Murin Kemik İliği Kaynaklı Nötrofillerin ATAC-Seq Kütüphanesi Hazırlanması

Özet

Bu el yazması, optimal nötrofil canlılığını ve yüksek kütüphane kalitesini garanti etmeyi amaçlayan, murin kemik iliğinden nötrofillerden oluşan bir ATAC-seq kütüphanesi hazırlamak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. BMC hazırlama, immünomanyetik sıralama ve kütüphane yapımı hakkında adım adım talimatlar sunarak, özellikle nötrofilleri incelemeye yeni başlayanlar için değerli bir rehber görevi görür.

Özet

Dizileme ile Transpozaz Erişilebilir Kromatin Testi (ATAC-seq), kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek ve epigenomik regülasyonu anlamak için güçlü, yüksek verimli bir tekniktir. İmmün yanıtlarda çok önemli bir lökosit türü olan nötrofiller, farklılaşma ve aktivasyon sırasında önemli kromatin mimari değişikliklerine uğrar ve bu da işlevleri için gerekli gen ekspresyonunu önemli ölçüde etkiler. ATAC-seq, nötrofil olgunlaşmasında anahtar transkripsiyon faktörlerini ortaya çıkarmada, patojene özgü epigenomik imzaları ortaya çıkarmada ve otoimmün hastalıklar için terapötik hedefleri belirlemede etkili olmuştur. Bununla birlikte, nötrofillerin dış ortama duyarlılığı, yüksek kaliteli ATAC-seq veri üretimini zorlaştırır. Burada, kemirgen kemik iliği türevi nötrofillerden ATAC-seq kütüphaneleri hazırlamak için, optimum hücre canlılığı ve yüksek kaliteli kütüphaneler sağlamak için geliştirilmiş immünomanyetik ayırma özelliğine sahip ölçeklenebilir bir protokol öneriyoruz. Kütüphane kalitesini etkileyen hayati unsurlar ve metodolojik genişleme için optimizasyon ilkeleri ayrıntılı olarak tartışılmaktadır. Bu protokol, nötrofillerin kromatin mimarisini ve epigenomik yeniden programlamasını incelemek, temel ve klinik immünoloji alanındaki çalışmaları ilerletmek isteyen araştırmacıları destekleyecektir.

Giriş

Nötrofiller, omurgalılarda en bol bulunan ve en önemli bağışıklık hücresi tiplerinden biridir ve insan lökositlerinin %50-70'ini oluşturur¹. Nötrofiller, konakçılardaki mikroorganizmaların tespit edilmesinde ve ortadan kaldırılmasında merkezi bir rol oynar. Sepsis sırasında, olgun nötrofiller ilk yanıt verenler arasındadır². Kemotaksis³ yoluyla enfeksiyon bölgelerine hızla harekete geçerler, burada mikroorganizmaları yutarak (fagositoz), NADPH oksidaza bağımlı reaktif oksijen türleri üreterek (solunum patlamaları), granüller salgılayarak (degranülasyon) ve iltihap bölgesine vardıklarında hücre dışı bakterileri yakalayan ve öldüren nötrofil hücre dışı tuzaklar (NET'ler) oluştururlar⁴. Olgunlaşmamış nötrofiller ayrıca kemokinler ^5,6 tarafından kemik iliğinden periferik dolaşıma hızla mobilize edilir. Enfeksiyöz bölgeye çekilen bu nötrofiller ayrıca hematopoez, anjiyogenez ve yara iyileşmesi gibi çeşitli fizyolojik süreçlerde yer alan sitokinleri de serbest bırakır ^7,8. Nötrofil sayısının azalmasına neden olan konjenital veya edinsel hastalıklardan muzdarip hastalar enfeksiyonlara daha duyarlıdır ^9,10. Bununla birlikte, nötrofil aktivasyonu iki ucu keskin bir kılıçtır. Aşırı aktivasyon ve sitokin salınımı doku ve organ hasarına neden olabilir ve enfeksiyonlar derhal kontrol edilmezse çoklu organ fonksiyon bozukluğuna yol açabilir ^11,12. Ek olarak, nötrofiller ayrıca çeşitli enflamatuar ve otoimmün hastalıklara katkıda bulunur ve kanserin ilerlemesini ve metastazı etkileyebilir^13,14. Bu, etkili bağışıklık tepkisini dengelemek ve konakçıya zarar gelmesini önlemek için nötrofil aktivitesinin düzenlenmesini inceleme ihtiyacının altını çizmektedir.

