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Method Article
Ce manuscrit décrit un protocole pour la préparation d’une banque ATAC-seq de neutrophiles à partir de moelle osseuse murine, visant à garantir une viabilité optimale des neutrophiles et une qualité de bibliothèque élevée. Il offre des instructions étape par étape sur la préparation des BMC, le tri immunomagnétique et la construction de bibliothèques, servant de guide précieux, en particulier pour les nouveaux venus dans l’étude des neutrophiles.
Le dosage de la chromatine accessible à la transposase avec séquençage (ATAC-seq) est une technique puissante et à haut débit pour évaluer l’accessibilité de la chromatine et comprendre la régulation épigénomique. Les neutrophiles, en tant que type de leucocyte crucial dans les réponses immunitaires, subissent des modifications architecturales substantielles de la chromatine au cours de la différenciation et de l’activation, ce qui a un impact significatif sur l’expression des gènes nécessaires à leurs fonctions. L’ATAC-seq a joué un rôle déterminant dans la découverte de facteurs de transcription clés dans la maturation des neutrophiles, la révélation de signatures épigénomiques spécifiques aux agents pathogènes et l’identification de cibles thérapeutiques pour les maladies auto-immunes. Cependant, la sensibilité des neutrophiles au milieu externe complique la production de données ATAC-seq de haute qualité. Ici, nous proposons un protocole évolutif pour la préparation de banques ATAC-seq à partir de neutrophiles dérivés de la moelle osseuse de rongeurs, avec une séparation immunomagnétique améliorée pour assurer une viabilité cellulaire optimale et des banques de haute qualité. Les éléments vitaux ayant un impact sur la qualité de la bibliothèque et les principes d’optimisation pour l’extension méthodologique sont discutés en détail. Ce protocole soutiendra les chercheurs qui souhaitent étudier l’architecture de la chromatine et la reprogrammation épigénomique des neutrophiles, faisant ainsi progresser les études en immunologie fondamentale et clinique.
Les neutrophiles sont l’un des types de cellules immunitaires les plus abondants et les plus cruciaux chez les vertébrés, constituant 50 à 70 % des leucocytes humains1. Les neutrophiles jouent un rôle central dans la détection et l’élimination des micro-organismes chez les hôtes. Lors du sepsis, les neutrophiles matures sont parmi les premiers intervenants2. Ils se mobilisent rapidement vers les sites d’infection via la chimiotaxie3, où ils combattent les agents pathogènes en ingérant des micro-organismes (phagocytose), en produisant des espèces réactives de l’oxygène dépendantes de la NADPH oxydase (sursauts respiratoires), en sécrétant des granules (dégranulation) et en formant des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) qui attrapent et tuent les bactéries extracellulaires une fois qu’elles arrivent au site d’inflammation4. Les neutrophiles immatures sont également rapidement mobilisés de la moelle osseuse dans la circulation périphérique par les chimiokines 5,6. Ces neutrophiles attirés par le site infectieux libèrent également des cytokines, qui sont impliquées dans plusieurs processus physiologiques, tels que l’hématopoïèse, l’angiogenèse et la cicatrisationdes plaies 7,8. Les patients atteints de maladies congénitales ou acquises qui entraînent une diminution du nombre de neutrophiles sont plus sensibles aux infections 9,10. Cependant, l’activation des neutrophiles est une arme à double tranchant. Une activation excessive et une libération excessive de cytokines peuvent causer des lésions aux tissus et aux organes, entraînant un dysfonctionnement de plusieurs organes si les infections ne sont pas rapidement contrôlées11,12. De plus, les neutrophiles contribuent également à diverses maladies inflammatoires et auto-immunes et peuvent influencer la progression du cancer et les métastases13,14. Cela souligne la nécessité d’étudier la régulation de l’activité des neutrophiles pour équilibrer une réponse immunitaire efficace et prévenir les dommages à l’hôte.
