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Resumen

Este protocolo proporciona instrucciones paso a paso para generar y solucionar problemas de xenoinjertos de leucemia linfoblástica aguda (LLA) humana a partir de líneas celulares y material fresco del paciente en embriones de pez cebra inmunosuprimidos transitoriamente, junto con pautas para la evaluación de la respuesta a los medicamentos mediante citometría de flujo. La tubería experimental también se puede adaptar para tumores sólidos.

Resumen

El xenotrasplante de pez cebra es una técnica fundamental para investigar la patogénesis del cáncer humano y predecir las respuestas individuales a los fármacos. Este documento presenta un protocolo simplificado (ZefiX) para expandir muestras de pacientes de leucemia linfoblástica aguda precursora de células B primarias (BCP-ALL) o líneas celulares inmortalizadas en embriones de pez cebra inmunosuprimidos transitoriamente, utilizando citometría de flujo para el análisis de alta resolución de células individuales de las respuestas al tratamiento. En comparación con los injertos de tumores sólidos, las células de leucemia se benefician significativamente de la supresión de los factores diferenciadores de macrófagos y neutrófilos basada en oligonucleótidos antisentido morfolino durante el ensayo. El análisis por citometría de flujo de células de injerto disociadas permite una evaluación precisa del recuento de células, la tasa de proliferación y la vitalidad después del tratamiento por célula. Este enfoque se ha validado utilizando terapias dirigidas como venetoclax y dasatinib, con resultados de tratamiento comparados con los registros clínicos de muestras de pacientes relacionadas y controles de cultivo 2D tradicionales. En particular, el protocolo se completa en un plazo de 7 días, alineándose con los plazos de toma de decisiones clínicas. La metodología es adaptable para probar fármacos seleccionados en varios tipos de cáncer, incluidos los tumores sólidos, lo que permite estrategias terapéuticas personalizadas. Sin embargo, se deben considerar las limitaciones en el número de fármacos que se pueden evaluar, probablemente debido a las restricciones farmacocinéticas en los embriones de pez cebra.

Introducción

El xenotrasplante de pez cebra se ha convertido en un modelo in vivo crucial para comprender la patogénesis del cáncer y predecir las respuestas a los fármacos 1,2,3,4,5. Los modelos animales siguen siendo fundamentales para las pruebas preclínicas de fármacos, y el modelo de pez cebra ofrece ventajas significativas sobre otros sistemas in vivo, como el alto rendimiento y la rentabilidad 6,7,8.  Este modelo también podría ayudar a las predicciones personalizadas de la respuesta al tratamiento, incluidas las terapias moleculares dirigidas y la terapia con células CAR-T 9,10,11,12.

La BCP-ALL puede beneficiarse especialmente del xenoinjerto de pez cebra, ya que la expansión de las células primarias de pacientes en cultivo sigue siendo un reto13. Existe una necesidad innegable de nuevos enfoques de tratamiento para la LLA. A pesar de una tasa de remisión alta de 80-85% en niños con LLA-BCP, las tasas de supervivencia a largo plazo para los pacientes con enfermedad recidivante o resistente al tratamiento oscilan solo entre aproximadamente 30%-60%14,15,16. En estos casos, las pruebas de fármacos que utilizan la cartera propuesta podrían integrarse en el entorno clínico para identificar la terapia óptima específica para el paciente14,15. Este enfoque personalizado puede ser crucial cuando se trata de múltiples resistencias a los medicamentos, reduciendo significativamente la carga del tratamiento para los pacientes al evitar medicamentos ineficaces o subóptimos con efectos secundarios graves.

Varias características hacen que el xenoinjerto de embriones de pez cebra sea un modelo adecuado. Las similitudes genéticas entre los seres humanos y el pez cebra (70% de homología genética y 84% de genes compartidos relacionados con enfermedades) respaldan los estudios de interacción gen-fármaco17. Por lo tanto, el uso de un embrión huésped transgénico puede revelar predisposiciones genéticas que afectan la susceptibilidad a los medicamentos18. Alternativamente, se pueden trasplantar células con modificaciones genéticas específicas para evaluar si la sensibilidad o resistencia al fármaco se alinea con los hallazgos in vitro . Los xenoinjertos de embriones de pez cebra también proporcionan información sobre los posibles efectos sistémicos de los fármacos. A pesar de que el desarrollo de los órganos en los embriones de 2-3 días de edad no está completamente maduro, los órganos están correctamente localizados y comparten parcialmente la composición celular con sus contrapartes adultas19.

