Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تحدد هذه المخطوطة بروتوكولا لإعداد مكتبة ATAC-seq للعدلات من نخاع عظم الفئران ، بهدف ضمان بقاء العدلات المثلى وجودة المكتبة العالية. يقدم إرشادات خطوة بخطوة حول إعداد BMC ، والفرز المناعي المغناطيسي ، وبناء المكتبة ، ويعمل كدليل قيم ، خاصة للوافدين الجدد لدراسة العدلات.

Abstract

مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه من Transposasse مع التسلسل (ATAC-seq) هي تقنية قوية وعالية الإنتاجية لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين وفهم التنظيم الجيني. تخضع العدلات ، كنوع حاسم من الكريات البيض في الاستجابات المناعية ، لتغييرات معمارية كبيرة في الكروماتين أثناء التمايز والتنشيط ، مما يؤثر بشكل كبير على التعبير الجيني الضروري لوظائفها. كان ATAC-seq مفيدا في الكشف عن عوامل النسخ الرئيسية في نضوج العدلات ، والكشف عن التوقيعات اللاجينية الخاصة بمسببات الأمراض ، وتحديد الأهداف العلاجية لأمراض المناعة الذاتية. ومع ذلك ، فإن حساسية العدلات للوسط الخارجي تعقد إنتاج بيانات ATAC-seq عالية الجودة. هنا ، نقترح بروتوكولا قابلا للتطوير لإعداد مكتبات ATAC-seq من العدلات المشتقة من نخاع عظام القوارض ، والتي تتميز بالفصل المغناطيسي المناعي المحسن لضمان بقاء الخلايا المثلى والمكتبات عالية الجودة. تتم مناقشة العناصر الحيوية التي تؤثر على جودة المكتبة ومبادئ التحسين للتوسع المنهجي بالتفصيل. سيدعم هذا البروتوكول الباحثين الراغبين في دراسة بنية الكروماتين وإعادة البرمجة اللاجينية للعدلات ، وتطوير الدراسات في علم المناعة الأساسي والسريري.

Introduction

تعد العدلات واحدة من أكثر أنواع الخلايا المناعية وفرة وأهمية في الفقاريات ، حيث تشكل 50٪ -70٪ من الكريات البيض البشرية1. تلعب العدلات دورا مركزيا في اكتشاف الكائنات الحية الدقيقة والقضاء عليها في العوائف. أثناء تعفن الدم ، تكون العدلات الناضجة من بين المستجيبين الأوائل2. يتحركون بسرعة إلى مواقع العدوى عبر الانجذاب الكيميائي3 ، حيث يكافحون مسببات الأمراض عن طريق تناول الكائنات الحية الدقيقة (البلعمة) ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المعتمدة على NADPH أوكسيديز (رشقات نارية في الجهاز التنفسي) ، وإفراز الحبيبات (التحلل) ، وتشكيل مصائد خارج الخلية (NETs) التي تلتقط وتقتل البكتيريا خارج الخلية بمجرد وصولها إلى موقع الالتهاب4. يتم أيضا تعبئة العدلات غير الناضجة بسرعة من نخاع العظم إلى الدورة الدموية المحيطية بواسطة الكيموكينات5،6. تطلق هذه العدلات التي تنجذب إلى الموقع المعدي أيضا السيتوكينات ، والتي تشارك في العديد من العمليات الفسيولوجية ، مثل تكون الدم ، وتكوين الأوعية الدموية ، والتئام الجروح7،8. المرضى الذين يعانون من أمراض خلقية أو مكتسبة تؤدي إلى انخفاض عدد العدلات هم أكثر عرضة للعدوى9،10. ومع ذلك ، فإن تنشيط العدلات هو سيف ذو حدين. يمكن أن يتسبب التنشيط المفرط وإفراز السيتوكين في تلف الأنسجة والأعضاء ، مما يؤدي إلى خلل وظيفي متعدد في الأعضاء إذا لم يتم السيطرة على العدوى على الفور11،12. بالإضافة إلى ذلك ، تساهم العدلات أيضا في العديد من الأمراض الالتهابية وأمراض المناعة الذاتية ويمكن أن تؤثر على تطور السرطان والورم الخبيث13،14. هذا يؤكد الحاجة إلى دراسة تنظيم نشاط العدلات لتحقيق التوازن بين الاستجابة المناعية الفعالة ومنع تلف المضيف.