Nötrofillerde, kromatin mimarisi, farklılaşmalarında, göçlerinde ve aktivasyonlarında belirgin ve dinamik değişikliklere uğrar ve hücresel yaşam süresi boyunca çok önemli düzenleyici roller oynar. Miyeloblastların büyük, yuvarlak, ökromatin açısından zengin çekirdeğinden, miyelositlerde ve metamiyelositlerde daha girintili bir çekirdeğe ve daha sonra C veya S şeklinde bir bant içi hücrelere ve polimorfonükleer nötrofillerde yoğun şekilde paketlenmiş kromatin ile yüksek oranda lobüle edilmiş^{bu yolculuk 15,16}, nötrofil biyolojisinin karmaşıklığının bir kanıtıdır. Özel kromatin konfigürasyonu, granül üretiminde yer alanlar ve etkili patojen eliminasyonu için gerekli olan hızlı transkripsiyonel yanıtlar gibi nötrofil fonksiyonu için gerekli olan genlerin seçici ekspresyonunu sağlar¹⁷. Nötrofiller kemotaksis yoluyla enflamatuar bölgelere mobilize edildiğinde, transendotelyal göç, nükleoskeleton / hücre iskeleti kompleksi bağlayıcı (LINC) kompleksi üzerinde baskı uygulayarak kromatinin yeniden şekillenmesine ve daha fazla aktivasyon potansiyeline^{neden olur 18}. Sepsiste, aktive edilmiş nötrofiller, iki loblu veya lobsuz çekirdekler ve önemli ölçüde daha gevşek kromatin yoğunlaşması gibi anormal kromatin morfolojisi ile bir "nükleer-sola kayma" sergiler¹⁹. Bu, enflamatuar yanıtla ilişkili gen bölgelerinde erişilebilirliğin artmasına neden olur ve böylece bu genlerin önemli ölçüde ekspresyonunu indükler. Enfeksiyonlar gerektiği gibi kontrol edilmezse, NET'leri oluşturmak için histon sitrülinasyonu ve ardından kromatin dekonstrüksiyonu gereklidir^20,21. Bu nedenle, nötrofil kromatin mimarisini anlamak, nötrofil biyolojisini ilerletmek ve inflamatuar ve otoimmün hastalıklar için tedaviler geliştirmek için çok önemlidir ve gelecekteki hastalık tedavisi için umut verir.

Kromatin erişilebilirliği, epigenomik düzeyde kromatin mimarisi için bir metrik görevi görür. Genomik bölgelerin güçlendiriciler, destekleyiciler, yalıtkanlar ve kromatin bağlayıcı faktörler için fiziksel olarak nasıl izin verildiğini ve bu elementlerin gen ekspresyonunu nasıl etkilediğini gösterir²². Dizileme ile transpozaz erişilebilir kromatin testi (ATAC-seq), genom²³ boyunca kromatin erişilebilirliğini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Düzenleyici unsurlar hakkında önceden bilgi gerektirmez, bu da onu epigenetik araştırmalar için güçlü bir araç haline getirir. Bu yöntem, numunelerin çekirdeklerinin izole edilmesini, genomik DNA'nın transpozaz Tn5 ile parçalanmasını ve kütüphane hazırlama, dizileme ve veri analizi için dizileme primerlerinin eklenmesini içerir²³. ATAC-seq, nükleozom haritalama, transkripsiyon faktörü bağlanma analizi, çeşitli hücre tiplerinde veya hastalıklarda düzenleyici mekanizmalar, yeni güçlendirici tanımlama, biyobelirteç keşfi vb.^{çalışmalarda etkili olmuştur 22,23}. Gen ekspresyonunun kapsamlı bir analizi için genellikle RNA dizilimi gibi diğer tekniklerle birleştirilir.