Otras ventajas de este modelo incluyen que solo se necesitan unas pocas células cancerosas para el injerto, el mantenimiento de los embriones huéspedes es simple, ya que no se requiere alimentación dentro de los primeros 5 días de vida, y el éxito de la inyección se puede evaluar rápidamente debido a la transparencia y el tamaño de los embriones. Una característica única es que solo la inmunidad innata está activa en esta etapa de desarrollo, lo que facilita un injerto eficiente20. En el protocolo ZefiX descrito aquí (ver resumen en la Figura 1), la inmunodeficiencia se potencia aún más al suprimir el sistema inmune innato durante los primeros 4 días de vida utilizando oligonucleótidos estables antisentido Morpholino dirigidos a spi1 y csf3r, que bloquean la diferenciación de macrófagos y neutrófilos 21,22,23.

Este protocolo también difiere de los protocolos anteriores de xenotrasplante de pez cebra, que se desarrollaron principalmente para injertos de tumores sólidos y, por lo general, utilizan métodos de evaluación de la respuesta a medicamentos basados en imágenes de montaje completo. ZefiX está optimizado para células cancerosas líquidas, como las células BCP-ALL, y se ha utilizado con éxito para expandir material de paciente fresco o congelado21. ZefiX también se puede adaptar para las células cancerosas adherentes mediante la selección de enzimas apropiadas para la disociación de tejidos.

Otra ventaja importante es el análisis posterior mediante citometría de flujo, que ofrece varios beneficios: (i) un gran número de células de injerto se puede procesar rápidamente, lo que permite un análisis estadístico sólido a nivel de una sola célula, (ii) la tasa de proliferación y la viabilidad se pueden evaluar simultáneamente en células individuales, y (iii) los citómetros de flujo están comúnmente disponibles en entornos de investigación clínica, lo que permite la evaluación de la respuesta a los fármacos de las células de injerto a nivel de una sola célula en unas pocas horas. Para garantizar la reproducibilidad, este protocolo proporciona un canal estandarizado desde la preparación hasta el análisis de citometría de flujo, pasando por el trasplante, lo que permite la predicción de la respuesta al fármaco en las células de ALL en una semana.

Protocolo

Todos los experimentos con pez cebra cumplen con las directrices de los Institutos de Investigación de Medicina Experimental de la Charité-Universitätsmedizin de Berlín y con las autoridades oficiales. Todos los estudios involucraron embriones de pez cebra < 6 días después de la fertilización (dpf), eximiéndolos de la Ley de Protección de Animales. El pez cebra (Danio rerio) se crió y mantuvo en el animalario de Charité-Universitätsmedizin Berlin, Berlín, Alemania, de acuerdo con protocolos estándar. Se alojaron a 28 °C con un ciclo de luz de 14 h y 10 h de oscuridad. Para todos los experimentos se utilizaron peces de tipo salvaje de las cepas AB o TüLF.

NOTA: Establecer las condiciones óptimas de tratamiento para cada fármaco deseado antes de su aplicación con ZefiX incluye varios pasos necesarios. En primer lugar, determinar la concentración inhibitoria máxima media (IC50) de cada fármaco utilizando una línea celular adecuada dentro de un sistema de cultivo 2D convencional. Sobre la base de la experiencia previa, las concentraciones efectivas del fármaco para el tratamiento con ZefiX pueden ser de 5 a 50 veces mayores que las utilizadas en condiciones típicas de cultivo celular21,24. Antes de tratar los embriones injertados, es esencial evaluar la toxicidad dentro de los embriones huéspedes no trasplantados utilizando el rango de concentración establecido. Después de evaluar la toxicidad, exponga los embriones injertados en líneas celulares a una variedad de concentraciones de fármaco de alrededor de 50 veces el valor de IC50 determinado previamente en cultivo 2D. Si las células injertadas no muestran respuesta a dosis de hasta 100 veces el IC50, el fármaco puede considerarse ineficaz para ZefiX. Para mejorar potencialmente la eficacia, una opción es preacondicionar las células del injerto con el fármaco poco antes de su trasplante a los embriones25. Consulte la Tabla 1 para ver todas las soluciones utilizadas aquí.