في العدلات ، تخضع بنية الكروماتين لتغييرات مميزة وديناميكية في تمايزها وهجرتها وتنشيطها ، مما يؤدي إلى ممارسة أدوار تنظيمية محورية طوال عمر الخلية. هذه الرحلة ، من النواة الكبيرة المستديرة والغنية بالكروماتين للأرومات النخاعية إلى نواة أكثر مسافة بادئة في الخلايا النخاعية والخلايا النخاعية ، ثم إلى خلايا داخل النطاق على شكل C أو S وفصيصية للغاية مع الكروماتين المعبأ بكثافة في العدلات متعددة الأشكال15،16 ، هي شهادة على تعقيد بيولوجيا العدلات. يضمن تكوين الكروماتين المتخصص التعبير الانتقائي للجينات الضرورية لوظيفة العدلات ، مثل تلك المشاركة في إنتاج الحبيبات واستجابات النسخ السريعة اللازمة للتخلص الفعال من مسبباتالأمراض 17. عندما يتم تعبئة العدلات إلى المواقع الالتهابية عبر الانجذاب الكيميائي ، فإن الهجرة عبر البطانة تضغط على مركب الرابط المركب للهيكل النووي / الهيكل الخلوي (LINC) ، مما يؤدي إلى إعادة تشكيل الكروماتين والمزيد من إمكاناتالتنشيط 18. في الإنتان ، تظهر العدلات المنشطة "تحولا نوويا يسارا" ، مع مورفولوجيا غير طبيعية للكروماتين ، مثل النوى ثنائية أو غير المفصصة وتكثيف الكروماتين الأكثر مرونة19. ينتج عن هذا زيادة إمكانية الوصول داخل مناطق الجينات المرتبطة بالاستجابة الالتهابية ، مما يؤدي إلى تعبير كبير عن هذه الجينات. إذا لم يتم السيطرة على العدوى على النحو الواجب ، فإن الهيستون سيترولين وتفكيك الكروماتين اللاحق ضروريان لتكوين NETs20،21. لذلك ، فإن فهم بنية كروماتين العدلات أمر بالغ الأهمية لتطوير بيولوجيا العدلات وتطوير علاجات للأمراض الالتهابية وأمراض المناعة الذاتية ، مما يوفر الأمل في علاج الأمراض في المستقبل.

تعمل إمكانية الوصول إلى الكروماتين كمقياس لبنية الكروماتين على المستوى الجينومي. يشير إلى كيف يسمح بالمناطق الجينومية جسديا للمعززات والمحفزات والعوازل وعوامل ربط الكروماتين وكيف تؤثر هذه العناصر على التعبير الجيني22. مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه عبر الترانسبوزاز مع التسلسل (ATAC-seq) هي تقنية مستخدمة على نطاق واسع لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين عبر الجينوم23. لا يتطلب معرفة مسبقة بالعناصر التنظيمية ، مما يجعله أداة قوية للبحوث اللاجينية تتضمن هذه الطريقة عزل نوى العينات ، وتجزئة الحمض النووي الجيني بواسطة الترانسبوزاز Tn5 ، وإضافة بادئات التسلسل لإعداد المكتبة ، والتسلسل ، وتحليل البيانات23. كان ATAC-seq مفيدا في دراسة رسم خرائط النيوكليوسوم ، وتحليل ربط عامل النسخ ، والآليات التنظيمية في أنواع الخلايا المختلفة أو الأمراض ، وتحديد المحسن الجديد ، واكتشاف المؤشرات الحيوية ، وما إلى ذلك22،23. غالبا ما يتم دمجه مع تقنيات أخرى ، مثل تسلسل الحمض النووي الريبي ، لإجراء تحليل شامل للتعبير الجيني.

