen Sie vor der ersten durchflusszytometrischen Messung mit dem dafür vorgesehenen Färbepanel (CTV, CD19-Alexa488, APC-Annexin V und 7AAD) einen Kompensationstest gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
   1. Bereiten Sie zwei FACS-Röhrchen wie folgt vor: Röhrchen 1: Ungefärbte Kontrollzellen; Röhrchen 2: Zellen, die mit CTV, CD19, 7AAD und Annexin gefärbt wurden.
      HINWEIS: Färbung und Markierungen: CellTrace Violet (CTV) identifiziert markierte Transplantatzellen im Vergleich zu Wirtsfischzellen und beurteilt die Proliferationsrate nach 3 Tagen. Der CD19-Antikörper, ein Marker für die Zelloberfläche, dient als zusätzlicher Marker zur Identifizierung von humanen BCP-ALL-Transplantatzellen. Für andere Krebsarten können alternative Marker-Antikörper erforderlich sein. Annexin V markiert die Apoptose im Frühstadium für die Beurteilung der Zellviabilität. 7AAD markiert die Apoptose oder Nekrose im Spätstadium für die Beurteilung der Zellviabilität.
   2. Zentrifugenröhrchen (eines mit CTV-gefärbten Zellen und das andere mit ungefärbten Zellen) bei 350 x g für 5 min bei RT zentrifugieren und den Überstand aus Röhrchen 1 verwerfen. Das Pellet wird in 310 μl Annexin Binding Buffer (ABB) resuspendiert.
   3. Röhrchen 2: Führen Sie die Antikörper- und Viabilitätsfärbung wie unten beschrieben durch.
      HINWEIS: Dieses Färbeprotokoll ist für die CD19 B-Zell-Färbung optimiert. Für andere humane Antikörper, die zur Markierung verschiedener Zelltypen verwendet werden, muss das Protokoll möglicherweise angepasst werden.
      1. Geben Sie 98 μl ABB in Röhrchen 2 (mit CTV-markierten Zellen). Fügen Sie 2 μl CD19-Alexa488-Antikörper (1:50 Verdünnung) zu den hinzugefügten 98 μl ABB hinzu. Gut mischen.
      2. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei 4 °C inkubiert und 500 μl ABB hinzugefügt, um die Reaktion zu stoppen. Das Röhrchen bei 350 x g für 5 min bei 4 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand und wiederholen Sie den Waschschritt.
      3. Resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl ABB und fahren Sie mit der Färbung mit 7AAD und APC-Annexin V fort. Führen Sie die 7AAD- und APC-Annexin-V-Färbung und Durchflusszytometrie-Messung wie unten beschrieben durch.
      4. Geben Sie 5 μl 7AAD und 5 μl APC-Annexin V zu den resuspendierten Zellen. Zum Mischen vorsichtig vortexen. Inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang im Dunkeln bei RT. Fügen Sie 200 μl ABB hinzu, um ein Endvolumen von 310 μl zu erreichen.
      5. Führen Sie die Durchflusszytometrie-Analyse am Tag der Transplantation in der folgenden Reihenfolge durch, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden: Ungefärbte Kontrollzellen (Röhrchen 1), CTV-markierte Zellen, die mit Alexa488-CD19, APC-Annexin V und 7AAD gefärbt wurden (Röhrchen 2). Zeichnen Sie mindestens 10.000 Ereignisse pro Probe auf, um eine ausreichende Analyse zu gewährleisten.

5. Transplantation

1. Transplantationsplatte: Bereiten Sie zwei 10 cm große Petrischalen vor, die mit E3/P/S gefüllt sind, und stellen Sie sie für mindestens 30 Minuten bei 28 °C zum Vorwärmen in den Inkubator.
2. Zellvorbereitung: Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 x g für 5 min bei RT, entsorgen Sie den Überstand und entfernen Sie die restliche Flüssigkeit mit einer Mikropipette. Fügen Sie PBS hinzu, um ein Endvolumen von 20 μl zu erreichen. Halten Sie die konzentrierte Zellsuspension auf Eis.
   HINWEIS: Die Zellen sollten während des Transplantationsverfahrens nicht länger als 2 Stunden auf Eis verbleiben.
3. Vorbereitung der Transplantationsnadel und des Wirtsembryos
   1. Übertragen Sie 25-30 Embryonen in eine der vorgewärmten Petrischalen mit E3/P/S und verwenden Sie eine Pasteur-Glaspipette zur Kontrolle. Laden Sie 4 μl der Zellsuspension mit einer Mikroladerspitze in die Transplantationsnadel.
      HINWEIS: Die Beladung sollte innerhalb von 1-2 Minuten reibungslos vonstattengehen. Wenn dies nicht der Fall ist, fügen Sie der Zellsuspension vorsichtig mehr PBS hinzu.
   2. Kalibrieren Sie den Einspritzdruck und die Impulslänge, indem Sie den Mikroinjektor einstellen. Anpassen, bis eine Injektion ca. 1.000 ALL-Zellen oder 2 nL Zellsuspension ausstößt (für 1x 10⁷ Zellen in 20 μl). Um 1.000 Zellen zu schätzen, stoßen Sie ein Volumen der Suspension auf eine mit Medium bedeckte Agaroseoberfläche aus. Zählen Sie 100 Zellen in einem kleinen Bereich, extrapolieren Sie ihre Verteilung auf die gesamte Zellpopulation und schätzen Sie die Gesamtanzahl.
   3. Bereiten Sie 50 ml E3 vor, das Tricain enthält (Endkonzentration: 80 mg/l). Übertragen Sie die Wirtsembryonen in die Tricainlösung und inkubieren Sie sie mindestens 2 Minuten lang, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten. Der Embryo wird ordnungsgemäß betäubt, wenn keine motorische Reaktion zu beobachten ist
      HINWEIS: Eine Mikroladerspitze oder eine Pinzette können verwendet werden, um sich dem Embryo vorsichtig zu nähern und/oder ihn zu berühren.
   4. Übertragen Sie 15-20 dechorionierte Embryonen mit so wenig Flüssigkeit wie möglich in eine mit Agarose beschichtete Injektionsschale (siehe frühere Zubereitungsanleitung), um ein Verrutschen der Embryonen zu verhindern.
   5. Ordnen Sie die Embryonen wie in Abbildung 2A dargestellt an. Injizieren Sie ca. 1.000 CTV-positive BCP-ALL-Zellen in die Perikardhöhle. Führen Sie die Nadel in einem Winkel von 45° aus dorso-kaudaler Richtung ein, wie in Abbildung 2B gezeigt, um die Zellen zu injizieren.
      HINWEIS: Verwenden Sie handelsübliche vorgezogene Nadeln mit stumpfen Enden und einem Öffnungsdurchmesser von 20 μm, die speziell für kleine Leukämiezellen entwickelt wurden (siehe Materialliste). Wenn die Nadel verstopft ist, schneiden Sie sie nach Bedarf ab, kalibrieren Sie jedoch das Injektionsvolumen und die Zellzahl danach neu.
   6. Sobald alle 15-20 Embryonen injiziert sind, geben Sie sie in die vorgewärmte Petrischale, die mit E3/P/S gefüllt ist, und halten Sie sie bei 28 °C.
   7. Wiederholen Sie die Schritte, bis etwa 100 - 150 Embryonen für einen medikamentösen Behandlungstest transplantiert wurden, der drei Arzneimittelkonzentrationen und eine Kontrolle umfassen sollte.
   8. Inkubieren Sie sowohl die transplantierten Embryonen als auch die nicht transplantierten Kontrollen 1-3 Stunden lang bei 28 °C, bevor Sie mit der medikamentösen Behandlung beginnen.
4. In-vivo-Behandlung mit Medikamenten (96-Well-Platte)
   1. Mit Hilfe der Fluoreszenz-Stereomikroskopie werden die Embryonen gescreent, um eine erfolgreiche Transplantation zu bestätigen (Abbildung 2C). Stellen Sie sicher, dass das Eigelb intakt ist, da das Dottermilieu für Transplantatzellen toxisch sein könnte²¹. Embryonen mit Zellen im Eigelb entsorgen.
   2. Bereiten Sie 2,5 ml einer 2x konzentrierten Lösung für jede Arzneimittelbedingung vor, die in E3/P/S mit 0,5 % DMSO getestet werden soll. Bereiten Sie zusätzlich eine 5-ml-Fahrzeugsteuerungslösung mit 0,5 % DMSO in E3/P/S vor.
   3. Geben Sie 100 μl E3/P/S + 0,5 % DMSO in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte. Dieser Schritt verhindert den unbeabsichtigten Transfer minimaler Wirkstoffmengen zwischen den Wells.
   4. Übertragen Sie vorsichtig einen transplantierten Embryo in jede Vertiefung. Verwenden Sie eine Pasteur-Pipette aus Glas, um jeden Embryo in so wenig E3-Medium wie möglich aufzunehmen.
   5. Lassen Sie den Embryo durch leichtes Kippen der Pipette auf den Boden der Pipettenspitze sinken und lassen Sie ihn mit Kapillarkräften in die Vertiefung gleiten. Vermeiden Sie es, das Medium während der Übertragung in der Vertiefung zu berühren.
   6. Geben Sie Arzneimittellösungen in die Platte: Füllen Sie 24 Vertiefungen (2 Reihen) der 96-Well-Platte mit 100 μl entweder der Fahrzeugsteuerungslösung oder einer der drei 2x konzentrierten Arzneimittellösungen.
      HINWEIS: Die wirksamen Arzneimittelkonzentrationen müssen in früheren Experimenten bestimmt werden, die für jedes zu testende Arzneimittel spezifisch sind.
   7. Halten Sie die Embryonen 72 Stunden lang bei 35 °C, einschließlich der nicht transplantierten Embryonen, die am Tag 7 als Kontrollen für die Durchflusszytometrie dienen.

6. Tag 7

1. Dissoziation von Embryo und Transplantat
   1. Screening der 96-Well-Platte mittels Stereomikroskopie, um gesunde Zebrafischembryonen zu identifizieren und auszuwählen. Poolen Sie nach dem Zufallsprinzip 10 gesunde Wirtsembryonen aus jeder Erkrankung in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen (idealerweise ergeben sich 2 Röhrchen pro Erkrankung).
   2. Entfernen Sie so viel Flüssigkeit wie möglich aus jedem embryonalen Röhrchen und opfern Sie die Embryonen durch hypothermischen Schock, indem Sie die Röhrchen 1 h lang auf Eis inkubieren.
   3. Geben Sie 500 μl calcium- und magnesiumfreie Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) in jedes Röhrchen. Dissoziieren Sie die Embryonen und Transplantatzellen mechanisch durch Verreibung mit einer 200-μl-Mikropipettenspitze, wobei Sie ca. 15x auf und ab pipettieren müssen.
   4. Die Gewebefragmente werden durch Zentrifugation bei 350 x g für 5 min bei RT pelletiert. In der Zwischenzeit sind die FACS-Röhrchen mit einer 35 μm feinmaschigen Filtersiebkappe vorzubereiten, die 2 ml PBS pro Bedingung (insgesamt 4 Röhrchen) enthält.
   5. Jedes Pellet wird in 500 μl Enzymmischung (0,01 % Papain, 0,1 % Dispase II, 0,01 % Desoxyribonuklease I und 12,4 mM MgSO₄ in calcium- und magnesiumfreiem HBSS) für die enzymatische Dissoziation resuspendiert. 15 Minuten bei RT inkubieren.
   6. Pipettieren Sie die Mischung während der Inkubation alle 5 Minuten wiederholt auf und ab, wobei Sie für jedes einzelne Röhrchen dieselbe Pipettenspitze verwenden, um Gewebeverlust zu vermeiden.
2. Durchflusszytometrische Messung
   1. Die dissoziierten Zellen in den 35 μm feinmaschigen Filtersiebdeckel der FACS-Röhrchen überführen und bei 350 x g für 5 min zentrifugieren.
   2. Bereiten Sie während des Zentrifugierens einen Mastermix für die CD19-B-Zell-Oberflächenfärbung vor. Kombinieren Sie 98 μl ABB mit 2 μl Alexa Fluor 488 Anti-Human-CD19-Antikörper für jede Bedingung.
   3. Verwerfen Sie den Überstand aus dem dissoziierten Zellpellet und resuspendieren Sie das Pellet in 100 μl des CD19-Färbe-Mastermixes.
   4. Führen Sie das CD19-, 7AAD- und APC-Annexin-V-Färbeprotokoll für alle ZefiX-Proben durch, einschließlich 3 x 10⁵ CTV-positiven Zellen aus parallelen Zellkulturen, falls verfügbar.
   5. Führen Sie die Durchflusszytometrie-Analyse gemäß der Reihenfolge durch und zeichnen Sie die in Tabelle 2 beschriebene Anzahl von Ereignissen auf. Führen Sie alle Proben, die Wirts- und Transplantatzellen enthalten, so vollständig wie möglich durch, um die Gesamtzahl der Transplantatzellen zu bewerten.
3. Analyse der Ergebnisse mit kommerzieller Software.
   1. Gating-Strategie für Zellkulturprobe: Öffnen Sie die Software und laden Sie die FCS-Dateien in den Arbeitsbereich. Erstellen Sie ein Punktdiagramm mit CD19 und CTV, um sicherzustellen, dass sich das Signal überlappt, und um das Vorhandensein der Krebszellen zu bestätigen. Erstellen Sie als Nächstes ein Punktdiagramm mit FSC-A (x-Achse) und SSC-A (y-Achse), um intakte Zellen (Q2) von Trümmern (Q4; Abbildung 3A').
   2. Verwenden Sie die Population Intakte Zellen, um ein neues Diagramm mit SSC-H (x-Achse) und SSC-A (y-Achse) zu erstellen, um einzelne Zellen zu identifizieren (Abbildung 3A'').
   3. Erstellen Sie ein weiteres Punktdiagramm mit Annexin V (x-Achse) und 7AAD (y-Achse) unter Verwendung der Einzelzellenpopulation (Abbildung 3A'''). Unterscheidung der Zellen in vier Populationen: Lebensfähige Zellen: Annexin V negativ, 7AAD negativ (Q4); Frühe apoptotische Zellen: Annexin V positiv, 7AAD negativ (Q3); Spätapoptotische/nekrotische Zellen: Annexin V positiv, 7AAD positiv (Q2); Nekrotische Zellen: Annexin V negativ, 7AAD positiv (Q1).
   4. Wiederholen Sie diese Schritte für 3-dpi-Proben (Abbildung 3B).
   5. Gating-Strategie für Transplantat- und Wirtsembryozellen
      1. Trennen Sie menschliche Transplantatzellen von Wirtszellen mithilfe eines Punktdiagramms mit CTV (x-Achse) und CD19 (y-Achse). Identifizieren und isolieren Sie doppelt positive CTV/CD19-Transplantatzellen (Abbildung 3C).
      2. Wenden Sie die gleiche Gating-Strategie, die für 3-dpi-Kulturzellen beschrieben wurde (Abbildung 3B' - B'''), auf die Transplantatzellpopulation an. Kopieren Sie die Gating-Strategie, um die Konsistenz zu gewährleisten.
      3. Führen Sie alle Annexin V- und 7AAD-negativen Zellpopulationen in einem Histogramm mit CTV-Werten auf der x-Achse zusammen (Abbildung 3D). Berechnen Sie das geometrische Mittel für alle fünf Proben, um die Proliferationsraten zu bestimmen.
4. Berechnungen zur Bewertung des Ansprechens auf die Behandlung
   1. Um die Anzahl der Zellteilungen nach 3 Tagen zu bestimmen, verwenden Sie die Formel:
      n = log₂ (I₀/I)
      Dabei ist I₀ = Anfängliche CTV-Fluoreszenzintensität (geometrisches Mittel, 0 dpi), I = CTV-Fluoreszenzintensität nach 72 h, n = Anzahl der Zellteilungen.
      Beispiel: Frisch gefrorene Patientenzellen in ZefiX log₂ (88317/14644) geteilt 2,6x = 2,6
      und 2,8x im 2D-Kulturprotokoll₂(88317/12992) = 2,8
   2. Um die Gesamtzahl der Transplantatzellen pro Fisch nach 3 Tagen zu bestimmen, dividieren Sie die Gesamtzahl der Krebszellen (einschließlich apoptotischer Zellen, aber ohne Trümmer) durch die Anzahl der in der Probe gesammelten Fische (typischerweise n = 10).
   3. Um die Lebensfähigkeit von CTV-positiven Transplantatzellen nach 3 Tagen zu bestimmen, verwenden Sie die Formel:
      V = (C/100) x A
      Dabei gilt: V = Lebensfähigkeit, C = Anteil intakter Einzelzellen ohne Ablagerungen (in Prozent), A = Anteil von Annexin V- und 7AAD-negativen Zellen (in Prozent).

Ergebnisse

Für eine detaillierte wissenschaftliche Bewertung des ZefiX-Protokolls, einschließlich der Xenotransplantat- und medikamentösen Behandlung von frisch gefrorenen, primären BCP-ALL-Zellproben, verweisen wir auf das zuvor veröffentlichte Manuskript²¹. Die Zulassung für die Verwendung von Patientenproben in der Forschung für die präklinische Arzneimittelprüfung erfolgte im Rahmen von Zusatzstudien zur ALL-REZ BFM 2002 Studie (NCT00114348) und zum ALL-REZ BFM...

Diskussion

Zebrafischembryonen sind aufgrund ihrer hohen Durchsatzkapazität und Kosteneffizienz zu einem immer beliebteren Xenotransplantat-Modell für das Wirkstoffscreening und die Krebsforschung geworden. Diese Xenotransplantate sind eine vielversprechende Säule der translationalen Medizin und unterstützen die präklinische Forschung und Entscheidungsfindung ^9,21. Zebrafisch-Xenotransplantatmodelle für die Expansion und Behandlung me...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Petri dish  (10 cm)	Greiner	P7237
7-AAD viability staining solution	Invitrogen	00-6993-50
Agarose (LE, analytic grade)	Biozym	840004
Air pressure injector	Narishige	IM400	with external gas supply
Alexa Fluor 488 anti-human CD19 antibody	Biolegend	302219
Annexin binding buffer	Biolegend	422201	Or see solutions for preparation
APC annexin V	Biolegend	640941
Capillaries (10 cm, OD 1.0 mm, with filaments)	WPIINC	TW100F-4	1.0 OD; 0.75 ID
Cell culture flask (T-175)	Sarstedt	83,39,12,002
CellTrace Violet	Invitrogen	C34557
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Roth	A994.1
Dispase II	Sigma Aldrich	D4693-1g
DNase I	AppliChem GmbH	A3778
Eppendorf tubes (1.5 ml)	Eppendorf	30120086
FACS tube (Polystyrene round botton Tube with Cell strainer Cap, 5 ml)	Falcon	352235
Falcon tubes (50 ml)	Falcon	352070
Fetal calf serum (FCS)	Sigma Aldrich	C8056
Fine mesh filter (10 µm)	PluriStrainer	435001050
Fine mesh filter (20 µm)	PluriStrainer	431002040
Flow cytometer	Becton Dickinson	BD LSRFortessa X-20
Fluorescent stereomicroscope	Leica
Fluorescent stereomicroscope with camera	Leica	M165 FC	Camera: DFC7000 T
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, Calcium and Magnesium free )	Sigma Aldrich	88284
Injection mold (Zebrafish MI/Transplant KIT)	World Precision Instruments	Z-MOLDS
Injection needles (without filament)	Biomedical instruments	VZIPbl-20-10-55	Zebrafish injection pipette, blunt, OD: 20μm ± 1, TL:~10mm, PL: 55mm, Glass: BM100T-10P
Macro-centrifuge	Eppendorf
Micro-centrifuge
Morpholino (csf3r)	Gene Tools LLC	csf3r (GAAGCACAAGCGA GACGGATGCCA)
Morpholino (spi1)	Gene Tools LLC	spi1(GATATACTGATAC TCCATTGGTGGT)
Papain	Sigma Aldrich	P3125
Penicillin-Streptomycin (Penstrep; 10.000 U/ml)	Gibco	15140122
Plates (4-well)	Greiner Bio one	657160
Plates (96-well)	Greiner Bio one	657180
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium	Gibco	21875-034
Tricaine  (MS-222)	Sigma Aldrich	E10521-50G	Ethy-3 aminobenzoate methanesulfenate