Dans les neutrophiles, l’architecture de la chromatine subit des changements distincts et dynamiques dans leur différenciation, migration et activation, exerçant des rôles régulateurs essentiels tout au long de la vie cellulaire. Ce voyage, du grand noyau rond et riche en euchromatine des myéloblastes à un noyau plus découpé dans les myélocytes et les métamyélocytes, puis à des cellules en bande en forme de C ou de S et fortement lobées avec une chromatine densément tassée dans les neutrophiles polynucléaires15,16, témoigne de la complexité de la biologie des neutrophiles. La configuration spécialisée de la chromatine assure l’expression sélective des gènes essentiels à la fonction des neutrophiles, tels que ceux impliqués dans la production de granules et les réponses transcriptionnelles rapides nécessaires à l’élimination efficace des agents pathogènes17. Lorsque les neutrophiles sont mobilisés vers des sites inflammatoires via la chimiotaxie, la migration transendothéliale exerce une pression sur le complexe de liaison du complexe nucléosquelette/cytosquelette (LINC), provoquant un remodelage de la chromatine et un potentiel d’activation plus élevé18. Dans le sepsis, les neutrophiles activés présentent un « décalage nucléaire-gauche », avec une morphologie anormale de la chromatine, comme des noyaux bilobés ou non lobés et une condensation de la chromatine significativement plus lâche19. Il en résulte une accessibilité accrue dans les régions génétiques associées à la réponse inflammatoire, induisant ainsi une expression significative de ces gènes. Si les infections ne sont pas correctement contrôlées, la citrullination des histones et la déconstruction ultérieure de la chromatine sont nécessaires pour former des TNE20,21. Par conséquent, la compréhension de l’architecture de la chromatine des neutrophiles est cruciale pour faire progresser la biologie des neutrophiles et développer des traitements contre les maladies inflammatoires et auto-immunes, offrant ainsi de l’espoir pour le traitement futur des maladies.
L’accessibilité de la chromatine sert de mesure de l’architecture de la chromatine au niveau épigénomique. Il indique comment les régions génomiques sont physiquement admissibles aux amplificateurs, aux promoteurs, aux isolants et aux facteurs de liaison à la chromatine et comment ces éléments influencent l’expression des gènes22. Le dosage de la chromatine accessible par transposase avec séquençage (ATAC-seq) est une technique largement utilisée pour évaluer l’accessibilité de la chromatine dans le génome23. Il ne nécessite pas de connaissance préalable des éléments régulateurs, ce qui en fait un outil puissant pour la recherche épigénétique. Cette méthode consiste à isoler les noyaux d’échantillons, à fragmenter l’ADN génomique par la transposase Tn5 et à ajouter des amorces de séquençage pour la préparation de la banque, le séquençage et l’analyse des données23. ATAC-seq a joué un rôle déterminant dans l’étude de la cartographie des nucléosomes, de l’analyse de la liaison des facteurs de transcription, des mécanismes de régulation dans divers types de cellules ou maladies, de l’identification de nouveaux amplificateurs, de la découverte de biomarqueurs, etc.22,23. Il est souvent combiné à d’autres techniques, telles que le séquençage de l’ARN, pour une analyse complète de l’expression des gènes.
ATAC-seq a fait progresser nos connaissances sur la biologie des neutrophiles en découvrant des mécanismes épigénétiques précis dans la santé et la maladie. Il a révélé plusieurs facteurs de transcription clés (c’est-à-dire RUNX1, KLF6, PU.1, etc.) dans la maturation des neutrophiles et les réponses effectrices24,25, découvert des signatures spécifiques à l’agent pathogène avec un potentiel de biomarqueur dans le sepsis26, élucidé les mécanismes épigénomiques de la mémoire immunitaire innée12 et identifié des cibles thérapeutiques dans la leucémie myéloïde aiguë (LMA) pédiatrique27. Cependant, en tant que composant cellulaire important dans la surveillance immunitaire, les neutrophiles présentent une grande sensibilité à leur milieu externe et posent donc un défi pour produire des données ATAC-seq de haute qualité. Dans des circonstances physiologiques, la demi-vie médiane des neutrophiles humains est de 3,8 jours, tandis que la demi-vie moyenne des neutrophiles de souris est de 12,5 h. Il convient de noter que leur demi-vie est considérablement plus courte lorsqu’ils sont étudiés in vitro28,29. Lors de l’exploitation in vitro de neutrophiles isolés, l’exposition à des micro-organismes ou à des modèles moléculaires associés à des agents pathogènes (PAMP), ainsi que des procédures expérimentales redondantes et des opérations difficiles, peuvent entraîner une activation aberrante des neutrophiles et une diminution de la viabilité cellulaire due à l’apoptose ou à la NETose. Les cellules décédées abritent généralement des quantités importantes d’ADN non chromatinisé très sensible au Tn5, ce qui augmente par conséquent le bruit de fond de l’ATAC-seq23.
Ici, nous proposons un protocole évolutif pour la préparation de banques ATAC-seq optimisées pour les neutrophiles dérivés d’échantillons de moelle osseuse de rongeurs. La figure 1 présente un aperçu graphique du protocole, qui comprend la séparation immunomagnétique des neutrophiles de la moelle osseuse, suivie de l’ATAC-seq. L’amélioration du tri immunomagnétique garantit la viabilité optimale des neutrophiles avant l’extraction du noyau pour la bibliothèque ATAC-seq, garantissant ainsi la haute qualité des banques et facilitant l’intégration d’évaluations supplémentaires des neutrophiles dans le schéma. La mise en œuvre de ce protocole aidera les chercheurs à comprendre les caractéristiques de l’architecture de la chromatine et les mécanismes de reprogrammation épigénomique des neutrophiles lorsqu’ils sont exposés à divers défis microenvironnementaux. On s’attend à ce que cela ait de vastes applications dans les études d’immunologie fondamentale et clinique.
Toutes les procédures animales présentées ci-dessous étaient conformes aux directives et réglementations nationales en matière d’éthique et de bien-être animal, qui ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche sur les soins aux animaux de la Capital Medical University, Pékin, Chine (sjtkl11-1x-2022(060)).
1. Préparation des suspensions de cellules de moelle osseuse (BMC)
2. Marquage immunomagnétique des neutrophiles avec des billes magnétiques anti-Ly6G
3. Séparation des neutrophiles avec tri cellulaire immunomagnétique
4. Extraction du noyau
5. Marquage attaché aux nucléosomes avec transposase
6. Construction de bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération (NGS)
7. Contrôle de la qualité et séquençage de la bibliothèque
Le protocole décrit a été utilisé pour isoler les neutrophiles de la moelle osseuse de souris C57BL/6 et comparer leur variance respective dans l’accessibilité de la chromatine avant et après la stimulation par lipopolysaccharide (LPS) via ATAC-seq. En règle générale, 2 x 107 BMC peuvent être prélevés sur les deux fémurs d’une souris C57BL/6 âgée de 6 à 8 semaines, et par la suite, 2 à 5 x 106 neutrophiles peuvent être isolés. Parmi elles, 1 x...
Ce manuscrit fait état d’un protocole expérimental de préparation de banques ATAC-seq optimisées pour les neutrophiles dérivés d’échantillons de moelle osseuse de rongeurs. En raison de la grande sensibilité des neutrophiles et de leur capacité à s’activer, les efforts d’optimisation ont donné la priorité au maintien de la viabilité des neutrophiles isolés. Un traitement inapproprié peut entraîner une NETosis et d’autres formes de mort cellulaire, provoquant la ...
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Ce travail a été soutenu par des subventions du programme de R&D de la Commission municipale de l’éducation de Pékin (KZ202010025041) et des Instituts chinois de recherche médicale de Pékin (subvention n° 100). CX24PY29).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.4% Trypan Blue | Scientific | T10282 | |
1x phosphate-buffered saline | Biosharp | BL302A | |
20 bp–5000 bp Alignment marker | Bioptic | C109102-100A | DNA fragment analyzer supporting products |
5k Size marker(Standard 50 bp Ladder) | Bioptic | C109101-100A | DNA fragment analyzer supporting products |
Amplicons Purification Beads | Beckman | A63881 | Amplicons Purification Beads is a nucleic acid purification kit for obtaining high quality DNA products. |
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, mouse | miltenyi | 130-120-337 | The Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, mouse were developed for positive selection or depletion of mouse neutrophils from single-cell suspensions of mouse bone marrow. |
Anti-mouse CD11b-BV605 (1:200) | BD | Cat#563015 | |
Anti-mouse CD48-PE-Cy7 (1:400) | BD | Cat#560731 | |
Anti-mouse Ly6G-BV510 (1:200) | BD | Cat#740157 | |
C57BL/6J mice, wild type, 8-week-old, male | The Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences | The Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences | |
DNA Separation Buffer | Bioptic | C104406 | DNA fragment analyzer supporting products |
E. coli derived ultrapure LPS (serotype0111: B4) | Sigma-Aldrich | Cat#L-2630 | |
DNA Quantitative Reagent | vazyme | EQ111 | DNA Quantitative Reagentt is a simple, sensitive and accurate double-stranded DNA (dsDNA) fluorescence quantitative assay kit. |
Erythrocyte lysis buffer (10x) | BioLegend | Cat#420301 | |
Fetal bovine serum | Gibco | Cat#10099141C | |
MS Separation columns | miltenyi | 130-042-201 | MS Columns are designed for positive selection of cells. |
RPMI 1640 medium | Gibco | C11875500BT | |
S2 Gel electrophoresis needle | Bioptic | C105101 | DNA fragment analyzer supporting products |
Surgical instruments: scalpel, dissection scissors, microdissection scissors, fine forceps, blunt anatomical forceps, needle holder | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools | Can be purchased from other qualified suppliers |
Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464 | Can be purchased from other qualified suppliers |
TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | vazyme | TD501-01 | TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina is a purpose-built kit specifically developed for Illumina's high-throughput sequencing platform. Using the kit, DNA can be prepared into sequencing libraries dedicated to Illumina's high-throughput sequencing platform. |
TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina | vazyme | TD202 | TruePrep Index Kit V2 for Illumina is a Kit for the TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina. It can be used to prepare 96 different double-ended Index libraries. |
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