طورت ATAC-seq معرفتنا ببيولوجيا العدلات من خلال الكشف عن آليات جينية دقيقة في الصحة والمرض. لقد كشفت عن العديد من عوامل النسخ الرئيسية (مثل RUNX1 ، KLF6 ، PU.1 ، إلخ) في نضوج العدلات واستجابات المستجيب24،25 ، واكتشفت تواقيع خاصة بمسببات الأمراض مع إمكانات المؤشرات الحيوية في الإنتان26 ، وأوضح الآليات اللاجينية للذاكرة المناعية الفطرية12 ، وحدد الأهداف العلاجية في ابيضاض الدم النخاعي الحاد لدى الأطفال (AML) 27. ومع ذلك ، كمكون خلوي بارز في المراقبة المناعية ، تظهر العدلات حساسية عالية لبيئتها الخارجية وبالتالي تشكل تحديا لإنتاج بيانات ATAC-seq عالية الجودة. في ظل الظروف الفسيولوجية ، تم الإبلاغ عن متوسط عمر النصف للعدلات البشرية 3.8 يوما ، في حين أن متوسط عمر النصف لعدلات الفئران هو 12.5 ساعة. من الجدير بالذكر أن نصف عمرها أقصر بكثير عند دراستها في المختبر28،29. أثناء التشغيل المختبري للعدلات المعزولة ، يمكن أن يؤدي التعرض للكائنات الحية الدقيقة أو الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) ، بالإضافة إلى الإجراءات التجريبية الزائدة عن الحاجة والعمليات القاسية ، إلى تنشيط العدلات الشاذ وتقليل قابلية الخلايا للبقاء الخلوي بسبب موت الخلايا المبرمج أو NETosis. تحتوي الخلايا الميتة عادة على كميات كبيرة من الحمض النووي غير الكروماتيني الشديد التأثر ب Tn5 ، مما يؤدي إلى رفع ضوضاء الخلفية ل ATAC-seq23.

هنا ، نقترح بروتوكولا قابلا للتطوير لإعداد مكتبات ATAC-seq المحسنة للعدلات المشتقة من عينات نخاع عظم القوارض. يقدم الشكل 1 نظرة عامة رسومية على البروتوكول ، والذي يشمل الفصل المناعي المغناطيسي للعدلات عن نخاع العظام ، متبوعا ب ATAC-seq. يضمن الفرز المناعي المغناطيسي المحسن الجدوى المثلى للعدلات قبل استخراج النواة لمكتبة ATAC-seq ، وبالتالي ضمان الجودة العالية للمكتبات وتسهيل دمج تقييمات العدلات الإضافية في المخطط. سيساعد تنفيذ هذا البروتوكول الباحثين في فهم ميزات بنية الكروماتين وآليات إعادة البرمجة اللاجينية للعدلات عند تعرضها لتحديات بيئية جزئية مختلفة. من المتوقع أن يكون لهذا تطبيقات واسعة في دراسات المناعة الأساسية والسريرية.

Protocol

امتثلت جميع الإجراءات الحيوانية المعروضة أدناه مع المبادئ التوجيهية واللوائح الوطنية للأخلاقيات ورعاية ، والتي تمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات أبحاث رعاية التابعة لجامعة العاصمة الطبية ، بكين ، الصين (sjtkl11-1x-2022 (060)).

1. تحضير معلقات خلايا نخاع العظم (BMC)

  1. اختر ذكور الفئران C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ووزنهم 19-21 جم. قتل الفئران الرحيم باستخدام حجرة ثاني أكسيد الكربون2 ، متبوعا بخلع عنق الرحم بعد اختفاء المنعكس العميق. تطهيرها برذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ على حصيرة التشريح.
  2. استخدم مقصا صغيرا وملقطا لفصل عظم الفخذ بعناية عن مفصل الورك والساق ، وإزالة الجلد المتصل والعضلات الهيكلية ، وشطف عظم الفخذ بمحلول ملحي بارد مخزن بالفوسفات (PBS) في طبق بتري مقاس 10 سم.
  3. اقطع مشاشية عظم الفخذ ، وأدخل برفق إبرة 28 جم متصلة بحقنة سعة 2 مل في تجويف النخاع ، وقم بإخراج نخاع العظم باستخدام PBS البارد الذي يحتوي على 2٪ مصل بقري جنيني (FBS).
  4. كرر الخطوة السابقة حتى يصبح السائل الأحمر الداكن الشفاف. عادة ما تكون هناك حاجة إلى ثلاث تدفقات.
    ملاحظة: تجنب إدخال الإبرة بعمق شديد في تجويف نخاع العظم لضمان اكتساب الخلايا الأمثل.
  5. استخدم مصفاة خلية 70 ميكرومتر لتصفية معلق الخلية في أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) (5 مل).
  6. قم بتحلل كريات الدم الحمراء في BMCs باستخدام مخزن مؤقت تجاري لتحلل كريات الدم الحمراء بدون بولي فورمالدهايد.
    1. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية ، وترك ما يقرب من 100 ميكرولتر من السائل في الأسفل ، واضغط برفق على الأنبوب لفك الحبيبات.
    2. أضف 2 مل من محلول التحلل المخفف من محلول تحلل كريات الدم الحمراء (10x) ، واخلطه عن طريق قلب الأنبوب رأسا على عقب ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق النقر اللطيف.
    3. اغسل الخلايا مرتين باستخدام وسيط RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS وأعد تعليقها بحجم 2 مل.
      ملاحظة: عند التعامل مع كتل الخلايا غير المتناثرة، يوصى باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لإخراجها بدلا من تصفية معلقات الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. يمكن أن تقلل هذه الطريقة من فقدان الخلايا.
  7. احسب الجدوى الخلوية والعدد الإجمالي للخلايا الحية لكل عينة باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.