ATAC-seq, sağlık ve hastalıkta kesin epigenetik mekanizmaları ortaya çıkararak nötrofil biyolojisi hakkındaki bilgimizi geliştirmiştir. Nötrofil olgunlaşması ve efektör yanıtlarında^24,25 birkaç anahtar transkripsiyon faktörünü (yani RUNX1, KLF6, PU.1, vb.) ortaya çıkarmış, sepsis^26'da biyobelirteç potansiyeline sahip patojene özgü imzaları ortaya çıkarmış, doğuştan gelen bağışıklık hafızasının¹² epigenomik mekanizmalarını aydınlatmış ve pediatrik akut miyeloid lösemide (AML) terapötik hedefleri ^{tanımlamıştır27}. Bununla birlikte, immün sürveyansta önemli bir hücresel bileşen olarak, nötrofiller dış ortamlarına karşı yüksek hassasiyet gösterirler ve bu nedenle yüksek kaliteli ATAC-seq verileri üretmek için bir zorluk oluştururlar. Fizyolojik koşullar altında, insan nötrofillerinin medyan yarılanma ömrünün 3.8 gün olduğu, fare nötrofillerinin ortalama yarılanma ömrünün ise 12.5 saat olduğu bildirilmektedir. İn vitro olarak incelendiğinde yarılanma ömürlerinin önemli ölçüde daha kısa olması dikkat çekicidir ^28,29. İzole nötrofillerin in vitro çalışması sırasında, mikroorganizmalara veya patojenle ilişkili moleküler modellere (PAMP'ler) maruz kalmanın yanı sıra gereksiz deneysel prosedürler ve zorlu işlemler, apoptoz veya NETosis nedeniyle anormal nötrofil aktivasyonuna ve hücresel canlılığın azalmasına neden olabilir. Ölen hücreler genellikle Tn5'e oldukça duyarlı olan önemli miktarda kromatinleşmemiş DNA barındırır ve sonuç olarak ATAC-seq^23'ün arka plan gürültüsünü yükseltir.

Burada, kemirgen kemik iliği örneklerinden türetilen nötrofiller için optimize edilmiş ATAC-seq kütüphanelerini hazırlamak için ölçeklenebilir bir protokol öneriyoruz. Şekil 1 , nötrofillerin kemik iliğinden immünomanyetik olarak ayrılmasını ve ardından ATAC-seq'i kapsayan protokolün grafiksel bir genel bakışını sunmaktadır. Geliştirilmiş immünomanyetik sınıflandırma, ATAC-seq kütüphanesi için çekirdeği çıkarmadan önce nötrofillerin optimal canlılığını garanti eder, böylece kütüphanelerin yüksek kalitesini sağlar ve şemaya ek nötrofil değerlendirmelerinin dahil edilmesini kolaylaştırır. Bu protokolün uygulanması, araştırmacılara çeşitli mikro-çevresel zorluklara maruz kaldıklarında nötrofillerin kromatin mimarisini, özelliklerini ve epigenomik yeniden programlama mekanizmalarını anlamalarında yardımcı olacaktır. Bunun temel ve klinik immünoloji çalışmalarında geniş uygulama alanlarına sahip olması beklenmektedir.

