Biblioteca ATAC-Seq Preparação de neutrófilos derivados da medula óssea murina

Resumo

Este manuscrito descreve um protocolo para preparar uma biblioteca ATAC-seq de neutrófilos da medula óssea murina, com o objetivo de garantir a viabilidade ideal dos neutrófilos e a alta qualidade da biblioteca. Ele oferece instruções passo a passo sobre a preparação do BMC, classificação imunomagnética e construção de bibliotecas, servindo como um guia valioso, especialmente para iniciantes no estudo de neutrófilos.

Resumo

Ensaio para cromatina acessível por transposase com sequenciamento (ATAC-seq) é uma técnica poderosa e de alto rendimento para avaliar a acessibilidade da cromatina e entender a regulação epigenômica. Os neutrófilos, como um tipo leucocitário crucial nas respostas imunes, sofrem alterações substanciais na arquitetura da cromatina durante a diferenciação e ativação, que afetam significativamente a expressão gênica necessária para suas funções. O ATAC-seq tem sido fundamental na descoberta de fatores-chave de transcrição na maturação de neutrófilos, revelando assinaturas epigenômicas específicas de patógenos e identificando alvos terapêuticos para doenças autoimunes. No entanto, a sensibilidade dos neutrófilos ao meio externo complica a produção de dados ATAC-seq de alta qualidade. Aqui, propomos um protocolo escalável para preparar bibliotecas ATAC-seq a partir de neutrófilos derivados da medula óssea de roedores, apresentando separação imunomagnética aprimorada para garantir a viabilidade celular ideal e bibliotecas de alta qualidade. Os elementos vitais que impactam a qualidade da biblioteca e os princípios de otimização para a extensão metodológica são discutidos em detalhes. Este protocolo apoiará os pesquisadores que desejam estudar a arquitetura da cromatina e a reprogramação epigenômica de neutrófilos, avançando nos estudos em imunologia básica e clínica.

Introdução

Os neutrófilos são um dos tipos de células imunes mais abundantes e cruciais em vertebrados, constituindo 50% a 70% dos leucócitos humanos¹. Os neutrófilos desempenham um papel central na detecção e eliminação de microrganismos nos hospedeiros. Durante a sepse, os neutrófilos maduros estão entre os primeiros a responder². Eles se mobilizam rapidamente para os locais de infecção via quimiotaxia³, onde combatem patógenos ingerindo microrganismos (fagocitose), produzindo espécies reativas de oxigênio dependentes de NADPH oxidase (explosões respiratórias), secretando grânulos (degranulação) e formando armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) que capturam e matam bactérias extracelulares assim que chegam ao local da inflamação⁴. Os neutrófilos imaturos também são rapidamente mobilizados da medula óssea para a circulação periférica por quimiocinas ^5,6. Esses neutrófilos atraídos para o sítio infeccioso também liberam citocinas, que estão envolvidas em vários processos fisiológicos, como hematopoiese, angiogênese e cicatrização de feridas ^7,8. Pacientes acometidos por doenças congênitas ou adquiridas que resultam em diminuição da contagem de neutrófilos são mais suscetíveis a infecções ^9,10. No entanto, a ativação de neutrófilos é uma faca de dois gumes. A ativação excessiva e a liberação de citocinas podem causar danos aos tecidos e órgãos, levando à disfunção de múltiplos órgãos se as infecções não forem prontamente controladas^11,12. Além disso, os neutrófilos também contribuem para várias doenças inflamatórias e autoimunes e podem influenciar a progressão e metástase do câncer^13,14. Isso ressalta a necessidade de estudar a regulação da atividade dos neutrófilos para equilibrar a resposta imune eficaz e prevenir danos ao hospedeiro.