2. وضع العلامات المغناطيسية المناعية للعدلات بالخرز المغناطيسي المضاد ل Ly6G

  1. أعد تعليق خلايا نخاع العظم (~ 2 × 107 خلايا حية لكل فأر) في 2 مل من وسط RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS وأجهزة طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية.
    ملاحظة: نظرا للمتطلبات المحدودة المتمثلة في 1 × 105 خلايا ل ATAC-seq ، يمكن تخصيص العدلات الفائضة لتحليلات جينومية إضافية (على سبيل المثال ، ChIP-seq و Hi-C) أو تقييمات وظيفة المناعة (على سبيل المثال ، إنتاج السيتوكين ، البلعمة ، و NETs) باستخدام العدلات التي تم الحصول عليها من نفس الفأر.
  2. استنشق معظم المادة الطافية ، تاركا وراءه ما يقرب من 100 ميكرولتر ، واضغط برفق على الأنبوب لفك الحبيبات.
  3. أضف 30 ميكرولتر من حبات Ly6G واخلطها مع BMCs عن طريق النقر اللطيف.
    ملاحظة: يجب أن تكون الخرزات المغناطيسية دوامة لمدة لا تقل عن 10 ثوان قبل الاستخدام. بعد إضافة الخرزات إلى BMCs ، يوصى بالامتناع عن الدوامة.
  4. احتضان الأنبوب عند 25 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  5. أضف 2 مل من PBS لإعادة تعليق الخرز والخلايا ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 25 درجة مئوية.
  6. استنشق معظم المادة الطافية ، تاركا وراءه ما يقرب من 100 ميكرولتر ، واضغط برفق على الأنبوب لفك الحبيبات. أضف PBS إضافيا لحجم نهائي قدره 1 مل.
    ملاحظة: عند التعامل مع كتل الخلايا غير المتناثرة، يوصى باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر لإخراجها بدلا من تصفية معلقات الخلية من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر. يمكن أن تقلل هذه الطريقة من فقدان الخلايا.

3. فصل العدلات مع فرز الخلايا المغناطيسية المناعية

  1. عالج عمود MS مسبقا باستخدام PBS.
    1. ضع عمود MS داخل المجال المغناطيسي لفاصل فرز الخلايا المنشط مغناطيسيا (MACS) المتوافق. ضع أنبوبا غير مأهول سعة 5 مل أسفل تصريف السائل من عمود MS.
    2. اشطف العمود ب 500 ميكرولتر من PBS. كرر هذه الخطوة بعد التدفق الكامل لبرنامج تلفزيوني إلى عمود MS.
      ملاحظة: يجب السماح ل PBS بالتدفق تدريجيا ، قطرة قطرة ، في أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) سعة 5 مل عبر عمود MS. تأكد من عدم دخول الهواء إلى العمود ، لأن فقاعات الهواء قد تعيق العمود.
  2. قم بتطبيق تعليق BMC المسمى مغناطيسيا على عمود MS عن طريق إضافة 500 ميكرولتر في المرة الواحدة ، وإعادة تعبئته على الفور بمجرد إفراغ خزان العمود.
    ملاحظة: تأكد من خلو معلقات الخلية من كتلة الخلية. إذا لزم الأمر ، ضع أنبوب FACS جديد سعة 5 مل أسفل عمود MS لجمع الخلايا غير المسماة (على سبيل المثال ، الخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية) قبل هذه المرحلة.
    ملاحظة: لاحظ معدل تدفق القطرات. قد يشير معدل التدفق البطيء إلى أن عمود الفرز معوق.
  3. اغسل عمود MS بإضافة 500 ميكرولتر من PBS في كل مرة يكون فيها الخزان فارغا ، وكرر هذه العملية مرتين.
    ملاحظة: قد تؤدي الإضافة المبكرة ل PBS إلى إعاقة دخول خلايا معينة إلى عمود الفرز ، مما قد يضر بنقاء فرز الخلايا.
  4. اجمع العدلات المصنفة مغناطيسيا.
    1. بمجرد نفاد خزان العمود ، قم بإزالة العمود من المجال المغناطيسي وضعه بعناية على أنبوب سعة 5 مل.
      ملاحظة: قبل إزالة العمود ، تأكد من عدم وجود سائل متبقي بداخله لمنع فقدان العدلات بسبب تصريف القطرات أثناء العملية. يمكن إزالة البقايا الموجودة في العمود باستخدام ماصة.
    2. قم بتوزيع 2 مل من PBS على العمود ، ثم ادفع المكبس على الفور وبقوة إلى العمود لطرد العدلات المسماة مغناطيسيا.
      ملاحظة: للحصول على عدلات كافية ، تأكد من حجم الشطف الكافي والبقاء قصيرا عند دفع المكبس في العمود.
  5. استخدم مقياس كثافة الدم لتعداد الخلايا المعزولة. تحديد نقاء العدلات المعزولة عن طريق أخذ 100 ميكرولتر من معلق الخلية بعد الفرز وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي.