1. Día 1: Preparación para el experimento

  1. Preparación del medio E3: Prepare 2 L de medio E3 esterilizado en autoclave para el mantenimiento del embrión.
  2. Preparación de oligonucleótidos (MO) antisentido morfolino: Prepare una solución madre de 50 μM que contenga ambos MO en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL utilizando agua libre de nucleasas. Almacene la solución madre a temperatura ambiente (RT). Prepare los MO para la inyección incubando la solución en un bloque calefactor a 65 °C durante 10 min.
    NOTA: Los MOs se dirigen contra spi1 y csf3r para inhibir la diferenciación de macrófagos y células de neutrófilos, como se describe en las referencias 22,23,26.
  3. Preparación de placas de inyección
    1. Para preparar 4-5 placas, disuelva el 1% de agarosa en medio E3 para crear una solución de 100 mL. Para las placas de trasplante, vierta ~ 20 ml de la solución en cada placa de Petri de 10 cm, asegurándose de que estén medio llenas. Revuelva para distribuir uniformemente el líquido.
    2. Para las placas de inyección de Morfolino, coloque el molde de inyección sobre la agarosa líquida en dos placas de Petri, asegurándose de que no se formen burbujas. Cubra los platos inclinando las tapas y déjelos en RT hasta que la agarosa se haya solidificado. Una vez solidificado, retire el molde y guarde las placas boca abajo a 4 °C en una bolsa de plástico sellada.
  4. Preparación de agujas de inyección
    1. Para inyecciones de Morfolino: Genere agujas a partir de capilares de 10 cm utilizando un extractor de agujas y puntas de ruptura para lograr un diámetro estimado de 10 μm (como se describe en27).
    2. Para el trasplante de células: Utilice agujas de inyección de extremo romo preextraídos disponibles en el mercado con un diámetro exterior de 20 μm.
  5. Cultivo de células de injerto: Células divididas (p. ej., Nalm6) con el objetivo de alcanzar una densidad objetivo del 70%-80% en el día 4 en un matraz de cultivo celular T175 con medio RPMI suplementado con 10% de FCS y 1% de P/S (RPMI-complete). Divida las células 3-4 veces antes de usarlas para garantizar una tasa de proliferación adecuada.
    NOTA: Para la preparación de material de paciente fresco o fresco/congelado para trasplante, las instrucciones se pueden encontrar en el paso 4.3. A continuación, las células se preparan el día del trasplante.
  6. Cría de peces cebra: Instale peces cebra de tipo salvaje en tanques de cría por la tarde, manteniendo a los machos y las hembras separados.
    NOTA: Los peces cebra fueron criados y escenificados como se describe en la referencia28. Las referencias de tiempo (hpf o dpf) denotan horas o días después de la fertilización.

2. Día 2: Inyección de morfolino

  1. Complemente 500 mL de medio E3 esterilizado en autoclave con penicilina/estreptomicina al 1% (E3/P/S) y llene dos placas de Petri de 10 cm. Saca la placa de inyección de la nevera para precalentarla a RT.
  2. Apertura escalonada de la puerta de los tanques de cría para que la fertilización solo pueda tener lugar en una fracción de tanques a la vez (dependiendo de la velocidad de inyección) para garantizar microinyecciones oportunas de solución de morfolino en embriones de pez cebra en la etapa de una sola célula28,29. Comience abriendo una o dos compuertas dependiendo de la velocidad del inyector, cuando un lote de huevos se inyecta fácilmente, abra otra puerta o dos compuertas y así sucesivamente.
  3. Transfiera los óvulos fertilizados en lotes de 100 con la menor cantidad de líquido posible a la placa de inyección previamente preparada. Alinea los embriones en las ranuras de la placa.
  4. Inyecte 1 nL de una mezcla de 50 μM de ambos morfolinos en la célula o en el saco vitelino justo debajo de la célula durante la etapa de una célula29. Inyecte suficientes óvulos para los procedimientos posteriores (p. ej., para una placa de 96 pocillos, inyecte hasta 200 óvulos para tener suficiente respaldo para un posible abandono antes del trasplante).
  5. Transfiera los huevos inyectados a placas de Petri que contengan E3/P/S. Incube los huevos inyectados a 28 °C. Retenga los huevos no inyectados como peces de control para el análisis de citometría de flujo a 5 dpf. Almacene el medio E3/P/S restante a 4 °C.

3. Día 3: Descorionación

  1. Decorionación de embriones de pez cebra: Decorionar manualmente embriones cuando tienen más de 24 hpf utilizando dos pinzas de precisión29.
    1. Retire de los platos los embriones muertos que no muestren latidos ni movimiento y que parezcan opacos o con formas irregulares de la vajilla con una pipeta Pasteur.
    2. Pellizque el corion con pinzas de precisión para mantenerlo en su lugar. Pellizque justo al lado de la punta de las pinzas de precisión, sosteniendo el embrión en su lugar con las segundas pinzas, y separe con cuidado el corion para liberar el embrión
      NOTA: Para descorionar embriones menores de 24 hpf, deben mantenerse en un plato recubierto de agarosa para evitar que se peguen al plástico. Es preferible la descorionación manual, ya que es más suave para los embriones. Un método alternativo de descoionación enzimática se describe en otro lugar30.
  2. Incubar los embriones descorionados a 28 °C durante la noche.