Nos neutrófilos, a arquitetura da cromatina sofre mudanças distintas e dinâmicas em sua diferenciação, migração e ativação, exercendo papéis regulatórios fundamentais ao longo da vida celular. Essa jornada, do núcleo grande, redondo e rico em eucromatina dos mieloblastos para um núcleo mais recuado em mielócitos e metamielócitos e, em seguida, para células em banda em forma de C ou S e altamente lobuladas com cromatina densamente compactada em neutrófilos polimorfonucleares^15,16, é uma prova da complexidade da biologia dos neutrófilos. A configuração especializada da cromatina garante a expressão seletiva de genes essenciais para a função dos neutrófilos, como aqueles envolvidos na produção de grânulos e respostas transcricionais rápidas necessárias para a eliminação eficaz do patógeno¹⁷. Quando os neutrófilos são mobilizados para sítios inflamatórios via quimiotaxia, a migração transendotelial pressiona o complexo ligante do complexo nucleoesqueleto/citoesqueleto (LINC), levando à remodelação da cromatina e maior potencial de ativação¹⁸. Na sepse, os neutrófilos ativados exibem um "desvio nuclear-esquerdo", com morfologia anormal da cromatina, como núcleos bilobados ou não lobados e condensação da cromatina significativamente mais frouxa¹⁹. Isso resulta em maior acessibilidade dentro das regiões gênicas associadas à resposta inflamatória, induzindo assim a expressão significativa desses genes. Se as infecções não forem devidamente controladas, a citrulinação de histonas e a subsequente desconstrução da cromatina são necessárias para formar TNEs^20,21. Portanto, entender a arquitetura da cromatina dos neutrófilos é crucial para o avanço da biologia dos neutrófilos e o desenvolvimento de tratamentos para doenças inflamatórias e autoimunes, oferecendo esperança para o tratamento futuro da doença.

A acessibilidade da cromatina serve como uma métrica para a arquitetura da cromatina no nível epigenômico. Indica como as regiões genômicas são fisicamente permissíveis a intensificadores, promotores, isolantes e fatores de ligação à cromatina e como esses elementos influenciam a expressão gênica²². O ensaio para cromatina acessível por transposase com sequenciamento (ATAC-seq) é uma técnica amplamente utilizada para avaliar a acessibilidade da cromatina em todo o genoma²³. Não requer conhecimento prévio de elementos regulatórios, tornando-se uma ferramenta potente para pesquisas epigenéticas. Este método envolve o isolamento de núcleos de amostras, fragmentação do DNA genômico pela transposase Tn5 e adição de primers de sequenciamento para preparação de bibliotecas, sequenciamento e análise de dados²³. O ATAC-seq tem sido fundamental no estudo do mapeamento de nucleossomos, análise de ligação do fator de transcrição, mecanismos regulatórios em vários tipos de células ou doenças, identificação de novos potenciadores, descoberta de biomarcadores, etc.^22,23. Muitas vezes é combinado com outras técnicas, como sequenciamento de RNA, para uma análise abrangente da expressão gênica.

O ATAC-seq avançou nosso conhecimento da biologia dos neutrófilos, descobrindo mecanismos epigenéticos precisos na saúde e na doença. Ele revelou vários fatores-chave de transcrição (ou seja, RUNX1, KLF6, PU.1, etc.) na maturação de neutrófilos e respostas efetoras^{24 , 25} , descobriu assinaturas específicas de patógenos com potencial de biomarcador na sepse²⁶, elucidou os mecanismos epigenômicos da memória imune inata¹² e identificou alvos terapêuticos na leucemia mielóide aguda pediátrica (LMA) ²⁷. No entanto, como um componente celular proeminente na vigilância imunológica, os neutrófilos exibem alta sensibilidade ao seu meio externo e, portanto, representam um desafio para a produção de dados ATAC-seq de alta qualidade. Em circunstâncias fisiológicas, a meia-vida média dos neutrófilos humanos é de 3,8 dias, enquanto a meia-vida média dos neutrófilos de camundongo é de 12,5 h. Vale ressaltar que sua meia-vida é consideravelmente menor quando estudada in vitro^28,29. Durante a operação in vitro de neutrófilos isolados, a exposição a microrganismos ou padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), bem como procedimentos experimentais redundantes e operações severas, podem resultar em ativação aberrante de neutrófilos e diminuição da viabilidade celular devido à apoptose ou NETose. As células mortas geralmente abrigam quantidades significativas de DNA não cromatinizado altamente suscetíveis ao Tn5, consequentemente elevando o ruído de fundo do ATAC-seq²³.

Aqui, propomos um protocolo escalável para a preparação de bibliotecas ATAC-seq otimizadas para neutrófilos derivados de amostras de medula óssea de roedores. A Figura 1 apresenta uma visão geral gráfica do protocolo, que engloba a separação imunomagnética de neutrófilos da medula óssea, seguida pelo ATAC-seq. A classificação imunomagnética aprimorada garante a viabilidade ideal dos neutrófilos antes de extrair o núcleo para a biblioteca ATAC-seq, garantindo assim a alta qualidade das bibliotecas e facilitando a incorporação de avaliações adicionais de neutrófilos no esquema. A implementação deste protocolo ajudará os pesquisadores a entender as características da arquitetura da cromatina e os mecanismos de reprogramação epigenômica dos neutrófilos quando expostos a vários desafios microambientais. Espera-se que isso tenha amplas aplicações em estudos de imunologia básica e clínica.

Protocolo

Todos os procedimentos em animais apresentados abaixo cumpriram as diretrizes e regulamentos nacionais de ética e bem-estar animal, que foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Cuidados com Animais da Capital Medical University, Pequim, China (sjtkl11-1x-2022(060)).

1. Preparação de suspensões de células da medula óssea (BMC)

1. Selecione camundongos C57BL / 6J machos com idade entre 6 e 8 semanas, pesando 19 a 21 g. Eutanasiar os camundongos usando uma câmara de CO₂ , seguida de luxação cervical após o desaparecimento do reflexo profundo. Desinfete-os com spray de etanol a 70% em um tapete de dissecação.
2. Use uma tesoura pequena e uma pinça para separar cuidadosamente o fêmur da articulação do quadril e da tíbia, remova a pele e o músculo esquelético aderidos e enxágue o fêmur com solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) em uma placa de Petri de 10 cm.
3. Corte as epífises do fêmur, insira suavemente uma agulha de 28 G presa a uma seringa de 2 mL na cavidade da medula e lave a medula óssea com PBS frio contendo 2% de soro fetal bovino (FBS).
4. Repita a etapa anterior até que o fluido vermelho escuro liberado fique translúcido. Geralmente são necessárias três descargas.
   NOTA: Evite inserir a agulha muito profundamente na cavidade da medula óssea para garantir a aquisição ideal de células.
5. Use um filtro de células de 70 μm para filtrar a suspensão celular em um tubo de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) (5 mL).
6. Lise os eritrócitos em BMCs com um tampão comercial de lise de eritrócitos sem poliformaldeído.
   1. Centrifugue o tubo a 500 x g por 5 min a 25 ° C, remova cuidadosamente o sobrenadante, deixando aproximadamente 100 μL de líquido no fundo, e bata suavemente no tubo para soltar o pellet.
   2. Adicione 2 mL de tampão de lise, diluído do tampão de lise eritrocitária (10x), e misture virando o tubo de cabeça para baixo três vezes. Em seguida, centrifugue o tubo a 500 x g por 5 min, descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular batendo suavemente.
   3. Lave as células duas vezes com meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS e ressuspenda-as em um volume de 2 mL.
      NOTA: Ao lidar com aglomerados de células não dispersas, recomenda-se usar uma ponta de pipeta de 200 μL para retirá-los em vez de filtrar as suspensões celulares através de um filtro de células de 70 μm. Este método pode reduzir a perda de células.
7. Calcule a viabilidade celular e o número total de células vivas por amostra com coloração com azul de tripano.

2. Marcação imunomagnética de neutrófilos com esferas magnéticas anti-Ly6G

1. Ressuspenda as células da medula óssea (~ 2 x 10,⁷ células vivas por camundongo) em 2 mL de meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS e centrifugue a 500 x g por 5 min a 25 ° C.
   NOTA: Dada a necessidade limitada de 1 x 10⁵ células para ATAC-seq, os neutrófilos excedentes podem ser alocados para análises epigenômicas adicionais (por exemplo, ChIP-seq e Hi-C) ou avaliações da função imune (por exemplo, produção de citocinas, fagocitose e NETs) usando neutrófilos obtidos do mesmo camundongo.
2. Aspire a maior parte do sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 100 μL, e bata suavemente no tubo para soltar o projétil.
3. Adicione 30 μL de grânulos Ly6G e misture com os BMCs batendo suavemente.
   NOTA: As esferas magnéticas devem ser agitadas por um mínimo de 10 segundos antes do uso. Após a adição das esferas aos BMCs, recomenda-se abster-se de vórtices.
4. Incubar o tubo a 25 °C durante 15 min.
5. Adicione 2 mL de PBS para ressuspender os grânulos e células e, em seguida, centrifugue a 500 x g por 5 min a 25 ° C.
6. Aspire a maior parte do sobrenadante, deixando para trás aproximadamente 100 μL, e bata suavemente no tubo para soltar o projétil. Adicione PBS adicional para um volume final de 1 mL.
   NOTA: Ao lidar com aglomerados de células não dispersas, recomenda-se usar uma ponta de pipeta de 200 μL para retirá-los em vez de filtrar as suspensões celulares através de um filtro de células de 70 μm. Este método pode reduzir a perda de células.

3. Separação de neutrófilos com classificação de células imunomagnéticas

1. Pré-trate a coluna MS com PBS.
   1. Posicione a coluna MS dentro do campo magnético de um separador MACS (Magnetic-activated Cell Sorting) compatível. Posicione um tubo de 5 mL desocupado sob o fluido que sai da coluna MS.
   2. Enxágue a coluna com 500 μL de PBS. Repita esta etapa após o fluxo completo de PBS na coluna MS.
      NOTA: O PBS deve fluir gradualmente, gota a gota, para o tubo de classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) de 5 mL através da coluna MS. Certifique-se de que nenhum ar entre na coluna, pois bolhas de ar podem obstruir a coluna.
2. Aplique a suspensão BMC rotulada magneticamente à coluna MS adicionando 500 μL de cada vez, reabastecendo imediatamente quando o reservatório da coluna estiver vazio.
   NOTA: Certifique-se de que as suspensões celulares estejam desprovidas de massa celular. Se necessário, posicione um novo tubo FACS de 5 mL abaixo da coluna de EM para coletar as células não marcadas (por exemplo, monócitos e linfócitos) antes desse estágio.
   NOTA: Anote a taxa de fluxo de gotículas. Uma vazão lenta pode sugerir que a coluna de classificação está obstruída.
3. Lave a coluna MS adicionando 500 μL de PBS cada vez que o reservatório estiver vazio, repetindo esse processo duas vezes.
   NOTA: A adição prematura de PBS pode impedir a entrada de certas células na coluna de classificação, comprometendo potencialmente a pureza da classificação celular.
4. Colete os neutrófilos marcados magneticamente.
   1. Quando o reservatório da coluna estiver esgotado, remova a coluna do campo magnético e posicione-a cuidadosamente em um tubo de 5 mL.
      NOTA: Antes da remoção da coluna, certifique-se de que não haja líquido residual dentro dela para evitar a perda de neutrófilos devido à descarga de gotículas durante o processo. O resíduo na coluna pode ser removido usando uma pipeta.
   2. Dispense 2 mL de PBS na coluna e, em seguida, empurre imediata e firmemente o êmbolo para dentro da coluna para expelir os neutrófilos marcados magneticamente.
      NOTA: Para adquirir neutrófilos suficientes, garanta um volume de eluição adequado e fique curto ao empurrar o êmbolo para dentro da coluna.
5. Use um hemocitômetro para enumerar as células isoladas. Identifique a pureza dos neutrófilos isolados pegando 100 μL da suspensão celular pós-seleção e analisando-a com citometria de fluxo.

4. Extração do núcleo

1. Centrifugue as 50.000 suspensões unicelulares contendo os neutrófilos a 500 x g por 5 min a 4 ° C em um tubo de 0,2 mL e, em seguida, descarte o sobrenadante.
2. Ressuspenda os neutrófilos em 50 μL de tampão de lise pré-resfriado (consulte a Tabela 1), misture suavemente a solução usando uma pipeta e incube no gelo por 10 min.
   NOTA: Se o sample volume for inferior a 5 μL, é permitido adicionar o tampão de lise diretamente. A concentração de suspensão celular não excede 1 x 10⁷ células / mL.
3. Centrifugar a 500 x g durante 5 minutos a 4 °C, rejeitar o sobrenadante e recolher o núcleo. Posicione o tubo no gelo antes de iniciar os procedimentos subsequentes.
   NOTA: Para minimizar a perda de amostra, denote o lado da parede do tubo onde os pellets se acumulam e aspire suavemente o líquido do lado oposto ao remover o sobrenadante.

5. Marcação ligada ao nucleossomo com transposase

1. Prepare a mistura de reação de tagmentação contendo Tn5 transposase em um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) de acordo com as diretrizes do kit de preparação da biblioteca de DNA (consulte a Tabela 2) e pré-aqueça as esferas de purificação de amplicon refrigeradas a 25 ° C por pelo menos 30 min.
2. Ressuspenda o núcleo do neutrófilo com 50 μL de mistura de reação de marcação e agite suavemente com uma pipeta, seguida de centrifugação por 5s usando uma centrífuga portátil (~ 2600 x g).
3. Incubar o tubo de reação num instrumento de PCR a 37 °C durante 30 min.
4. Adicione 100 μL de grânulos de purificação de amplicon pré-vórtice ao lisado e, em seguida, misture bem os grânulos magnéticos na solução pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
   NOTA: As esferas magnéticas são pegajosas e podem ser facilmente fixadas nas pontas da pipeta, portanto, certifique-se de aspirar o volume certo e dispensá-las lentamente das pontas ao transferir as contas.
5. Incubar o tubo de reação a 25 °C por 5 min e, em seguida, centrifugá-lo por 5 s com uma centrífuga manual (~ 2600 × g).
6. Purifique o fragmento de DNA interrompido colocando o tubo de reação em um rack magnético até que a solução fique clara (aproximadamente 5 min). Em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as esferas magnéticas.
7. Lave o grânulo magnético com 200 μL de etanol a 80% recém-preparado de cada vez, mantendo o tubo de reação no suporte magnético por 30 s. Evite perturbar os grânulos ao adicionar etanol. Repita o procedimento descrito na etapa 5.7.
8. Centrifugue o tubo de reação com uma centrífuga portátil (aproximadamente 2600 × g), aspire o etanol com ponteiras de pipeta de 10 μL e seque as esferas magnéticas por 3-5 min enquanto abre a tampa.
   NOTA: As durações de secagem das esferas magnéticas podem variar entre diferentes regiões devido a variações nos níveis de umidade. As contas devem ser secas apenas até perderem o brilho. A secagem excessiva pode complicar o processo de eluição, enquanto a secagem inadequada pode resultar na presença de resíduos de álcool, impactando os experimentos subsequentes. Além disso, posicionar o rack magnético horizontalmente é mais propício para a secagem uniforme dos grânulos magnéticos.
9. Depois de remover o tubo de reação do rack magnético, adicione 26 μL de ddH₂O para cobrir as esferas magnéticas, pipetando para cima e para baixo para garantir uma mistura completa. Em seguida, incubar a 25 °C durante 2 min.
   NOTA: Estenda a duração da incubação adequadamente se os grânulos magnéticos estiverem secos demais.
10. Centrifugue brevemente o tubo de reação com uma centrífuga portátil (aproximadamente 2600 × g) e separe os grânulos magnéticos usando um rack magnético até que a solução fique clara (aproximadamente 5 min).
11. Transfira cuidadosamente o sobrenadante de 24 μL para o novo tubo de PCR.

6. Construção de bibliotecas para sequenciamento de próxima geração (NGS)

1. Prepare a mistura de reação de PCR em um tubo esterilizado utilizando fragmentos de DNA purificados e primers contendo adaptadores de sequenciamento (consulte a Tabela 3).
2. Conduza a reação de PCR seguindo os procedimentos recomendados (consulte a Tabela 4), normalmente exigindo aproximadamente 1 h.
   NOTA: O experimento pode ser temporariamente interrompido após este procedimento, e os produtos de PCR podem ser armazenados a -20 ° C ou pelo menos 2 semanas.
3. Adicione 27,5 μL de grânulos de purificação de amplicon pré-vórtice a 50 μL de produtos de PCR e, em seguida, misture bem os grânulos magnéticos na solução pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
   NOTA: A proporção incorreta de esferas magnéticas para produtos de PCR pode resultar em discrepâncias nos comprimentos dos fragmentos classificados. Use ddH₂O para encher o volume evaporado do produto de PCR para 50 μL. Certifique-se de aspirar o volume certo de esferas magnéticas e dispense-as lentamente das pontas da pipeta para minimizar as esferas que podem estar presas.
4. Incubar o tubo de reacção a 25 °C durante 5 min e, em seguida, centrifugá-lo durante 5 s com uma centrífuga manual (cerca de 2600 x g).
5. Purifique o DNA da biblioteca colocando o tubo de reação em um rack magnético até que a solução fique clara (aproximadamente 5 min). Em seguida, transfira cuidadosamente o sobrenadante para um novo tubo de PCR esterilizado e descarte as esferas magnéticas.
6. Adicione 50 μl de esferas de purificação de amplicons pré-vórtices ao sobrenadante e, em seguida, misture bem as esferas magnéticas na solução pipetando para cima e para baixo 10 vezes.
7. Incubar o tubo de reacção a 25 °C durante 5 min e, em seguida, centrifugá-lo durante 5 s com uma centrífuga manual (cerca de 2600 x g).
8. Coloque o tubo de reação em um rack magnético até que a solução fique clara (aproximadamente 5 min) e, em seguida, remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar as esferas magnéticas.
9. Lave o grânulo magnético duas vezes com 200 μL de etanol a 80% recém-preparado de cada vez, mantendo o tubo de reação no rack magnético por 30 segundos. Evite perturbar os grânulos ao adicionar etanol.
10. Seque as esferas magnéticas por 5 min enquanto abre a tampa.
11. Depois de remover o tubo de reação do rack magnético, adicione 22 μL de ddH₂O para cobrir os grânulos magnéticos, pipetando para cima e para baixo por 10 vezes para garantir uma mistura completa. Em seguida, incubar a 25 °C durante 5 min.
12. Centrifugar brevemente o tubo de reacção com uma centrífuga manual (cerca de 2600 × g) e separar as esferas magnéticas com uma grelha magnética até que a solução fique límpida (cerca de 5 min).
13. Transfira cuidadosamente o sobrenadante de 20 μL para um novo tubo de PCR esterilizado e armazene-o a -20 °C.
    NOTA: Para obter uma biblioteca com uma distribuição de comprimento mais concentrada, considere utilizar um kit de recuperação de gel para classificar o produto amplificado. Alternativamente, se não houver requisitos específicos para a faixa de distribuição de comprimento, o produto amplificado pode ser purificado diretamente usando um kit de purificação de esferas magnéticas ou coluna sem classificação de comprimento.

7. Controle de qualidade e sequenciamento da biblioteca

1. Utilize plataformas de analisadores de fragmentos de DNA para avaliar a distribuição de comprimento do DNA da biblioteca.
2. Utilize plataformas NGS para realizar sequenciamento de alto rendimento nas bibliotecas que passaram na inspeção de qualidade.

Resultados

O protocolo descrito foi empregado para isolar neutrófilos da medula óssea de camundongos C57BL/6 e comparar suas respectivas variâncias na acessibilidade da cromatina pré e pós-estimulação do lipopolissacarídeo (LPS) via ATAC-seq. Normalmente, 2 x 10⁷ BMCs podem ser colhidos de ambos os fêmures de um camundongo C57BL / 6 de 6 semanas de idade e, posteriormente, 2-5 x 10⁶ neutrófilos podem ser isolados. Entre eles, 1 x 10⁵ células são empregad...

Discussão

Este manuscrito relata um protocolo experimental para a preparação de bibliotecas ATAC-seq otimizadas para neutrófilos derivados de amostras de medula óssea de roedores. Devido aos neutrófilos serem células imunes altamente suscetíveis e prontamente ativadas, os esforços de otimização priorizaram a manutenção da viabilidade dos neutrófilos isolados. O tratamento inadequado pode levar à NETose e outras formas de morte celular, levando à liberação de quantidades significat...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.4% Trypan Blue	Scientific	T10282
1x phosphate-buffered saline	Biosharp	BL302A
20 bp–5000 bp Alignment marker	Bioptic	C109102-100A	DNA fragment analyzer supporting products
5k Size marker(Standard 50 bp Ladder)	Bioptic	C109101-100A	DNA fragment analyzer supporting products
Amplicons Purification Beads	Beckman	A63881	Amplicons Purification Beads is a nucleic acid purification kit for obtaining high quality DNA products.
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, mouse	miltenyi	130-120-337	The Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, mouse were developed for positive selection or depletion of mouse neutrophils from single-cell suspensions of mouse bone marrow.
Anti-mouse CD11b-BV605 (1:200)	BD	Cat#563015
Anti-mouse CD48-PE-Cy7 (1:400)	BD	Cat#560731
Anti-mouse Ly6G-BV510 (1:200)	BD	Cat#740157
C57BL/6J mice, wild type, 8-week-old, male	The Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences	The Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences
DNA Separation Buffer	Bioptic	C104406	DNA fragment analyzer supporting products
E. coli derived ultrapure LPS (serotype0111: B4)	Sigma-Aldrich	Cat#L-2630
DNA Quantitative Reagent	vazyme	EQ111	DNA Quantitative Reagentt is a simple, sensitive and accurate double-stranded DNA (dsDNA) fluorescence quantitative assay kit.
Erythrocyte lysis buffer (10x)	BioLegend	Cat#420301
Fetal bovine serum	Gibco	Cat#10099141C
MS Separation columns	miltenyi	130-042-201	MS Columns are designed for positive selection of cells.
RPMI 1640 medium	Gibco	C11875500BT
S2 Gel electrophoresis needle	Bioptic	C105101	DNA fragment analyzer supporting products
Surgical instruments: scalpel, dissection scissors, microdissection scissors, fine forceps, blunt anatomical forceps, needle holder	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools	Can be purchased from other qualified suppliers
Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464	Can be purchased from other qualified suppliers
TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina	vazyme	TD501-01	TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina is a purpose-built kit specifically developed for Illumina's high-throughput sequencing platform. Using the kit, DNA can be prepared into sequencing libraries dedicated to Illumina's high-throughput sequencing platform.
TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina	vazyme	TD202	TruePrep Index Kit V2 for Illumina is a Kit for the TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina. It can be used to prepare 96 different double-ended Index libraries.