4. استخراج النواة

  1. جهاز الطرد المركزي ل 50.000 معلق أحادي الخلية يحتوي على العدلات عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية في أنبوب 0.2 مل ، ثم تخلص من المادة الطافية.
  2. أعد تعليق العدلات في 50 ميكرولتر من محلول التحلل المبرد مسبقا (راجع الجدول 1) ، واخلط المحلول برفق باستخدام ماصة ، واحتضنه على الجليد لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: إذا كان حجم العينة أقل من 5 ميكرولتر ، فإن إضافة المخزن المؤقت للتحلل مسموح به. لا يتجاوز تركيز تعليق الخلية 1 × 107 خلايا / مل.
  3. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم تخلص من المادة الطافية واجمع النواة. ضع الأنبوب على الجليد قبل البدء في الإجراءات اللاحقة.
    ملاحظة: لتقليل فقد العينة ، قم بالإشارة إلى جانب جدار الأنبوب حيث تتراكم الكريات وتستنشق السائل برفق من الجانب الآخر عند إزالة المادة الطافية.

5. علامات النيوكليوسوم المربوطة بالينقولاز

  1. قم بإعداد مزيج تفاعل العلامات الذي يحتوي على Tn5 transposase في أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وفقا لإرشادات مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي (راجع الجدول 2) وقم بتسخين حبات تنقية الأمبليكون المبردة مسبقا عند 25 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  2. أعد تعليق نواة العدلات ب 50 ميكرولتر من مزيج تفاعل الوسم وحركه برفق باستخدام ماصة ، متبوعا بالطرد المركزي لمدة 5 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (~ 2600 × جم).
  3. احتضان أنبوب التفاعل في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. أضف 100 ميكرولتر من حبات تنقية الأمبليكون الدوامة مسبقا إلى المحللة ، ثم امزج الخرزات المغناطيسية جيدا في المحلول عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات.
    ملاحظة: الخرزات المغناطيسية لزجة ويمكن تثبيتها بسهولة بأطراف الماصة، وبالتالي، تأكد من شفط الحجم الصحيح وتوزيعها ببطء من الأطراف عند نقل الخرز.
  5. احتضان أنبوب التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بطرده لمدة 5 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (~ 2600 × جم).
  6. قم بتنقية جزء الحمض النووي المتقطع عن طريق وضع أنبوب التفاعل على رف مغناطيسي حتى يصبح المحلول صافيا (حوالي 5 دقائق). ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرز المغناطيسي.
  7. اغسل الخرزة المغناطيسية ب 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ في كل مرة ، مع الاحتفاظ بأنبوب التفاعل على الرف المغناطيسي لمدة 30 ثانية. تجنب إزعاج الخرز عند إضافة الإيثانول. كرر الإجراء الموضح في الخطوة 5.7.
  8. قم بالطرد المركزي لأنبوب التفاعل باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (حوالي 2600 × جم) ، وشفط الإيثانول بأطراف ماصة 10 ميكرولتر ، ثم جفف الخرزات المغناطيسية لمدة 3-5 دقائق أثناء فتح الغطاء.
    ملاحظة: قد تختلف فترات تجفيف الخرز المغناطيسي باختلاف المناطق بسبب الاختلافات في مستويات الرطوبة. يجب تجفيف الخرزات حتى تفقد لمعانها. يمكن أن يؤدي الإفراط في التجفيف إلى تعقيد عملية الشطف، في حين أن التجفيف غير الكافي قد يؤدي إلى وجود بقايا الكحول، مما يؤثر على التجارب اللاحقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وضع الرف المغناطيسي أفقيا أكثر ملاءمة للتجفيف المنتظم للخرز المغناطيسي.
  9. بعد إزالة أنبوب التفاعل من الرف المغناطيسي ، أضف 26 ميكرولتر من ddH2O لتغطية الخرز المغناطيسي ، مع سحب العينة لأعلى ولأسفل لضمان الخلط الشامل. ثم احتضن عند 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
    ملاحظة: قم بتمديد مدة الحضانة بشكل مناسب إذا كانت الخرزات المغناطيسية جافة بشكل مفرط.
  10. قم بالطرد المركزي لأنبوب التفاعل لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (حوالي 2600 × جم) وافصل الخرزات المغناطيسية باستخدام رف مغناطيسي حتى يصبح المحلول واضحا (حوالي 5 دقائق).
  11. انقل المادة الطافية سعة 24 ميكرولتر بعناية إلى أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل الجديد.