Protokol

Aşağıda sunulan tüm hayvan prosedürleri, Pekin, Çin'deki Başkent Tıp Üniversitesi Hayvan Bakımı Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylanan ulusal etik ve hayvan refahı yönergelerine ve düzenlemelerine uygundur (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. Kemik iliği hücresi (BMC) süspansiyonlarının hazırlanması

1. 19-21 g ağırlığında 6-8 haftalık erkek C57BL/6J fareleri seçin. Fareleri bir CO₂ odası kullanarak ötenazi yapın, ardından derin refleks kaybolduktan sonra servikal çıkık yapın. Bir diseksiyon matı üzerinde% 70 etanol spreyi ile dezenfekte edin.
2. Femuru kalça eklemi ve tibiadan dikkatlice ayırmak için küçük makas ve forseps kullanın, bağlı cildi ve iskelet kasını çıkarın ve femuru 10 cm'lik bir Petri kabında soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.
3. Femurun epifizlerini kesin, 2 mL'lik bir şırıngaya bağlı 28 G'lik bir iğneyi ilik boşluğuna nazikçe sokun ve kemik iliğini% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren soğuk PBS ile yıkayın.
4. Kızarmış koyu kırmızı sıvı yarı saydam hale gelene kadar önceki adımı tekrarlayın. Genellikle üç yıkama gereklidir.
   NOT: Optimum hücre edinimini sağlamak için iğneyi kemik iliği boşluğuna çok derine sokmaktan kaçının.
5. Hücre süspansiyonunu floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tüpüne (5 mL) filtrelemek için 70 μm'lik bir hücre süzgeci kullanın.
6. BMC'lerdeki eritrositleri poliformaldehit içermeyen ticari bir eritrosit lizis tamponu ile parçalayın.
   1. Tüpü 25 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, altta yaklaşık 100 μL sıvı bırakarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve peleti gevşetmek için tüpe hafifçe vurun.
   2. Eritrosit lizis tamponundan (10x) seyreltilmiş 2 mL lizis tamponu ekleyin ve tüpü üç kez ters çevirerek karıştırın. Daha sonra, tüpü 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı atın ve hafifçe vurarak hücre peletini yeniden süspanse edin.
   3. Hücreleri %10 FBS içeren RPMI 1640 ortamı ile iki kez yıkayın ve 2 mL'lik bir hacimde yeniden süspanse edin.
      NOT: Dağılmamış hücre kümeleriyle uğraşırken, hücre süspansiyonlarını 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirmek yerine bunları ayırmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanılması önerilir. Bu yöntem hücre kaybını azaltabilir.
7. Tripan mavisi boyama ile numune başına hücresel canlılığı ve toplam canlı hücre sayısını hesaplayın.

2. Nötrofillerin anti-Ly6G manyetik boncuklarla immünomanyetik etiketlenmesi

1. Kemik iliği hücrelerini (fare başına ~ 2 x 10,⁷ canlı hücre)% 10 FBS içeren 2 mL RPMI 1640 ortamında yeniden süspanse edin ve 25 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: ATAC-seq için 1 x^{10 5} hücrenin sınırlı gereksinimi göz önüne alındığında, fazla nötrofiller ek epigenomik analizler (örneğin, ChIP-seq ve Hi-C) veya bağışıklık fonksiyonu değerlendirmeleri (örneğin, sitokin üretimi, fagositoz ve NET'ler) için tahsis edilebilir.
2. Süpernatantın çoğunu aspire edin, geride yaklaşık 100 μL bırakın ve peleti gevşetmek için tüpe hafifçe vurun.
3. 30 μL Ly6G boncuk ekleyin ve hafifçe vurarak BMC'lerle karıştırın.
   NOT: Manyetik boncuklar kullanımdan önce en az 10 saniye girdaplanmalıdır. Boncukların BMC'lere eklenmesini takiben, girdaplaşmadan kaçınılması önerilir.
4. Tüpü 25 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
5. Boncukları ve hücreleri yeniden süspanse etmek için 2 mL PBS ekleyin, ardından 25 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin.
6. Süpernatantın çoğunu aspire edin, geride yaklaşık 100 μL bırakın ve peleti gevşetmek için tüpe hafifçe vurun. 1 mL'lik son hacim için ek PBS ekleyin.
   NOT: Dağılmamış hücre kümeleriyle uğraşırken, hücre süspansiyonlarını 70 μm'lik bir hücre süzgecinden geçirmek yerine bunları ayırmak için 200 μL'lik bir pipet ucu kullanılması önerilir. Bu yöntem hücre kaybını azaltabilir.

3. İmmünomanyetik hücre ayırma ile nötrofil ayırma

1. MS kolonunu PBS ile ön işlemden geçirin.
   1. MS sütununu uyumlu bir manyetik ile etkinleştirilen hücre sıralama (MACS) ayırıcısının manyetik alanı içine yerleştirin. MS kolonundan boşalan sıvının altına boş bir 5 mL tüp yerleştirin.
   2. Kolonu 500 μL PBS ile durulayın. PBS'nin MS sütununa tam akışı sağlandıktan sonra bu adımı tekrarlayın.
      NOT: PBS'nin, MS sütunu aracılığıyla 5 mL floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS) tüpüne kademeli olarak, damla damla akmasına izin verilmelidir. Hava kabarcıkları sütunu tıkayabileceğinden, sütuna hava girmediğinden emin olun.
2. Manyetik olarak etiketlenmiş BMC süspansiyonunu, bir seferde 500 μL ekleyerek MS kolonuna uygulayın ve kolon rezervuarı boşaldığında hemen yeniden doldurun.
   NOT: Hücre süspansiyonlarının hücre kütlesinden yoksun olduğundan emin olun. Gerekirse, bu aşamadan önce etiketlenmemiş hücreleri (örn. monositler ve lenfositler) toplamak için MS kolonunun altına yeni bir 5 mL FACS tüpü yerleştirin.
   NOT: Damlacık akış hızına dikkat edin. Yavaş bir akış hızı, sıralama sütununun engellendiğini gösterebilir.
3. Rezervuar her boşaldığında 500 μL PBS ekleyerek MS kolonunu yıkayın ve bu işlemi iki kez tekrarlayın.
   NOT: PBS'nin erken eklenmesi, belirli hücrelerin sıralama sütununa girişini engelleyebilir ve potansiyel olarak hücre sıralamasının saflığını tehlikeye atabilir.
4. Manyetik olarak etiketlenmiş nötrofilleri toplayın.
   1. Kolon rezervuarı tükendiğinde, kolonu manyetik alandan çıkarın ve dikkatlice 5 mL'lik bir tüpe yerleştirin.
      NOT: Kolonu çıkarmadan önce, işlem sırasında damlacık deşarjı nedeniyle nötrofil kaybını önlemek için içinde sıvı kalmadığından emin olun. Kolondaki kalıntı bir pipet kullanılarak çıkarılabilir.
   2. Kolona 2 mL PBS dağıtın, ardından manyetik olarak etiketlenmiş nötrofilleri dışarı atmak için pistonu hemen ve sıkıca kolona itin.
      NOT: Yeterli nötrofil elde etmek için yeterli elüsyon hacmini sağlayın ve pistonu kolona iterken kısa kalın.
5. İzole edilmiş hücreleri numaralandırmak için bir hemositometre kullanın. İzole edilen nötrofillerin saflığını, sıralama sonrası hücre süspansiyonunun 100 μL'sini alarak ve akış sitometrisi ile analiz ederek tanımlayın.

4. Çekirdek ekstraksiyonu

1. Nötrofilleri içeren 50.000 tek hücreli süspansiyonu 500 x g'da 5 ° C'de 5 dakika boyunca 0.2 mL'lik bir tüpte santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın.
2. Nötrofilleri 50 μL önceden soğutulmuş Lizis tamponunda yeniden süspanse edin ( Tablo 1'e bakın), çözeltiyi bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.
   NOT: Numune hacmi 5 μL'den azsa, Lysis tamponunun doğrudan eklenmesine izin verilir. Hücre süspansiyon konsantrasyonu 1 x 10⁷ hücre / mL'yi geçmez.
3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın ve çekirdeği toplayın. Sonraki prosedürlere başlamadan önce tüpü buzun üzerine yerleştirin.
   NOT: Numune kaybını en aza indirmek için, tüp duvarının peletlerin biriktiği tarafını belirtin ve süpernatanı çıkarırken sıvıyı karşı taraftan nazikçe aspire edin.

5. Transpozaz ile nükleozoma bağlı etiketleme

1. Tn5 transpozaz içeren Tagmentasyon Reaksiyonu Karışımını bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpünde DNA Kütüphanesi Hazırlık kitinin yönergelerine göre hazırlayın ( Tablo 2'ye bakın) ve soğutulmuş amplikon saflaştırma boncuklarını 25 ° C'de en az 30 dakika önceden ısıtın.
2. Nötrofil çekirdeğini 50 μL etiketleme reaksiyon karışımı ile yeniden süspanse edin ve bir pipetle hafifçe çalkalayın, ardından el tipi bir santrifüj (~ 2600 x g) kullanarak 5 saniye santrifüjleyin.
3. Reaksiyon tüpünü bir PCR cihazında 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
4. Lizata 100 μL önceden girdaplanmış amplikon saflaştırma boncukları ekleyin, ardından manyetik boncukları 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek çözelti içinde iyice karıştırın.
   NOT: Manyetik boncuklar yapışkandır ve pipet uçlarına kolayca takılabilir, bu nedenle boncukları aktarırken doğru hacmi aspire ettiğinizden ve bunları uçlardan yavaşça dağıttığınızdan emin olun.
5. Reaksiyon tüpünü 25 ° C'de 5 dakika inkübe edin, ardından el tipi bir santrifüj (~ 2600 × g) ile 5 saniye santrifüjleyin.
6. Reaksiyon tüpünü çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) manyetik bir rafa yerleştirerek kesintiye uğrayan DNA parçasını saflaştırın. Ardından, manyetik boncukları bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
7. Manyetik boncuğu her seferinde 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ile yıkayın ve reaksiyon tüpünü manyetik rafta 30 saniye tutun. Etanol eklerken boncukları rahatsız etmekten kaçının. Adım 5.7'de açıklanan prosedürü tekrarlayın.
8. Reaksiyon tüpünü el tipi bir santrifüjle (yaklaşık 2600 × g) santrifüjleyin, etanolü 10 μL pipet uçlarıyla aspire edin, ardından kapağı açarken manyetik boncukları 3-5 dakika kurutun.
   NOT: Manyetik boncuklar için kurutma süreleri, nem seviyelerindeki farklılıklar nedeniyle farklı bölgeler arasında değişebilir. Boncuklar parlaklıklarını kaybedene kadar kurutulmalıdır. Aşırı kurutma, elüsyon sürecini zorlaştırabilirken, yetersiz kurutma, sonraki deneyleri etkileyen alkol kalıntısının varlığına neden olabilir. Ek olarak, manyetik rafın yatay olarak konumlandırılması, manyetik boncukların düzgün bir şekilde kurutulması için daha elverişlidir.
9. Reaksiyon tüpünü manyetik raftan çıkardıktan sonra, manyetik boncukları kaplamak için 26 μL ddH_2Oekleyin, iyice karıştırmayı sağlamak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra 25 °C'de 2 dakika inkübe edin.
   NOT: Manyetik boncuklar aşırı kurutulursa inkübasyon süresini uygun şekilde uzatın.
10. Reaksiyon tüpünü el tipi bir santrifüjle (yaklaşık 2600 × g) kısaca santrifüjleyin ve çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) manyetik bir raf kullanarak manyetik boncukları ayırın.
11. 24 μL süpernatanı dikkatlice yeni PCR tüpüne aktarın.

6. Yeni nesil dizileme (NGS) için kütüphane inşaatı

1. PCR Reaksiyon Karışımını, saflaştırılmış DNA parçaları ve dizileme adaptörleri içeren primerler kullanarak sterilize edilmiş bir tüpte hazırlayın (bkz. Tablo 3).
2. PCR reaksiyonunu önerilen prosedürleri izleyerek gerçekleştirin ( Tablo 4'e bakın), tipik olarak yaklaşık 1 saat gerektirir.
   NOT: Bu prosedürden sonra deney geçici olarak durdurulabilir ve PCR ürünleri -20 °C'de veya en az 2 hafta saklanabilir.
3. 50 μL PCR ürününe 27,5 μL önceden girdaplanmış amplikon saflaştırma boncuğu ekleyin, ardından manyetik boncukları 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek çözelti içinde iyice karıştırın.
   NOT: Manyetik boncukların PCR ürünlerine yanlış oranı, sıralanan parçaların uzunluklarında tutarsızlıklara neden olabilir. PCR ürününün buharlaşan hacmini 50 μL'ye doldurmak için ddH_2Okullanın. Doğru hacimde manyetik boncukları aspire ettiğinizden emin olun ve takılabilecek boncukları en aza indirmek için bunları pipet uçlarından yavaşça dağıtın.
4. Reaksiyon tüpünü 25 °C'de 5 dakika inkübe edin, ardından el tipi bir santrifüj (yaklaşık 2600 x g) ile 5 saniye santrifüjleyin.
5. Çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) reaksiyon tüpünü manyetik bir rafa yerleştirerek kütüphane DNA'sını saflaştırın. Ardından, süpernatanı dikkatlice yeni bir sterilize edilmiş PCR tüpüne aktarın ve manyetik boncukları atın.
6. Süpernatanıma 50 μl önceden girdaplanmış amplikon saflaştırma boncukları ekleyin, ardından manyetik boncukları 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek çözelti içinde iyice karıştırın.
7. Reaksiyon tüpünü 25 °C'de 5 dakika inkübe edin, ardından el tipi bir santrifüj (yaklaşık 2600 x g) ile 5 saniye santrifüjleyin.
8. Reaksiyon tüpünü, çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) manyetik bir rafa yerleştirin, ardından manyetik boncukları bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın.
9. Manyetik boncuğu her seferinde 200 μL taze hazırlanmış% 80 etanol ile iki kez yıkayın ve reaksiyon tüpünü manyetik rafta 30 saniye tutun. Etanol eklerken boncukları rahatsız etmekten kaçının.
10. Kapağı açarken manyetik boncukları 5 dakika kurutun.
11. Reaksiyon tüpünü manyetik raftan çıkardıktan sonra, manyetik boncukları kaplamak için 22 μL ddH_2Oekleyin, iyice karıştırmayı sağlamak için 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra 25 °C'de 5 dakika inkübe edin.
12. Reaksiyon tüpünü el tipi bir santrifüjle (yaklaşık 2600 × g) kısaca santrifüjleyin ve çözelti berraklaşana kadar (yaklaşık 5 dakika) manyetik boncukları manyetik bir raf kullanarak ayırın.
13. 20 μL'lik süpernatanı dikkatlice yeni bir sterilize edilmiş PCR tüpüne aktarın ve -20 °C'de saklayın.
    NOT: Daha konsantre bir uzunluk dağılımına sahip bir kitaplık elde etmek için, güçlendirilmiş ürünü sıralamak için bir jel geri kazanım kiti kullanmayı düşünün. Alternatif olarak, uzunluk dağıtım aralığı için özel bir gereklilik yoksa, amplifiye edilmiş ürün, uzunluk sıralaması yapılmadan bir manyetik boncuk veya kolon saflaştırma kiti kullanılarak doğrudan saflaştırılabilir.

7. Kütüphane kalite kontrolü ve sıralaması

1. Kütüphane DNA'sının uzunluk dağılımını değerlendirmek için DNA fragmanı analiz platformlarını kullanın.
2. Kalite denetiminden geçen kütüphanelerde yüksek verimli sıralama yapmak için NGS platformlarını kullanın.

Sonuçlar

Ana hatlarıyla belirtilen protokol, nötrofilleri C57BL / 6 farelerinin kemik iliğinden izole etmek ve ATAC-seq yoluyla kromatin erişilebilirliği öncesi ve sonrası lipopolisakkarit (LPS) stimülasyonundaki ilgili varyanslarını karşılaştırmak için kullanıldı. Tipik olarak, 6-8 haftalık bir C57BL / 6 farenin her iki uyluk kemiğinden 2 x 10⁷ BMC toplanabilir ve daha sonra 2-5 x 10⁶ nötrofil izole edilebilir. Bunlar arasında, ATAC-seq için 1 x 10

Tartışmalar

Bu el yazması, kemirgen kemik iliği örneklerinden türetilen nötrofiller için optimize edilmiş ATAC-seq kütüphanelerinin hazırlanması için deneysel bir protokol bildirmektedir. Nötrofillerin oldukça duyarlı ve kolayca aktive edilmiş bağışıklık hücreleri olması nedeniyle, optimizasyon çabaları izole nötrofillerin canlılığını korumaya öncelik verdi. Yanlış tedavi, NETosis ve diğer hücre ölümü biçimlerine yol açarak önemli miktarlarda kromatinize edi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan Blue	Scientific	T10282
1x phosphate-buffered saline	Biosharp	BL302A
20 bp–5000 bp Alignment marker	Bioptic	C109102-100A	DNA fragment analyzer supporting products
5k Size marker(Standard 50 bp Ladder)	Bioptic	C109101-100A	DNA fragment analyzer supporting products
Amplicons Purification Beads	Beckman	A63881	Amplicons Purification Beads is a nucleic acid purification kit for obtaining high quality DNA products.
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, mouse	miltenyi	130-120-337	The Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, mouse were developed for positive selection or depletion of mouse neutrophils from single-cell suspensions of mouse bone marrow.
Anti-mouse CD11b-BV605 (1:200)	BD	Cat#563015
Anti-mouse CD48-PE-Cy7 (1:400)	BD	Cat#560731
Anti-mouse Ly6G-BV510 (1:200)	BD	Cat#740157
C57BL/6J mice, wild type, 8-week-old, male	The Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences	The Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences
DNA Separation Buffer	Bioptic	C104406	DNA fragment analyzer supporting products
E. coli derived ultrapure LPS (serotype0111: B4)	Sigma-Aldrich	Cat#L-2630
DNA Quantitative Reagent	vazyme	EQ111	DNA Quantitative Reagentt is a simple, sensitive and accurate double-stranded DNA (dsDNA) fluorescence quantitative assay kit.
Erythrocyte lysis buffer (10x)	BioLegend	Cat#420301
Fetal bovine serum	Gibco	Cat#10099141C
MS Separation columns	miltenyi	130-042-201	MS Columns are designed for positive selection of cells.
RPMI 1640 medium	Gibco	C11875500BT
S2 Gel electrophoresis needle	Bioptic	C105101	DNA fragment analyzer supporting products
Surgical instruments: scalpel, dissection scissors, microdissection scissors, fine forceps, blunt anatomical forceps, needle holder	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools	Can be purchased from other qualified suppliers
Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464	Can be purchased from other qualified suppliers
TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina	vazyme	TD501-01	TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina is a purpose-built kit specifically developed for Illumina's high-throughput sequencing platform. Using the kit, DNA can be prepared into sequencing libraries dedicated to Illumina's high-throughput sequencing platform.
TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina	vazyme	TD202	TruePrep Index Kit V2 for Illumina is a Kit for the TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina. It can be used to prepare 96 different double-ended Index libraries.