4. Día 4: Xenotrasplante y tratamiento farmacológico

  1. Preparación de los embriones huéspedes: Retire las placas de agarosa preparadas y el E3/P/S de la nevera y deje que alcancen RT. Examine los embriones para determinar la etapa de desarrollo adecuada a 48 hpf utilizando un microscopio estereoscópico. Incluya solo embriones debidamente estadificados y morfológicamente típicos en el flujo de trabajo, como se describe en otra parte29. Cuente todos los embriones sanos y planifique el tratamiento adicional. No mantener más de 100 embriones por placa de Petri de 10 cm a 28 °C para evitar velocidades de desarrollo desiguales causadas por la escasez de oxígeno.
    NOTA: Siga el paso 4.2. para líneas celulares. Para material fresco/congelado, proceda directamente al Paso 4.3.
  2. Preparación de líneas celulares
    1. Para preparar células BCP-ALL marcadas con fluorescencia para la citometría de flujo y el trasplante, lavar las células (desde el paso 1.5.) con 1x PBS: centrifugar a 350 x g durante 5 min, y resuspender en 20 mL de PBS.
    2. Cuente las células y transfiera 3 x 105 células sin teñir a un tubo FACS para el análisis de citometría de flujo del día 0 (0 días después de la inyección, ppp). Almacenar en hielo.
    3. Placa de 3 x 105 celdas en 3 mL de RPMI: completa en un pocillo de una placa de 6 pocillos y manténgala a 37 °C para un control de 3 ppp.
    4. Transfiera 1 x 107 celdas a un tubo de centrífuga de 15 mL para el etiquetado de CTV. Centrifugar a 350 x g durante 5 min en RT, verter el sobrenadante (usar una pipeta para el resto) y resuspender el pellet en 2,5 mL de PBS (RT) con 1 μL de solución madre de CTV.
    5. Incubar durante 5 min en la oscuridad a 37 °C, detener la reacción con 12,5 mL de RPMI-complete, luego incubar durante 10 min en la oscuridad a 37 °C.
    6. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a RT y lavar una vez con 10 mL de RPMI-complete. Vuelva a centrifugar y vuelva a suspender en 10 mL de RPMI-complete.
    7. Filtrar las células con un filtro de 10 μm centrifugando a 350 x g durante 5 min. Vuelva a suspender el pellet, cuente las células y transfiera 3 x 105 células marcadas con CTV a un tubo FACS. Placa 3x 10^5 celdas con 3 mL de RPMI-completo en un pocillo de una placa de 6 pocillos y manténgalo a 37°C para un control de proliferación de 3 dpi. Almacene las células restantes en 1 mL de PBS en hielo hasta el trasplante.
  3. Preparación de material de paciente fresco/congelado
    1. Precaliente dos tubos de centrífuga de 15 mL con 10 mL de RPMI-complete cada uno a 37 °C. Descongele un vial que contenga 5-10 x 106 células en un baño de agua a 37 °C.
    2. Una vez que solo quede una pequeña cantidad de hielo, transfiera las celdas al tubo de centrífuga con el medio precalentado. Centrifugar a 350 x g durante 5 min a RT, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en el segundo tubo de RPMI-complete precalentado.
    3. Cuente las células viables con azul de tripán. Alícuota 1x 10^5 células en un tubo de centrífuga de 1,5 mL y centrifugar esta alícuota de células en un tubo FACS a 350 x g durante 5 min a RT, desechar el sobrenadante y resuspender el pellet en 300 μL de PBS.
    4. Almacene la alícuota resuspendida en hielo como un control sin tratar para el análisis de citometría de flujo.
      NOTA: Si el tamaño de la muestra lo permite, mantenga un control sin tratar en cultivo para la medición de citometría de flujo el día 7.
    5. Añadir 1 μL de la solución madre de CTV a 2,5 mL de PBS (RT) por cada 1 x 106 células. Ajuste el volumen de la solución madre de CTV si hay menos celdas disponibles.
    6. Incubar las células con CTV durante 5 min a 37 °C en la oscuridad, detener la reacción añadiendo 12,5 mL de RPMI completo precalentado (37 °C) e incubar durante 10 min en la oscuridad a 37 °C.
    7. Centrifugar las células a 350 x g durante 5 min a RT y lavar las células una vez con 10 mL de RPMI-complete. Centrifugar de nuevo a 350 x g durante 5 min a RT y resuspender las células en 10 mL de RPMI-completo.
    8. Filtre la suspensión de la célula en un tubo de centrífuga nuevo de 50 ml con un filtro de 10 μm y centrifugue a 350 x g durante 5 min.
    9. No deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet y cuente las células. Transfiera 3 x 105 células marcadas con CTV a un tubo FACS.
    10. Centrifugar las células restantes a 350 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender las células restantes en 1 mL de PBS y almacene en hielo hasta su uso en el trasplante.
      NOTA: Si quedan suficientes células CTV positivas, se pueden mantener en cultivo 2D en paralelo a los xenoinjertos para la comparación de la tasa de proliferación.
  4. Medición por citometría de flujo
    NOTA: La citometría de flujo a 0 ppp debe ser realizada por una segunda persona para minimizar el tiempo que las células permanecen en hielo antes del trasplante. Antes de la primera medición por citometría de flujo utilizando el panel de tinción designado (CTV, CD19-Alexa488, APC-Annexin V y 7AAD), realice una prueba de compensación siguiendo las instrucciones del fabricante.
    1. Prepare dos tubos FACS de la siguiente manera: Tubo 1: Células de control sin teñir; Tubo 2: Células teñidas con CTV, CD19, 7AAD y anexina.
      NOTA: Tinción y etiquetas: CellTrace Violet (CTV) identifica las células de injerto marcadas frente a las células de peces huéspedes y evalúa la tasa de proliferación después de 3 días. El anticuerpo CD19, un marcador de la superficie celular, sirve como marcador adicional para identificar las células de injerto de LLA-BCP humana. Para otros tipos de cáncer, es posible que se requieran anticuerpos marcadores alternativos. La anexina V marca la apoptosis en etapa temprana para la evaluación de la viabilidad celular. 7AAD marca la apoptosis o necrosis en etapa tardía para la evaluación de la viabilidad celular.
    2. Centrifugue los tubos (uno que contenga células teñidas con CTV y el otro que no esté teñido) a 350 x g durante 5 min en RT y deseche el sobrenadante del tubo 1. Vuelva a suspender el gránulo en 310 μL de tampón de unión a anexina (ABB).
    3. Tubo 2: Realice la tinción de anticuerpos y viabilidad como se describe a continuación.
      NOTA: Este protocolo de tinción está optimizado para la tinción de células B CD19. En el caso de otros anticuerpos humanos utilizados para marcar diferentes tipos de células, es posible que sea necesario adaptar el protocolo.
      1. Añada 98 μL de ABB al tubo 2 (que contiene células marcadas con CTV). Añadir 2 μL de anticuerpo CD19-Alexa488 (dilución 1:50) a los 98 μL de ABB añadidos. Mezclar bien.
      2. Incubar la mezcla a 4 °C durante 30 min y añadir 500 μL de ABB para detener la reacción. Centrifugar el tubo a 350 x g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante y repita el paso de lavado.
      3. Vuelva a suspender el pellet celular en 100 μL de ABB y proceda a la tinción con 7AAD y APC-Anexina V. Realice la tinción de anexina V 7AAD y APC y la medición de citometría de flujo como se describe a continuación.
      4. Añada 5 μL de 7AAD y 5 μL de APC-anexina V a las células resuspendidas. Vórtice suavemente para mezclar. Incubar el tubo durante 15 minutos en la oscuridad a RT. Añadir 200 μL de ABB para alcanzar un volumen final de 310 μL.
      5. Realice el análisis de citometría de flujo el día del trasplante en el siguiente orden para evitar la contaminación cruzada: células de control sin teñir (tubo 1), células marcadas con CTV teñidas con Alexa488-CD19, APC-anexina V y 7AAD (tubo 2). Registre al menos 10.000 eventos por muestra para un análisis suficiente.

5. Trasplante

  1. Placa de trasplante: Prepare dos placas de Petri de 10 cm llenas de E3/P/S y colóquelas en la incubadora a 28 °C durante al menos 30 minutos para que se precalienten.
  2. Preparación de las células: Centrifugar las células a 350 x g durante 5 min en RT, desechar el sobrenadante y eliminar el líquido restante con una micropipeta. Agregue PBS para lograr un volumen final de 20 μL. Mantenga la suspensión celular concentrada en hielo.
    NOTA: Las células no deben permanecer en hielo durante más de 2 horas durante el procedimiento de trasplante.
  3. Aguja de trasplante y preparación del embrión huésped
    1. Transfiera 25-30 embriones a una de las placas de Petri precalentadas que contienen E3/P/S utilizando una pipeta Pasteur de vidrio para que sirva como control. Cargue 4 μL de la suspensión celular en la aguja de trasplante con una punta de microcargador.
      NOTA: La carga debería realizarse sin problemas en 1-2 minutos. Si este no es el caso, agregue con cuidado más PBS a la suspensión de celdas.
    2. Calibre la presión de inyección y la longitud del pulso ajustando el microinyector. Ajuste hasta que una inyección expulse aproximadamente 1.000 células ALL o 2 nL de suspensión celular (para 1x 107 células en 20 μL). Para estimar 1.000 células, expulse un volumen de la suspensión sobre una superficie de agarosa cubierta con medio. Cuente 100 células en un área pequeña, extrapola su distribución a la población total de células y estime el número total.
    3. Preparar 50 mL de E3 que contenga tricaína (concentración final: 80 mg/L). Transfiera los embriones del huésped a la solución de tricaína e incube durante al menos 2 minutos para garantizar una anestesia adecuada. El embrión está debidamente anestesiado cuando no se observa ninguna respuesta motora
      NOTA: Se puede utilizar una punta de microcargador o pinzas para acercarse y/o tocar cuidadosamente el embrión.
    4. Transfiera de 15 a 20 embriones descorionados a una placa de inyección recubierta de agarosa (consulte las instrucciones de preparación anteriores) utilizando la menor cantidad de líquido posible para evitar que los embriones se deslicen.
    5. Organice los embriones como se ilustra en la Figura 2A. Inyectar aproximadamente 1.000 células BCP-ALL positivas para CTV en la cavidad pericárdica. Introduzca la aguja en un ángulo de 45° con respecto a la dirección dorso-caudal, como se muestra en la Figura 2B para inyectar las células.
      NOTA: Utilice agujas pre-tiradas de punta roma disponibles en el mercado con un diámetro de apertura de 20 μm, diseñadas específicamente para células leucémicas pequeñas (consulte la lista de materiales). Si la aguja se bloquea, recórtela según sea necesario, pero vuelva a calibrar el volumen de inyección y el recuento de células después.
    6. Una vez inyectados los 15-20 embriones, transfiéralos a la placa de Petri precalentada llena de E3/P/S y manténgala a 28 °C.
    7. Repita los pasos hasta que se trasplanten aproximadamente 100 a 150 embriones para un ensayo de tratamiento con medicamentos, que debe incluir tres concentraciones de medicamento y un control.
    8. Incubar tanto los embriones trasplantados como los controles no trasplantados a 28 °C durante 1-3 h antes de iniciar el tratamiento farmacológico.
  4. Tratamiento farmacológico in vivo (placa de 96 pocillos)
    1. Mediante el uso de estereomicroscopía fluorescente, se examinan los embriones para confirmar el éxito del injerto (Figura 2C). Asegúrese de que la yema esté intacta, ya que el entorno de la yema podría ser tóxico para las células del injerto21. Deseche los embriones con células en la yema.
    2. Prepare 2,5 mL de una solución concentrada 2x para cada condición de medicamento que se va a probar en E3/P/S con DMSO al 0,5%. Además, prepare una solución de control de vehículos de 5 ml que contenga 0,5% de DMSO en E3/P/S.
    3. Añada 100 μL de E3/P/S + 0,5% de DMSO a cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Este paso evita la transferencia involuntaria de cantidades mínimas de fármaco entre pocillos.
    4. Transfiera cuidadosamente un embrión injertado a cada pocillo. Utilice una pipeta Pasteur de vidrio para recoger cada embrión en la menor cantidad posible de medio E3.
    5. Deje que el embrión se hunda hasta el fondo de la punta de la pipeta inclinando suavemente la pipeta y libérela en el pocillo utilizando fuerzas capilares. Evite tocar el medio en el pocillo durante la transferencia.
    6. Agregue soluciones de fármaco a la placa: Llene 24 pocillos (2 filas) de la placa de 96 pocillos con 100 μL de la solución de control del vehículo o de una de las tres soluciones de fármaco concentradas 2x.
      NOTA: Las concentraciones efectivas del fármaco deben determinarse en experimentos previos específicos para cada fármaco que se esté probando.
    7. Mantener los embriones a 35 °C durante 72 h, incluidos los embriones no trasplantados, que servirán como controles para el análisis de citometría de flujo el día 7.

6. Día 7

  1. Disociación embrión/injerto
    1. Examinar la placa de 96 pocillos mediante microscopía estereoscópica para identificar y seleccionar embriones sanos de pez cebra. Agrupe aleatoriamente 10 embriones huéspedes sanos de cada afección en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml (lo ideal es que haya 2 tubos por afección).
    2. Extraer la mayor cantidad de líquido posible de cada tubo que contenga embriones y sacrificar los embriones por choque hipotérmico incubando los tubos en hielo durante 1 h.
    3. Agregue 500 μL de solución salina balanceada de Hank's (HBSS) sin calcio ni magnesio a cada tubo. Disociar mecánicamente los embriones e injertar células mediante trituración con una punta de micropipeta de 200 μL, pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 15 veces.
    4. Granular los fragmentos de tejido por centrifugación a 350 x g durante 5 min a RT. Mientras tanto, prepare tubos FACS con una tapa de filtro de filtro de malla fina de 35 μm que contenga 2 mL de PBS por condición (4 tubos en total).
    5. Vuelva a suspender cada gránulo en 500 μL de mezcla de enzimas (0,01 % de papaína, 0,1 % de dispasa II, 0,01 % de desoxirribonucleasa I y 12,4 mM de MgSO4 en HBSS sin calcio y magnesio) para la disociación enzimática. Incubar en RT durante 15 min.
    6. Durante la incubación, pipetee la mezcla hacia arriba y hacia abajo cada 5 minutos repetidamente usando la misma punta de pipeta para cada tubo individual para evitar la pérdida de tejido.
  2. Medición por citometría de flujo
    1. Transfiera las células disociadas a la tapa del filtro de malla fina de 35 μm de los tubos FACS y centrifugue a 350 x g durante 5 minutos.
    2. Durante la centrifugación, prepare una mezcla maestra para la tinción de la superficie de las células B CD19. Combine 98 μL de ABB con 2 μL de Alexa Fluor 488 anticuerpo CD19 humano para cada afección.
    3. Deseche el sobrenadante del pellet de células disociadas y vuelva a suspender el pellet en 100 μL de la mezcla maestra de tinción CD19.
    4. Realice el protocolo de tinción de anexina V CD19, 7AAD y APC para todas las muestras de ZefiX, incluidas las células 3 x 105 5 CTV positivas de cultivo celular paralelo, si están disponibles.
    5. Realice el análisis de citometría de flujo siguiendo el orden y registre el número de eventos descritos en la Tabla 2. Examine todas las muestras que contengan células huésped y de injerto de la forma más completa posible para evaluar el número total de células de injerto.
  3. Análisis de resultados mediante software comercial.
    1. Estrategia de compuerta para muestras de cultivo celular: Abra el software y cargue los archivos FCS en el espacio de trabajo. Cree un diagrama de puntos con CD19 y CTV para asegurarse de que la señal se superponga y para confirmar la presencia de las células cancerosas. A continuación, cree un diagrama de puntos con FSC-A (eje x) y SSC-A (eje y) para distinguir las celdas intactas (Q2) de los residuos (Q4; Figura 3A').
    2. Utilice la población de células intactas para crear una nueva gráfica con SSC-H (eje x) y SSC-A (eje y) para identificar celdas individuales (Figura 3A'').
    3. Cree otro diagrama de puntos con anexina V (eje x) y 7AAD (eje y) utilizando la población de celdas individuales (Figura 3A'''). Distingue las células en cuatro poblaciones: Células viables: Anexina V negativa, 7AAD negativa (Q4); Células apoptóticas precoces: Anexina V positiva, 7AAD negativa (Q3); Células apoptóticas/necróticas tardías: anexina V positiva, 7AAD positiva (Q2); Células necróticas: Anexina V negativa, 7AAD positiva (Q1).
    4. Repita estos pasos para muestras de 3 ppp (Figura 3B).
    5. Estrategia de activación para células de injerto y embrión huésped
      1. Separe las células de injerto humano de las células huésped mediante un diagrama de puntos con CTV (eje x) y CD19 (eje y). Identificar y aislar las células de injerto doble positivo CTV/CD19 (Figura 3C).
      2. Aplique la misma estrategia de compuerta descrita para las células de cultivo de 3 ppp (Figura 3B' - B''') a la población de células de injerto. Copie la estrategia de compuerta para mantener la coherencia.
      3. Combine todas las poblaciones de células negativas para anexina V y 7AAD en un histograma con valores de CTV en el eje x (Figura 3D). Calcule la media geométrica de las cinco muestras para determinar las tasas de proliferación.
  4. Cálculos para la evaluación de la respuesta al tratamiento
    1. Para determinar el número de divisiones celulares después de 3 días, use la fórmula:
      n = logaritmo2 (I0/I)
      Donde, I0 = Intensidad inicial de fluorescencia de CTV (media geométrica, 0 ppp), I = Intensidad de fluorescencia de CTV a las 72 h, n = Número de divisiones celulares.
      Ejemplo: Células de paciente frescas congeladas divididas 2,6 veces en ZefiX log2(88317/14644) = 2,6
      y 2,8x en el registro de cultivo 2D2(88317/12992) = 2,8
    2. Para determinar el número total de células de injerto por pez después de 3 días, divida el número total de células cancerosas (incluidas las células apoptóticas, pero excluyendo los desechos) por el número de peces agrupados en la muestra (por lo general, n = 10).
    3. Para determinar la viabilidad de las células de injerto CTV positivas después de 3 días, use la fórmula:
      V = (C/100) x A
      Donde: V = Viabilidad, C = fracción de células individuales intactas sin residuos (como porcentaje), A = Fracción de células negativas para la anexina V y 7AAD (como porcentaje).

Resultados

Para una evaluación científica detallada del protocolo ZefiX, incluyendo el tratamiento con xenoinjertos y fármacos de muestras de células BCP-ALL primarias recién congeladas, consulte el manuscrito21 publicado anteriormente. La aprobación para el uso de muestras de pacientes en la investigación para pruebas preclínicas de medicamentos fue otorgada como parte de los estudios complementarios al ensayo ALL-REZ BFM 2002 (NCT00114348) y al registro y biobanco...

Discusión

Los embriones de pez cebra se han convertido en un modelo de xenoinjerto cada vez más popular para el cribado de fármacos y la investigación del cáncer debido a su alta capacidad de rendimiento y rentabilidad. Estos xenoinjertos son prometedores como un pilar crítico de la medicina traslacional, ya que ayudan a la investigación preclínica y a la toma de decisiones 9,21. Sin embargo, los modelos de xenoinjertos de pez cebra...

Divulgaciones

Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo ha contado con el apoyo de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dentro del Centro de Investigación Colaborativa CRC1588, proyecto número 493872418 y la Dr. Kleist Stiftung, Berlín, así como por la Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung (R03/2016), la Berliner Krebsgesellschaft (HEFF201633KK) y el Consorcio Alemán del Cáncer (DKTK, Joint Funding Call 2016). Agradecemos a Julia Köppke y Mareike Wolff por su lectura crítica del manuscrito.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Petri dish  (10 cm)GreinerP7237
7-AAD viability staining solution Invitrogen00-6993-50
Agarose (LE, analytic grade)Biozym 840004
Air pressure injectorNarishigeIM400 with external gas supply
Alexa Fluor 488 anti-human CD19 antibody Biolegend302219
Annexin binding bufferBiolegend422201Or see solutions for preparation
APC annexin V Biolegend640941
Capillaries (10 cm, OD 1.0 mm, with filaments)WPIINCTW100F-41.0 OD; 0.75 ID
Cell culture flask (T-175)Sarstedt83,39,12,002
CellTrace Violet InvitrogenC34557
Dimethyl sulphoxide (DMSO)RothA994.1
Dispase II Sigma AldrichD4693-1g
DNase IAppliChem GmbHA3778
Eppendorf tubes (1.5 ml)Eppendorf30120086
FACS tube (Polystyrene round botton Tube with Cell strainer Cap, 5 ml)Falcon352235
Falcon tubes (50 ml)Falcon352070
Fetal calf serum (FCS)Sigma AldrichC8056
Fine mesh filter (10 µm)PluriStrainer435001050
Fine mesh filter (20 µm)PluriStrainer431002040
Flow cytometer Becton DickinsonBD LSRFortessa X-20
Fluorescent stereomicroscopeLeica
Fluorescent stereomicroscope with cameraLeicaM165 FCCamera: DFC7000 T
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, Calcium and Magnesium free )Sigma Aldrich88284
Injection mold (Zebrafish MI/Transplant KIT)World Precision Instruments Z-MOLDS
Injection needles (without filament)Biomedical instrumentsVZIPbl-20-10-55Zebrafish injection pipette, blunt, OD: 20μm ± 1, TL:~10mm, PL: 55mm, Glass: BM100T-10P
Macro-centrifugeEppendorf
Micro-centrifuge
Morpholino (csf3r)Gene Tools LLCcsf3r (GAAGCACAAGCGA
GACGGATGCCA)
Morpholino (spi1)Gene Tools LLCspi1(GATATACTGATAC
TCCATTGGTGGT)
PapainSigma AldrichP3125
Penicillin-Streptomycin (Penstrep; 10.000 U/ml)Gibco15140122
Plates (4-well)Greiner Bio one 657160
Plates (96-well)Greiner Bio one 657180
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumGibco21875-034
Tricaine  (MS-222)Sigma AldrichE10521-50GEthy-3 aminobenzoate methanesulfenate

Referencias

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