6. بناء المكتبة لتسلسل الجيل التالي (NGS)

  1. قم بإعداد مزيج تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنبوب معقم باستخدام شظايا الحمض النووي المنقى والبادئات التي تحتوي على محولات التسلسل (راجع الجدول 3).
  2. إجراء تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل باتباع الإجراءات الموصى بها (راجع الجدول 4) ، وعادة ما يتطلب حوالي 1 ساعة.
    ملاحظة: قد يتم إيقاف التجربة مؤقتا بعد هذا الإجراء ، ويمكن تخزين منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل عند -20 درجة مئوية أو أسبوعين على الأقل.
  3. أضف 27.5 ميكرولتر من حبات تنقية الأمبليكون الدوامة مسبقا إلى 50 ميكرولتر من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ثم امزج الخرزات المغناطيسية جيدا في المحلول عن طريق سحب الخرز لأعلى ولأسفل 10 مرات.
    ملاحظة: يمكن أن تؤدي النسبة غير الصحيحة للخرز المغناطيسي إلى منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى تناقضات في أطوال الأجزاء التي تم فرزها. استخدم ddH2O لملء الحجم المتبخر لمنتج PCR إلى 50 ميكرولتر. تأكد من شفط الحجم المناسب من الخرز المغناطيسي وتوزيعها ببطء من أطراف الماصة لتقليل الخرزات التي قد تكون متصلة.
  4. احتضان أنبوب التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (حوالي 2600 × جم).
  5. قم بتنقية الحمض النووي للمكتبة عن طريق وضع أنبوب التفاعل على رف مغناطيسي حتى يصبح المحلول واضحا (حوالي 5 دقائق). بعد ذلك ، انقل المادة الطافية بعناية إلى أنبوب PCR معقم جديد وتخلص من الخرزات المغناطيسية.
  6. أضف 50 ميكرولتر من حبات تنقية الأمبليكونات الدوامة مسبقا إلى المادة الطافية ، ثم اخلطي الخرزات المغناطيسية جيدا في المحلول عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل 10 مرات.
  7. احتضان أنبوب التفاعل عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بالطرد المركزي لمدة 5 ثوان باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (حوالي 2600 × جم).
  8. ضع أنبوب التفاعل على رف مغناطيسي حتى يصبح المحلول صافيا (حوالي 5 دقائق) ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الخرز المغناطيسي.
  9. اغسل الخرزة المغناطيسية مرتين ب 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ في كل مرة ، مع الاحتفاظ بأنبوب التفاعل على الرف المغناطيسي لمدة 30 ثانية. تجنب إزعاج الخرز عند إضافة الإيثانول.
  10. جفف الخرزات المغناطيسية لمدة 5 دقائق أثناء فتح الغطاء.
  11. بعد إزالة أنبوب التفاعل من الرف المغناطيسي ، أضف 22 ميكرولتر من ddH2O لتغطية الخرز المغناطيسي ، مع سحب العينة لأعلى ولأسفل لمدة 10 مرات لضمان الخلط الشامل. ثم احتضن عند 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  12. قم بالطرد المركزي لأنبوب التفاعل لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي محمول باليد (حوالي 2600 × جم) وافصل الخرزات المغناطيسية باستخدام رف مغناطيسي حتى يصبح المحلول واضحا (حوالي 5 دقائق).
  13. انقل المادة الطافية سعة 20 ميكرولتر بعناية إلى أنبوب PCR معقم جديد وقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: للحصول على مكتبة ذات توزيع طول أكثر تركيزا ، ضع في اعتبارك استخدام مجموعة استرداد الهلام لفرز المنتج المضخم. بدلا من ذلك ، إذا لم تكن هناك متطلبات محددة لنطاق توزيع الطول ، فيمكن تنقية المنتج المضخم مباشرة باستخدام حبة مغناطيسية أو مجموعة تنقية عمود بدون فرز الطول.

