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Résumé

Ce protocole fournit des instructions étape par étape pour la génération et le dépannage de xénogreffes de leucémie lymphoblastique aiguë (LAL) humaine à partir de lignées cellulaires et de matériel de patient frais dans des embryons de poisson-zèbre immunodéprimés transitoirement, ainsi que des directives pour l’évaluation de la réponse médicamenteuse à l’aide de la cytométrie en flux. Le pipeline expérimental peut également être adapté aux tumeurs solides.

Résumé

La xénotransplantation de poisson-zèbre est une technique essentielle pour étudier la pathogenèse du cancer humain et prédire les réponses individuelles aux médicaments. Ce document présente un protocole simplifié (ZefiX) pour l’expansion d’échantillons de patients atteints de leucémie aiguë lymphoblastique à précurseurs de cellules B primaires (BCP-ALL) ou de lignées cellulaires immortalisées dans des embryons de poisson-zèbre immunodéprimés transitoirement, en utilisant la cytométrie en flux pour l’analyse unicellulaire à haute résolution des réponses au traitement. Par rapport aux greffes de tumeurs solides, les cellules leucémiques bénéficient considérablement de la suppression des facteurs de différenciation des macrophages et des neutrophiles à base d’oligonucléotides antisens morpholino au cours du test. L’analyse par cytométrie en flux des cellules greffées dissociées permet une évaluation précise du nombre de cellules, du taux de prolifération et de la vitalité après le traitement sur une base par cellule. Cette approche a été validée à l’aide de traitements ciblés tels que le vénétoclax et le dasatinib, avec des résultats de traitement comparés aux dossiers cliniques d’échantillons de patients associés et aux contrôles de culture 2D traditionnels. Notamment, le protocole est terminé en 7 jours, ce qui correspond aux délais de prise de décision clinique. La méthodologie est adaptable pour tester des médicaments sélectionnés dans divers types de cancer, y compris les tumeurs solides, soutenant ainsi des stratégies thérapeutiques personnalisées. Cependant, il faut tenir compte des limites sur le nombre de médicaments pouvant être évalués, probablement en raison de contraintes pharmacocinétiques chez les embryons de poisson-zèbre.

Introduction

La xénotransplantation de poisson-zèbre est devenue un modèle in vivo crucial pour comprendre la pathogenèse du cancer et prédire les réponses aux médicaments 1,2,3,4,5. Les modèles animaux restent essentiels pour les tests précliniques de médicaments, et le modèle du poisson-zèbre offre des avantages significatifs par rapport aux autres systèmes in vivo, notamment un débit élevé et une rentabilité 6,7,8.  Ce modèle pourrait également aider à prédire la réponse au traitement personnalisée, y compris les thérapies moléculaires ciblées et la thérapie cellulaire CAR-T 9,10,11,12.

La LAL-BCP peut particulièrement bénéficier de la xénogreffe de poisson-zèbre, car l’expansion des cellules primaires des patients en culture reste difficile13. Il existe un besoin indéniable de nouvelles approches thérapeutiques dans la LAL. Malgré un taux de rémission élevé de 80 % à 85 % chez les enfants atteints de LAL à PCB, les taux de survie à long terme des patients atteints d’une maladie récidivante ou réfractaire ne varient qu’entre environ 30 % et 60 %14,15,16. Dans de tels cas, les tests de médicaments utilisant le pipeline proposé pourraient être intégrés dans le cadre clinique afin de déterminer le traitement optimal spécifique au patient14,15. Cette approche personnalisée peut être cruciale lorsqu’il s’agit de faire face à de multiples résistances aux médicaments, réduisant considérablement le fardeau du traitement pour les patients en évitant les médicaments inefficaces ou sous-optimaux aux effets secondaires graves.

Plusieurs caractéristiques font de la xénogreffe d’embryon de poisson-zèbre un modèle approprié. Les similitudes génétiques entre les humains et le poisson-zèbre - 70 % d’homologie génétique et 84 % de gènes liés à la maladie partagés - soutiennent les études d’interaction gène-médicament17. L’utilisation d’un embryon hôte transgénique peut ainsi révéler des prédispositions génétiques affectant la sensibilité aux médicaments18. Alternativement, des cellules avec des modifications génétiques spécifiques peuvent être transplantées pour évaluer si la sensibilité ou la résistance au médicament s’aligne sur les résultats in vitro . Les xénogreffes d’embryons de poisson-zèbre donnent également un aperçu des effets systémiques potentiels des médicaments. Bien que le développement des organes chez les embryons âgés de 2 à 3 jours ne soit pas complètement mature, les organes sont correctement localisés et partagent en partie la composition cellulaire avec leurs homologues adultes19.

Parmi les autres avantages de ce modèle, citons le fait que seules quelques cellules cancéreuses sont nécessaires pour la greffe, que le maintien des embryons hôtes est simple, car aucune alimentation n’est nécessaire dans les 5 premiers jours de vie, et que le succès de l’injection peut être rapidement évalué en raison de la transparence et de la taille des embryons. Une caractéristique unique est que seule l’immunité innée est active à ce stade de développement, ce qui facilite une greffe efficace20. Dans le protocole ZefiX décrit ici (voir résumé sur la figure 1), l’immunodéficience est encore renforcée par la suppression du système immunitaire inné pendant les 4 premiers jours de la vie à l’aide d’oligonucléotides antisens Morpholino stables ciblant spi1 et csf3r, qui bloquent la différenciation des macrophages et des neutrophiles 21,22,23.

Ce protocole diffère également des précédents protocoles de xénotransplantation de poisson-zèbre, qui ont été principalement développés pour les greffes de tumeurs solides et utilisent généralement des méthodes d’évaluation de la réponse aux médicaments basées sur l’imagerie globale. ZefiX est optimisé pour les cellules cancéreuses liquides, telles que les cellules BCP-ALL, et a été utilisé avec succès pour étendre du matériel patient frais ou fraîchement congelé21. ZefiX peut également être adapté aux cellules cancéreuses adhérentes en sélectionnant les enzymes appropriées pour la dissociation des tissus.

Un autre avantage majeur est l’analyse en aval par cytométrie en flux, qui offre plusieurs avantages : (i) un grand nombre de cellules greffées peuvent être traitées rapidement, ce qui permet une analyse statistique robuste au niveau de la cellule unique, (ii) le taux de prolifération et la viabilité peuvent être évalués simultanément dans des cellules individuelles, et (iii) les cytomètres en flux sont couramment disponibles dans les contextes de recherche clinique, permettant l’évaluation de la réponse médicamenteuse des cellules greffées à un seul niveau cellulaire en quelques heures. Pour garantir la reproductibilité, ce protocole fournit un pipeline standardisé de la préparation à l’analyse par cytométrie en flux, en passant par la transplantation, permettant de prédire la réponse aux médicaments dans les cellules LAL en une semaine.

Protocole

Toutes les expériences sur le poisson-zèbre sont conformes aux directives de la Charité-Universitätsmedizin Berlin, aux instituts de recherche en médecine expérimentale et aux autorités officielles. Toutes les études ont porté sur des embryons de poisson-zèbre < 6 jours après la fécondation (dpf), ce qui les exempte de la loi sur la protection des animaux. Les poissons-zèbres (Danio rerio) ont été élevés et maintenus dans l’animalerie de la Charité-Universitätsmedizin Berlin, à Berlin, en Allemagne, selon des protocoles standard. Ils ont été logés à 28 °C avec un cycle de 14 h de lumière et 10 h d’obscurité. Des poissons sauvages de souches AB ou TüLF ont été utilisés pour toutes les expériences.

REMARQUE : L’établissement de conditions de traitement optimales pour chaque médicament souhaité avant son application de ZefiX comprend plusieurs étapes nécessaires. Tout d’abord, déterminez la concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) de chaque médicament à l’aide d’une lignée cellulaire appropriée dans un système de culture 2D conventionnel. Sur la base de l’expérience antérieure, les concentrations efficaces de médicament pour le traitement ZefiX peuvent être 5 à 50 fois supérieures à celles utilisées dans des conditions de culture cellulaire typiques21,24. Avant de traiter les embryons greffés, il est essentiel d’évaluer la toxicité dans les embryons hôtes non transplantés en utilisant la plage de concentration établie. Après avoir évalué la toxicité, exposez les embryons greffés dans des lignées cellulaires à diverses concentrations de médicament environ 50 fois la valeur IC50 précédemment déterminée en culture 2D. Si les cellules greffées ne montrent aucune réponse à des doses allant jusqu’à 100 fois l’IC50, le médicament peut être considéré comme inefficace pour ZefiX. Pour potentiellement améliorer l’efficacité, une option consiste à préconditionner les cellules greffées avec le médicament peu de temps avant leur transplantation dans des embryons25. Voir le tableau 1 pour toutes les solutions utilisées ici.

1. Jour 1 : Préparation de l’expérience

  1. Préparation du milieu E3 : Préparez 2 L de milieu E3 autoclavé à utiliser pour l’entretien des embryons.
  2. Préparation des oligonucléotides antisens (MO) morpholino : Préparez une solution mère de 50 μM contenant les deux MO dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL en utilisant de l’eau sans nucléases. Conservez la solution mère à température ambiante (RT). Préparez les MO pour l’injection en incubant la solution sur un bloc chauffant à 65 °C pendant 10 min.
    REMARQUE : Les MO sont dirigés contre spi1 et csf3r pour inhiber la différenciation des macrophages et des cellules neutrophiles, comme décrit dans les références 22,23,26.
  3. Préparation des plaques d’injection
    1. Pour préparer 4 à 5 plaques, dissoudre 1 % d’agarose dans un milieu E3 pour créer une solution de 100 ml. Pour les plaques de transplantation, versez ~20 ml de la solution dans chaque boîte de Pétri de 10 cm, en vous assurant qu’elles sont à moitié remplies. Agitez pour répartir uniformément le liquide.
    2. Pour les plaques d’injection Morpholino, placez le moule d’injection sur l’agarose liquide dans deux boîtes de Pétri, en veillant à ce qu’aucune bulle ne se forme. Couvrez les plats en inclinant les couvercles et laissez-les à RT jusqu’à ce que l’agarose se soit solidifié. Une fois solidifié, retirez le moule et conservez les plaques à l’envers à 4 °C dans un sac en plastique scellé.
  4. Préparation des aiguilles d’injection
    1. Pour les injections de Morpholino : Générer des aiguilles à partir de capillaires de 10 cm à l’aide d’un extracteur d’aiguille et casser les pointes pour atteindre un diamètre estimé à 10 μm (comme décrit en27).
    2. Pour la greffe de cellules : Utilisez des aiguilles d’injection à bout émoussé pré-tirées disponibles dans le commerce avec un diamètre extérieur de 20 μm.
  5. Culture de cellules greffées : Cellules divisées (p. ex., Nalm6) visant une densité cible de 70 % à 80 % au jour 4 dans un flacon de culture cellulaire T175 avec un milieu RPMI complété par 10 % de FCS et 1 % de P/S (RPMI-complet). Divisez les cellules 3 à 4 fois avant utilisation pour assurer un bon taux de prolifération.
    REMARQUE : Pour la préparation de matériel de patient frais ou frais/congelé pour la transplantation, les instructions se trouvent à l’étape 4.3. Les cellules sont ensuite préparées le jour de la transplantation.
  6. Reproduction du poisson-zèbre : Installez des poissons-zèbres de type sauvage dans des bassins de reproduction l’après-midi, en gardant les mâles et les femelles séparés.
    REMARQUE : Les poissons-zèbres ont été élevés et stadifiés comme décrit dans la référence28. Les références temporelles (hpf ou dpf) indiquent les heures ou les jours après la fécondation.

2. Jour 2 : Injection de Morpholino

  1. Compléter 500 mL de milieu E3 autoclavé avec 1 % de pénicilline/streptomycine (E3/P/S) et remplir deux boîtes de Pétri de 10 cm. Sortez la plaque d’injection du réfrigérateur pour la préchauffer à RT.
  2. Ouverture échelonnée de la porte des réservoirs d’élevage de sorte que la fécondation ne puisse avoir lieu que dans une fraction des réservoirs à la fois (en fonction de la vitesse d’injection) pour assurer des micro-injections rapides de la solution Morpholino dans les embryons de poisson-zèbre au stade unicellulaire28,29. Commencez par ouvrir une ou deux portes en fonction de la vitesse de l’injecteur, lorsque le lot d’œufs est facilement injecté, ouvrez une autre porte ou deux portes et ainsi de suite.
  3. Transférez les ovules fécondés par lots de 100 avec le moins de liquide possible dans la plaque d’injection préalablement préparée. Alignez les embryons dans les rainures de la plaque.
  4. Injectez 1 nL d’un mélange de 50 μM des deux Morpholinos dans la cellule ou le sac vitellin juste en dessous de la cellule pendant le stade29 d’une cellule. Injectez suffisamment d’ovules pour les procédures ultérieures (par exemple, pour une plaque de 96 puits, injectez jusqu’à 200 ovules pour avoir suffisamment de sauvegarde pour un abandon potentiel avant la transplantation).
  5. Transférez les œufs injectés dans des boîtes de Pétri contenant E3/P/S. Incuber les œufs injectés à 28 °C. Conserver les œufs non injectés comme poissons témoins pour l’analyse par cytométrie en flux à 5 dpf. Stockez le reste du fluide E3/P/S à 4 °C.

3. Jour 3 : Déchorionnation

  1. Déchorionnement des embryons de poisson-zèbre : Déchorionner manuellement les embryons lorsqu’ils ont plus de 24 hpf à l’aide de deux pinces de précision29.
    1. À l’aide d’une pipette Pasteur, retirez des boîtes tous les embryons morts qui ne montrent ni battements cardiaques ni mouvement et qui semblent opaques ou les embryons de forme irrégulière.
    2. Pincez le chorion avec une pince de précision pour le maintenir en place. Pincez juste à côté de l’extrémité de la pince de précision, en maintenant l’embryon en place avec la deuxième pince, et écartez soigneusement le chorion pour libérer l’embryon
      REMARQUE : Pour déchorionner les embryons de moins de 24 hpf, ils doivent être conservés sur une boîte recouverte d’agarose pour éviter qu’ils ne collent au plastique. La déchorionnation manuelle est préférée car elle est plus douce pour les embryons. Une autre méthode de déchorionation enzymatique est décrite ailleurs30.
  2. Incuber les embryons déchoionnés à 28 °C pendant la nuit.

4. Jour 4 : Xénotransplantation et traitement médicamenteux

  1. Préparation des embryons hôtes : Sortez les plaques d’agarose préparées et E3/P/S du réfrigérateur et laissez-les atteindre RT. Dépister les embryons pour le stade de développement approprié à 48 hpf à l’aide d’un stéréomicroscope. N’inclure dans le flux de travail que des embryons correctement stadifiés et morphologiquement typiques, comme décrit ailleurs29. Comptez tous les embryons sains et planifiez d’autres traitements. Ne conservez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri de 10 cm à 28 °C pour éviter les vitesses de développement inégales causées par le manque d’oxygène.
    REMARQUE : Suivez l’étape 4.2. pour les lignées cellulaires. Pour les matières fraîches/congelées, passez directement à l’étape 4.3.
  2. Préparation de lignées cellulaires
    1. Pour préparer des cellules BCP-ALL marquées par fluorescence pour la cytométrie en flux et la transplantation, laver les cellules (à partir de l’étape 1.5) avec 1x PBS : centrifuger à 350 x g pendant 5 min, et remettre en suspension dans 20 mL de PBS.
    2. Comptez les cellules et transférez 3 x 105 cellules non colorées dans un tube FACS pour l’analyse par cytométrie en flux du jour 0 (0 jours après l’injection, dpi). Conserver sur de la glace.
    3. Plaque 3 x 105 cellules dans 3 mL de RPMI-compléter dans un puits d’une plaque de 6 puits et maintenir à 37 °C pour un contrôle de 3 dpi.
    4. Transférez 1 x 107 cellules dans un tube à centrifuger de 15 ml pour l’étiquetage CTV. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à RT, verser le surnageant (utiliser une pipette pour le reste) et remettre la pastille en suspension dans 2,5 mL de PBS (RT) avec 1 μL de solution mère CTV.
    5. Incuber pendant 5 min dans l’obscurité à 37 °C, arrêter la réaction avec 12,5 mL de RPMI-complete, puis incuber pendant 10 min dans l’obscurité à 37 °C.
    6. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à RT et laver une fois avec 10 mL de RPMI-complete. Centrifuger à nouveau et remettre en suspension dans 10 mL de RPMI-complete.
    7. Filtrer les cellules à l’aide d’un filtre de 10 μm par centrifugation à 350 x g pendant 5 min. Remettez la pastille en suspension, comptez les cellules et transférez 3 x 105 cellules marquées CTV dans un tube FACS. Plaque 3x 10^5 cellules avec 3 mL de RPMI-complet dans un puits d’une plaque de 6 puits et maintenir à 37°C pour un contrôle de la prolifération de 3 dpi. Conservez les cellules restantes dans 1 mL de PBS sur de la glace jusqu’à la transplantation.
  3. Préparation de matériel patient frais/congelé
    1. Préchauffez deux tubes à centrifuger de 15 mL avec 10 mL de RPMI-complete chacun à 37 °C. Décongeler un flacon contenant 5-10 x 106 cellules dans un bain-marie à 37 °C.
    2. Une fois qu’il ne reste qu’une petite quantité de glace, transférez les cellules dans le tube de centrifugation avec le milieu préchauffé. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min à RT, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans le deuxième tube de RPMI-complete préchauffé.
    3. Comptez les cellules viables à l’aide du bleu trypan. Aliquote 1x 10^5 cellules dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et centrifuger cette aliquote de cellules dans un tube FACS à 350 x g pendant 5 min à RT, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 300 μL de PBS.
    4. Stocker l’aliquote remise en suspension sur de la glace comme témoin non traité pour l’analyse par cytométrie en flux.
      REMARQUE : Si la taille de l’échantillon est suffisante, maintenir un témoin non traité en culture pour la mesure par cytométrie en flux le jour 7.
    5. Ajouter 1 μL de la solution mère CTV à 2,5 mL de PBS (RT) pour 1 x 106 cellules. Ajustez le volume de la solution mère CTV si moins de cellules sont disponibles.
    6. Incuber les cellules avec CTV pendant 5 min à 37 °C dans l’obscurité, arrêter la réaction en ajoutant 12,5 mL de RPMI-complete préchauffé (37 °C) et incuber pendant 10 min dans l’obscurité à 37 °C.
    7. Centrifugez les cellules à 350 x g pendant 5 min à RT et lavez les cellules une fois avec 10 mL de RPMI-complete. Centrifuger à nouveau à 350 x g pendant 5 min à RT et remettre les cellules en suspension dans 10 mL de RPMI-complete.
    8. Filtrer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger frais de 50 mL à l’aide d’un filtre de 10 μm et centrifuger à 350 x g pendant 5 min.
    9. Ne jetez pas le surnageant. Remettez la pastille en suspension et comptez les cellules. Transférez 3 x 105 cellules marquées CTV dans un tube FACS.
    10. Centrifuger les cellules restantes à 350 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant. Remettre en suspension les cellules restantes dans 1 mL de PBS et les conserver sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient utilisées en transplantation.
      REMARQUE : S’il reste suffisamment de cellules CTV positives, elles peuvent être maintenues en culture 2D parallèlement aux xénogreffes pour la comparaison du taux de prolifération.
  4. Mesure par cytométrie en flux
    REMARQUE : La cytométrie en flux à 0 dpi doit être effectuée par une deuxième personne afin de minimiser le temps pendant lequel les cellules restent sur la glace avant la transplantation. Avant la première mesure par cytométrie en flux à l’aide du panel de coloration désigné (CTV, CD19-Alexa488, APC-Annexin V et 7AAD), effectuez un test de compensation en suivant les instructions du fabricant.
    1. Préparez deux tubes FACS comme suit : Tube 1 : Cellules de contrôle non colorées ; Tube 2 : Cellules colorées avec CTV, CD19, 7AAD et Annexine.
      REMARQUE : Coloration et marquages : CellTrace Violet (CTV) identifie les cellules greffées marquées par rapport aux cellules de poisson hôte et évalue le taux de prolifération après 3 jours. L’anticorps CD19, un marqueur de surface cellulaire, sert de marqueur supplémentaire pour l’identification des cellules greffées humaines BCP-ALL. Pour d’autres types de cancer, d’autres anticorps marqueurs peuvent être nécessaires. L’annexine V marque l’apoptose à un stade précoce pour l’évaluation de la viabilité cellulaire. 7AAD marque l’apoptose ou la nécrose à un stade avancé pour l’évaluation de la viabilité cellulaire.
    2. Tubes à centrifuger (l’un contenant des cellules colorées au CTV et l’autre des cellules non colorées) à 350 x g pendant 5 min à RT et jeter le surnageant du tube 1. Remettez la pastille en suspension dans 310 μL de tampon de liaison à l’annexine (ABB).
    3. Tube 2 : Effectuez la coloration des anticorps et de la viabilité comme décrit ci-dessous.
      REMARQUE : Ce protocole de coloration est optimisé pour la coloration des cellules B CD19. Pour d’autres anticorps humains utilisés pour le marquage de différents types de cellules, le protocole peut nécessiter une adaptation.
      1. Ajouter 98 μL d’ABB dans le tube 2 (contenant des cellules marquées CTV). Ajouter 2 μL d’anticorps CD19-Alexa488 (dilution 1:50) aux 98 μL d’ABB ajoutés. Bien mélanger.
      2. Incuber le mélange à 4 °C pendant 30 min et ajouter 500 μL d’ABB pour arrêter la réaction. Centrifuger le tube à 350 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant et répétez l’étape de lavage.
      3. Remettre la pastille en suspension dans 100 μL d’ABB et procéder à la coloration 7AAD et APC-Annexine V. Effectuez la coloration 7AAD et l’APC Annexine V et la mesure par cytométrie en flux comme décrit ci-dessous.
      4. Ajouter 5 μL de 7AAD et 5 μL d’APC-Annexine V dans les cellules remises en suspension. Agiter doucement pour mélanger. Incuber le tube pendant 15 minutes dans l’obscurité à RT. Ajouter 200 μL d’ABB pour atteindre un volume final de 310 μL.
      5. Effectuez l’analyse par cytométrie en flux le jour de la transplantation dans l’ordre suivant pour éviter la contamination croisée : cellules de contrôle non colorées (tube 1), cellules marquées au CTV colorées avec Alexa488-CD19, APC-Annexine V et 7AAD (tube 2). Enregistrez au moins 10 000 événements par échantillon pour une analyse suffisante.

5. Transplantation

  1. Plaque de transplantation : Préparez deux boîtes de Pétri de 10 cm remplies de E3/P/S et placez-les dans l’incubateur à 28 °C pendant au moins 30 minutes pour préchauffer.
  2. Préparation des cellules : Centrifuger les cellules à 350 x g pendant 5 min à RT, jeter le surnageant et prélever tout liquide restant à l’aide d’une micro-pipette. Ajouter du PBS pour obtenir un volume final de 20 μL. Maintenir la suspension cellulaire concentrée sur de la glace.
    REMARQUE : Les cellules ne doivent pas rester sur la glace plus de 2 h pendant la procédure de transplantation.
  3. Aiguille de transplantation et préparation de l’embryon hôte
    1. Transférez 25 à 30 embryons dans l’une des boîtes de Pétri préchauffées contenant E3/P/S à l’aide d’une pipette Pasteur en verre pour servir de contrôle. Chargez 4 μL de la suspension cellulaire dans l’aiguille de transplantation à l’aide d’une pointe de micro-chargeur.
      REMARQUE : Le chargement doit se dérouler sans problème en 1 à 2 minutes. Si ce n’est pas le cas, ajoutez soigneusement plus de PBS à la suspension cellulaire.
    2. Calibrez la pression d’injection et la longueur d’impulsion en ajustant le micro-injecteur. Ajuster jusqu’à ce qu’une injection expulse environ 1 000 cellules LAL ou 2 nL de suspension cellulaire (pour 1x 107 cellules dans 20 μL). Pour estimer 1 000 cellules, il faut expulser un volume de la suspension sur une surface d’agarose recouverte d’un fluide. Comptez 100 cellules dans une petite zone, extrapolez leur distribution à la population cellulaire totale et estimez le nombre total.
    3. Préparez 50 mL d’E3 contenant de la tricaïne (concentration finale : 80 mg/L). Transférez les embryons hôtes dans la solution de tricaïne et incubez pendant au moins 2 minutes pour assurer une anesthésie correcte. L’embryon est correctement anesthésié lorsqu’aucune réponse motrice n’est observable
      REMARQUE : Une pointe de micro-chargeur ou une pince peut être utilisée pour approcher et/ou toucher soigneusement l’embryon.
    4. Transférez 15 à 20 embryons déchorionnés dans une boîte d’injection enrobée d’agarose (voir les instructions de préparation précédentes) en utilisant le moins de liquide possible pour éviter que les embryons ne glissent.
    5. Disposez les embryons comme illustré à la figure 2A. Injecter environ 1 000 cellules BCP-ALL CTV-positives dans la cavité péricardique. Introduisez l’aiguille à un angle de 45° par rapport à la direction dorso-caudale, comme le montre la figure 2B pour injecter les cellules.
      REMARQUE : Utilisez des aiguilles pré-tirées, à extrémité émoussée, d’un diamètre d’ouverture de 20 μm, spécialement conçues pour les petites cellules leucémiques (voir la liste des matériaux). Si l’aiguille se bloque, coupez-la si nécessaire, mais recalibrez le volume d’injection et le nombre de cellules par la suite.
    6. Une fois que les 15 à 20 embryons sont injectés, transférez-les dans la boîte de Pétri préchauffée remplie d’E3/P/S et maintenez-la à 28 °C.
    7. Répétez les étapes jusqu’à ce qu’environ 100 à 150 embryons soient transplantés pour un test de traitement médicamenteux, qui devrait inclure trois concentrations de médicament et un contrôle.
    8. Incuber les embryons transplantés et les témoins non transplantés à 28 °C pendant 1 à 3 h avant de commencer le traitement médicamenteux.
  4. Traitement médicamenteux in vivo (plaque de 96 puits)
    1. À l’aide d’une stéréomicroscopie à fluorescence, dépister les embryons pour confirmer la réussite de la greffe (figure 2C). Assurez-vous que le jaune est intact, car l’environnement du vitellin peut être toxique pour les cellules greffées21. Jetez les embryons avec des cellules dans le jaune.
    2. Préparez 2,5 mL d’une solution concentrée 2x pour chaque condition médicamenteuse à tester dans E3/P/S avec 0,5 % de DMSO. De plus, préparer une solution de contrôle de véhicule de 5 mL contenant 0,5 % de DMSO dans E3/P/S.
    3. Ajouter 100 μL de E3/P/S + 0,5 % de DMSO dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. Cette étape empêche le transfert involontaire de quantités minimales de médicament entre les puits.
    4. Transférez soigneusement un embryon greffé dans chaque puits. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, prélevez chaque embryon dans le moins de milieu E3 possible.
    5. Laissez l’embryon couler au fond de la pointe de la pipette en inclinant doucement la pipette et relâchez-le dans le puits en utilisant les forces capillaires. Évitez de toucher le fluide dans le puits pendant le transfert.
    6. Ajouter des solutions médicamenteuses à la plaque : Remplissez 24 puits (2 rangées) de la plaque de 96 puits avec 100 μL de la solution de contrôle du véhicule ou l’une des trois solutions médicamenteuses concentrées 2x.
      REMARQUE : Les concentrations efficaces du médicament doivent être déterminées lors d’expériences préalables spécifiques à chaque médicament testé.
    7. Maintenir les embryons à 35 °C pendant 72 h, y compris les embryons non transplantés, qui serviront de témoins pour l’analyse par cytométrie en flux le jour 7.

6. Jour 7

  1. Dissociation embryonnaire/greffon
    1. Criblez la plaque de 96 puits à l’aide de la stéréomicroscopie pour identifier et sélectionner des embryons de poisson-zèbre sains. Regroupez au hasard 10 embryons hôtes sains de chaque condition dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL (idéalement, ce qui donne 2 tubes par condition).
    2. Retirez autant de liquide que possible de chaque tube contenant un embryon et sacrifiez les embryons par choc hypothermique en incubant les tubes sur de la glace pendant 1 h.
    3. Ajouter 500 μL de solution saline équilibrée de Hank’s (HBSS) sans calcium ni magnésium dans chaque tube. Dissocier mécaniquement les embryons et les cellules greffées par trituration à l’aide d’une pointe de micropipette de 200 μL, en pipetant de haut en bas environ 15 fois.
    4. Granuler les fragments de tissu par centrifugation à 350 x g pendant 5 min à RT. Pendant ce temps, préparez des tubes FACS avec un capuchon de filtre à mailles fines de 35 μm contenant 2 ml de PBS par condition (4 tubes au total).
    5. Remettre en suspension chaque pastille dans 500 μL de mélange d’enzymes (0,01 % de papaïne, 0,1 % de dispase II, 0,01 % de désoxyribonucléase I et 12,4 mM de MgSO4 dans un HBSS sans calcium ni magnésium) pour la dissociation enzymatique. Incuber à RT pendant 15 min.
    6. Pendant l’incubation, pipetez le mélange de haut en bas toutes les 5 minutes à plusieurs reprises en utilisant la même pointe de pipette pour chaque tube individuel afin d’éviter la perte de tissu.
  2. Mesure par cytométrie en flux
    1. Transférez les cellules dissociées dans le capuchon de filtre à mailles fines de 35 μm des tubes FACS et centrifugez à 350 x g pendant 5 min.
    2. Pendant la centrifugation, préparez un mélange maître pour la coloration de surface des cellules B CD19. Combinez 98 μL d’ABB avec 2 μL d’anticorps anti-CD19 humain Alexa Fluor 488 pour chaque condition.
    3. Jetez le surnageant de la pastille cellulaire dissociée et remettez la pastille en suspension dans 100 μL du mélange maître de coloration CD19.
    4. Effectuez le protocole de coloration CD19, 7AAD et APC Annexin V pour tous les échantillons ZefiX, y compris 3 x 10cellules 5 CTV positives issues de cultures cellulaires parallèles si disponibles.
    5. Effectuer une analyse par cytométrie en flux conformément à l’ordonnance et consigner le nombre d’événements indiqué au tableau 2. Analysez tous les échantillons contenant des cellules hôtes et des cellules greffées aussi complètement que possible pour évaluer le nombre total de cellules greffées.
  3. Analyse des résultats à l’aide d’un logiciel commercial.
    1. Stratégie de contrôle pour l’échantillon de culture cellulaire : ouvrez le logiciel et chargez les fichiers FCS dans l’espace de travail. Créez un diagramme à points avec CD19 et CTV pour vous assurer que le signal se chevauche et pour confirmer la présence des cellules cancéreuses. Ensuite, créez un graphique à points avec FSC-A (axe x) et SSC-A (axe y) pour distinguer les cellules intactes (Q2) des débris (Q4 ; Figure 3A').
    2. Utilisez la population de cellules intactes pour créer un nouveau graphique avec SSC-H (axe des x) et SSC-A (axe des y) pour identifier les cellules individuelles (figure 3A'').
    3. Créez un autre diagramme à points avec Annexin V (axe x) et 7AAD (axe y) en utilisant la population Single Cells (Figure 3A'''). Distinguer les cellules en quatre populations : Cellules viables : Annexine V négative, 7AAD négative (Q4) ; Cellules apoptotiques précoces : Annexine V positive, 7AAD négative (Q3) ; Cellules apoptotiques/nécrotiques tardives : Annexine V positive, 7AAD positive (Q2) ; Cellules nécrotiques : Annexine V négative, 7AAD positive (Q1).
    4. Répétez ces étapes pour des échantillons de 3 ppp (Figure 3B).
    5. Stratégie de contrôle pour les cellules du greffon et de l’embryon hôte
      1. Séparez les cellules greffées humaines des cellules hôtes à l’aide d’un graphique à points avec CTV (axe x) et CD19 (axe y). Identifier et isoler les cellules greffées doublement positives CTV/CD19 (Figure 3C).
      2. Appliquer la même stratégie de contrôle décrite pour les cellules de culture 3 dpi (Figure 3B' - B''') à la population de cellules greffées. Copiez la stratégie de contrôle pour plus de cohérence.
      3. Fusionnez toutes les populations de cellules Annexine V et 7AAD négatives dans un histogramme avec des valeurs CTV sur l’axe des x (Figure 3D). Calculez la moyenne géométrique des cinq échantillons pour déterminer les taux de prolifération.
  4. Calculs pour l’évaluation de la réponse au traitement
    1. Pour déterminer le nombre de divisions cellulaires après 3 jours, utilisez la formule :
      n = log2 (I0/I)
      Où, I0 = Intensité de fluorescence CTV initiale (moyenne géométrique, 0 dpi), I = Intensité de fluorescence CTV à 72 h, n = Nombre de divisions cellulaires.
      Exemple : Cellules de patients fraîchement congelées divisées 2,6 fois dans le log ZefiX2(88317/14644) = 2,6
      et 2,8x dans le log de culture 2D2(88317/12992) = 2,8
    2. Pour déterminer le nombre total de cellules greffées par poisson après 3 jours, divisez le nombre total de cellules cancéreuses (y compris les cellules apoptotiques mais à l’exclusion des débris) par le nombre de poissons regroupés dans l’échantillon (généralement n = 10).
    3. Pour déterminer la viabilité des cellules greffées CTV-positives après 3 jours, utilisez la formule :
      V = (C/100) x A
      Où : V = Viabilité, C = fraction de cellules individuelles intactes sans débris (en pourcentage), A = fraction de cellules négatives en annexe V et 7AAD (en pourcentage).

Résultats

Pour une évaluation scientifique détaillée du protocole ZefiX, y compris la xénogreffe et le traitement médicamenteux d’échantillons de cellules primaires BCP-ALL fraîchement congelés, veuillez vous référer au manuscrit21 précédemment publié. L’autorisation d’utiliser des échantillons de patients dans la recherche pour des tests précliniques de médicaments a été accordée dans le cadre d’études complémentaires à l’essai ALL-REZ BFM ...

Discussion

Les embryons de poisson-zèbre sont devenus un modèle de xénogreffe de plus en plus populaire pour le dépistage des médicaments et la recherche sur le cancer en raison de leur capacité de débit élevée et de leur rentabilité. Ces xénogreffes sont prometteuses en tant que pilier essentiel de la médecine translationnelle, aidant à la recherche préclinique et à la prise de décision 9,21. Cependant, les modèles de xén...

Déclarations de divulgation

Tous les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) au sein du Centre de recherche collaborative CRC1588, projet numéro 493872418 et la Dr. Kleist Stiftung, Berlin, ainsi que par la Deutsche José Carreras Leukämie Stiftung (R03/2016), la Berliner Krebsgesellschaft (HEFF201633KK) et le Consortium allemand contre le cancer (DKTK, Joint Funding Call 2016). Nous remercions Julia Köppke et Mareike Wolff pour leur lecture critique du manuscrit.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Petri dish  (10 cm)GreinerP7237
7-AAD viability staining solution Invitrogen00-6993-50
Agarose (LE, analytic grade)Biozym 840004
Air pressure injectorNarishigeIM400 with external gas supply
Alexa Fluor 488 anti-human CD19 antibody Biolegend302219
Annexin binding bufferBiolegend422201Or see solutions for preparation
APC annexin V Biolegend640941
Capillaries (10 cm, OD 1.0 mm, with filaments)WPIINCTW100F-41.0 OD; 0.75 ID
Cell culture flask (T-175)Sarstedt83,39,12,002
CellTrace Violet InvitrogenC34557
Dimethyl sulphoxide (DMSO)RothA994.1
Dispase II Sigma AldrichD4693-1g
DNase IAppliChem GmbHA3778
Eppendorf tubes (1.5 ml)Eppendorf30120086
FACS tube (Polystyrene round botton Tube with Cell strainer Cap, 5 ml)Falcon352235
Falcon tubes (50 ml)Falcon352070
Fetal calf serum (FCS)Sigma AldrichC8056
Fine mesh filter (10 µm)PluriStrainer435001050
Fine mesh filter (20 µm)PluriStrainer431002040
Flow cytometer Becton DickinsonBD LSRFortessa X-20
Fluorescent stereomicroscopeLeica
Fluorescent stereomicroscope with cameraLeicaM165 FCCamera: DFC7000 T
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS, Calcium and Magnesium free )Sigma Aldrich88284
Injection mold (Zebrafish MI/Transplant KIT)World Precision Instruments Z-MOLDS
Injection needles (without filament)Biomedical instrumentsVZIPbl-20-10-55Zebrafish injection pipette, blunt, OD: 20μm ± 1, TL:~10mm, PL: 55mm, Glass: BM100T-10P
Macro-centrifugeEppendorf
Micro-centrifuge
Morpholino (csf3r)Gene Tools LLCcsf3r (GAAGCACAAGCGA
GACGGATGCCA)
Morpholino (spi1)Gene Tools LLCspi1(GATATACTGATAC
TCCATTGGTGGT)
PapainSigma AldrichP3125
Penicillin-Streptomycin (Penstrep; 10.000 U/ml)Gibco15140122
Plates (4-well)Greiner Bio one 657160
Plates (96-well)Greiner Bio one 657180
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediumGibco21875-034
Tricaine  (MS-222)Sigma AldrichE10521-50GEthy-3 aminobenzoate methanesulfenate

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