7. مراقبة جودة المكتبة وتسلسلها

  1. استخدم منصات محلل أجزاء الحمض النووي لتقييم توزيع طول الحمض النووي للمكتبة.
  2. استخدم منصات NGS لإجراء تسلسل عالي الإنتاجية على المكتبات التي اجتازت فحص الجودة.

النتائج

تم استخدام البروتوكول الموضح لعزل العدلات من نخاع العظام للفئران C57BL / 6 ومقارنة تباينها في إمكانية الوصول إلى الكروماتين قبل وبعد تحفيز عديدات السكاريد الدهنية (LPS) عبر ATAC-seq. عادة ، يمكن حصاد 2 × 107 BMCs من كل من عظم الفخذ لفأر C57BL / 6 البالغ من العمر 6-8 أسابيع ، وبالتالي ، ...

Discussion

تشير هذه المخطوطة إلى بروتوكول تجريبي لإعداد مكتبات ATAC-seq المحسنة للعدلات المشتقة من عينات نخاع عظم القوارض. نظرا لكون العدلات شديدة الحساسية والخلايا المناعية التي يتم تنشيطها بسهولة ، أعطت جهود التحسين الأولوية للحفاظ على صلاحية العدلات المعزولة. قد يؤدي العلاج غير ا...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح من برنامج البحث والتطوير التابع للجنة التعليم في بلدية بكين (KZ202010025041) والمعاهد الصينية للبحوث الطبية في بكين (المنحة رقم 10). CX24PY29).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.4% Trypan BlueScientificT10282
1x phosphate-buffered salineBiosharpBL302A
20 bp–5000 bp Alignment markerBiopticC109102-100ADNA fragment analyzer supporting products
5k Size marker(Standard 50 bp Ladder)BiopticC109101-100ADNA fragment analyzer supporting products
Amplicons Purification BeadsBeckmanA63881Amplicons Purification Beads is a nucleic acid purification kit for obtaining high quality DNA products.
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, mousemiltenyi130-120-337The Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, mouse were developed for positive selection or depletion of mouse neutrophils from single-cell suspensions of mouse bone marrow.
Anti-mouse CD11b-BV605 (1:200)BDCat#563015
Anti-mouse CD48-PE-Cy7 (1:400)BDCat#560731
Anti-mouse Ly6G-BV510 (1:200)BDCat#740157
C57BL/6J mice, wild type, 8-week-old, maleThe Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical SciencesThe Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences
DNA Separation BufferBiopticC104406DNA fragment analyzer supporting products
E. coli derived ultrapure LPS (serotype0111: B4)Sigma-AldrichCat#L-2630
DNA Quantitative ReagentvazymeEQ111DNA Quantitative Reagentt is a simple, sensitive and accurate double-stranded DNA (dsDNA) fluorescence quantitative assay kit.
Erythrocyte lysis buffer (10x)BioLegendCat#420301
Fetal bovine serumGibcoCat#10099141C
MS Separation columnsmiltenyi130-042-201MS Columns are designed for positive selection of cells. 
RPMI 1640 mediumGibcoC11875500BT
S2 Gel electrophoresis needle BiopticC105101DNA fragment analyzer supporting products
Surgical instruments: scalpel, dissection scissors, microdissection scissors, fine forceps, blunt anatomical forceps, needle holderFisher Scientifichttps://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-toolsCan be purchased from other qualified suppliers
Syringe (1 mL)Fisher Scientific https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464Can be purchased from other qualified suppliers
TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for IlluminavazymeTD501-01TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina is a purpose-built kit specifically developed for Illumina's high-throughput sequencing platform. Using the kit, DNA can be prepared into sequencing libraries dedicated to Illumina's high-throughput sequencing platform.
TruePrepTM Index Kit V2 for IlluminavazymeTD202TruePrep Index Kit V2 for Illumina is a Kit for the TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina. It can be used to prepare 96 different double-ended Index libraries.

References

  1. Mortaz, E., Alipoor, S. D., Adcock, I. M., Mumby, S., Koenderman, L. Update on neutrophil function in severe inflammation. Front Immunol. 9, 2171 (2018).
  2. Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann Intern Med. 109 (2), 127-142 (1988).
  3. De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. Neutrophil migration in infection and wound repair: Going forward in reverse. Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).
  4. Herrera-Uribe, J., et al. Integrative profiling of gene expression and chromatin accessibility elucidates specific transcriptional networks in porcine neutrophils. Front Genet. 14, 1107462 (2023).
  5. Kipnis, E. Neutrophils in sepsis: Battle of the bands. Crit Care Med. 41 (3), 925-926 (2013).
  6. Kong, Y., et al. Sepsis-induced thymic atrophy is associated with defects in early lymphopoiesis. Stem Cells. 34 (12), 2902-2915 (2016).
  7. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: Selling cytokines by the pound. Adv Immunol. 73, 369-509 (1999).
  8. Tecchio, C., Cassatella, M. A. Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis. Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).
  9. Newburger, P. E. Autoimmune and other acquired neutropenias. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 38-42 (2016).
  10. Skokowa, J., Dale, D. C., Touw, I. P., Zeidler, C., Welte, K. Severe congenital neutropenias. Nat Rev Dis Primers. 3, 17032 (2017).
  11. Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. The neutrophil. Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).
  12. Wang, B., et al. Sepsis induces non-classic innate immune memory in neutrophils. Cell Rep. 42 (9), 113044 (2023).
  13. Dinauer, M. C. Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 43-50 (2016).
  14. Shaul, M. E., Fridlender, Z. G. Tumour-associated neutrophils in patients with cancer. Nat Rev Clin Oncol. 16 (10), 601-620 (2019).
  15. Hong, C. W. Current understanding in neutrophil differentiation and heterogeneity. Immune Netw. 17 (5), 298-306 (2017).
  16. Carvalho, L. O., Aquino, E. N., Neves, A. C., Fontes, W. The neutrophil nucleus and its role in neutrophilic function. J Cell Biochem. 116 (9), 1831-1836 (2015).
  17. Tamassia, N., et al. Cutting edge: An inactive chromatin configuration at the il-10 locus in human neutrophils. J Immunol. 190 (5), 1921-1925 (2013).
  18. Shiraishi, K., et al. Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate. Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).
  19. Chang, C. C., Sun, J. T., Chu, F. Y. Bacterial sepsis, neutrophils and intracellular organisms. QJM. 110 (6), 393-394 (2017).
  20. Walling, B. L., Murphy, P. M. Protean regulation of leukocyte function by nuclear lamins. Trends Immunol. 42 (4), 323-335 (2021).
  21. Sollberger, G., Tilley, D. O., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: The biology of chromatin externalization. Dev Cell. 44 (5), 542-553 (2018).
  22. Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. Chromatin accessibility and the regulatory epigenome. Nat Rev Genet. 20 (4), 207-220 (2019).
  23. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  24. Khoyratty, T. E., et al. Distinct transcription factor networks control neutrophil-driven inflammation. Nat Immunol. 22 (9), 1093-1106 (2021).
  25. Fischer, J., et al. Safeguard function of pu.1 shapes the inflammatory epigenome of neutrophils. Nat Immunol. 20 (5), 546-558 (2019).
  26. Ram-Mohan, N., et al. Profiling chromatin accessibility responses in human neutrophils with sensitive pathogen detection. Life Sci Alliance. 4 (8), e202000976 (2021).
  27. Wei, L., et al. Integrative analysis of single-cell rna-seq and atac-seq data across treatment time points in pediatric AML. Blood. 136 (1), 29 (2020).
  28. Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).
  29. Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H20 reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
  30. Orchard, P., Kyono, Y., Hensley, J., Kitzman, J. O., Parker, S. C. J. Quantification, dynamic visualization, and validation of bias in ATAC-seq data with ataqv. Cell Syst. 10 (3), 298-306.e4 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

ATAC seq

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved