Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
В данной рукописи изложен протокол подготовки библиотеки нейтрофилов ATAC-seq из костного мозга мышей с целью обеспечения оптимальной жизнеспособности нейтрофилов и высокого качества библиотеки. Он предлагает пошаговые инструкции по подготовке BMC, иммуномагнитной сортировке и построению библиотеки, выступая в качестве ценного руководства, особенно для новичков в изучении нейтрофилов.
Анализ на доступный для транспозазы хроматин с секвенированием (ATAC-seq) является мощным высокопроизводительным методом для оценки доступности хроматина и понимания эпигеномной регуляции. Нейтрофилы, как важнейший тип лейкоцитов в иммунных реакциях, претерпевают существенные архитектурные изменения хроматина во время дифференцировки и активации, что значительно влияет на экспрессию генов, необходимую для их функций. ATAC-seq сыграл важную роль в раскрытии ключевых транскрипционных факторов в созревании нейтрофилов, выявлении патоген-специфических эпигеномных сигнатур и идентификации терапевтических мишеней для аутоиммунных заболеваний. Однако чувствительность нейтрофилов к внешней среде затрудняет получение высококачественных данных ATAC-seq. В данной работе мы предлагаем масштабируемый протокол подготовки библиотек ATAC-seq из нейтрофилов, полученных из костного мозга грызунов, с улучшенной иммуномагнитной сепарацией для обеспечения оптимальной жизнеспособности клеток и высокого качества библиотек. Подробно обсуждаются важнейшие элементы, влияющие на качество библиотеки, и принципы оптимизации методологического расширения. Этот протокол будет поддерживать исследователей, которые хотят изучать архитектуру хроматина и эпигеномное перепрограммирование нейтрофилов, продвигая исследования в области фундаментальной и клинической иммунологии.
Нейтрофилы являются одним из наиболее распространенных и важных типов иммунных клеток у позвоночных, составляя 50-70% лейкоцитовчеловека1. Нейтрофилы играют центральную роль в обнаружении и уничтожении микроорганизмов в организме хозяина. Во время сепсиса зрелые нейтрофилы являются одними из первых, кто реагируетна сепсис2. Они быстро мобилизуются к очагам инфекции с помощью хемотаксиса3, где они борются с патогенами, поглощая микроорганизмы (фагоцитоз), продуцируя NADPH-оксидазу-зависимые активные формы кислорода (дыхательные взрывы), секретируя гранулы (дегрануляция) и формируя нейтрофильные внеклеточные ловушки (НВЛ), которые захватывают и убивают внеклеточные бактерии, как только они достигают места воспаления4. Незрелые нейтрофилы также быстро мобилизуются из костного мозга в периферический кровоток с помощью хемокинов 5,6. Эти нейтрофилы, привлеченные к инфекционному очагу, также высвобождают цитокины, которые участвуют в нескольких физиологических процессах, таких как кроветворение, ангиогенез и заживление ран 7,8. Пациенты с врожденными или приобретенными заболеваниями, которые приводят к снижению количества нейтрофилов, более восприимчивы к инфекциям 9,10. Однако активация нейтрофилов – палка о двух концах. Чрезмерная активация и высвобождение цитокинов могут вызвать повреждение тканей и органов, что приводит к полиорганной дисфункции, если инфекции не контролируются своевременно11,12. Кроме того, нейтрофилы также способствуют развитию различных воспалительных и аутоиммунных заболеваний и могут влиять на прогрессирование рака и метастазирование13,14. Это подчеркивает необходимость изучения регуляции активности нейтрофилов для балансировки эффективного иммунного ответа и предотвращения повреждения хозяина.
У нейтрофилов архитектура хроматина претерпевает отчетливые и динамические изменения в их дифференцировке, миграции и активации, выполняя ключевую регуляторную роль на протяжении всей клеточной жизни. Это путешествие от большого, круглого, богатого эухроматином ядра миелобластов к более углубленному ядру в миелоцитах и метамиелоцитах, а затем к С- или S-образным внутриполосным клеткам и высокодольчатым с плотно упакованным хроматином в полиморфноядерных нейтрофилах15,16, является свидетельством сложности биологии нейтрофилов. Специализированная конфигурация хроматина обеспечивает селективную экспрессию генов, важных для функции нейтрофилов, таких как гены, участвующие в производстве гранул и быстрых транскрипционных реакциях, необходимых дляэффективной элиминации патогенов. Когда нейтрофилы мобилизуются к очагам воспаления с помощью хемотаксиса, трансэндотелиальная миграция оказывает давление на комплекс нуклеоскелет/линкер комплекса цитоскелет (ЛИНК), вызывая ремоделирование хроматина и больший потенциал активации18. При сепсисе активированные нейтрофилы демонстрируют «ядерный сдвиг влево» с аномальной морфологией хроматина, такой как двулопастные или нелопастные ядра и значительно более слабая конденсацияхроматина19. Это приводит к повышенной доступности в областях генов, связанных с воспалительной реакцией, тем самым вызывая значительную экспрессию этих генов. Если инфекции не контролируются должным образом, для образования НВЛ20,21 необходимы цитруллинирование гистонов и последующая деконструкция хроматина. Таким образом, понимание архитектуры нейтрофильного хроматина имеет решающее значение для развития биологии нейтрофилов и разработки методов лечения воспалительных и аутоиммунных заболеваний, давая надежду на будущее лечение заболеваний.
Доступность хроматина служит метрикой для архитектуры хроматина на эпигеномном уровне. В нем показано, как участки генома физически допустимы для энхансеров, промоторов, изоляторов и хроматин-связывающих факторов и как эти элементы влияют на экспрессиюгенов22. Анализ на доступный для транспозазы хроматин с секвенированием (ATAC-seq) является широко используемым методом для оценки доступности хроматина в геноме23. Он не требует предварительных знаний регуляторных элементов, что делает его мощным инструментом для эпигенетических исследований. Этот метод включает в себя выделение ядер образцов, фрагментацию геномной ДНК транспозазой Tn5 и добавление праймеров для секвенирования для подготовки библиотеки, секвенированияи анализа данных. ATAC-seq сыграл важную роль в изучении картирования нуклеосом, анализа связывания транскрипционного фактора, регуляторных механизмов в различных типах клеток или заболеваниях, идентификации новых энхансеров, открытия биомаркеров и т. д.22,23. Его часто комбинируют с другими методами, такими как секвенирование РНК, для всестороннего анализа экспрессии генов.
ATAC-seq расширил наши знания в области биологии нейтрофилов, раскрыв точные эпигенетические механизмы в здоровье и болезнях. Было выявлено несколько ключевых факторов транскрипции (т.е. RUNX1, KLF6, PU.1 и т.д.) в созревании нейтрофилов и эффекторных ответах24,25, раскрыты патоген-специфические сигнатуры с биомаркерным потенциалом при сепсисе26, выяснены эпигеномные механизмы врожденной иммунной памяти12 и идентифицированы терапевтические мишени при остром миелоидном лейкозе (ОМЛ) у детей27. Тем не менее, являясь важным клеточным компонентом в иммунном надзоре, нейтрофилы проявляют высокую чувствительность к своей внешней среде и, таким образом, представляют собой проблему для получения высококачественных данных ATAC-seq. При физиологических условиях средний период полувыведения нейтрофилов человека составляет 3,8 дня, в то время как средний период полувыведения нейтрофилов мышей составляет 12,5 часов. Примечательно, что их период полувыведения значительно короче при изучении in vitro28,29. Во время работы in vitro с выделенными нейтрофилами воздействие микроорганизмов или ассоциированных с патогенами молекулярных структур (PAMP), а также избыточные экспериментальные процедуры и жесткие операции могут привести к аберрантной активации нейтрофилов и снижению клеточной жизнеспособности из-за апоптоза или нетоза. Умершие клетки обычно содержат значительное количество нехроматинизированной ДНК, очень чувствительной к Tn5, что приводит к повышению фонового шума ATAC-seq23.
В данной работе мы предлагаем масштабируемый протокол для подготовки библиотек ATAC-seq, оптимизированных для нейтрофилов, полученных из образцов костного мозга грызунов. На рисунке 1 представлен графический обзор протокола, который включает в себя иммуномагнитное разделение нейтрофилов из костного мозга с последующим проведением ATAC-seq. Усовершенствованная иммуномагнитная сортировка гарантирует оптимальную жизнеспособность нейтрофилов перед экстракцией ядра для библиотеки ATAC-seq, что обеспечивает высокое качество библиотек и облегчает включение в схему дополнительных оценок нейтрофилов. Реализация этого протокола поможет исследователям понять особенности архитектуры хроматина и механизмы эпигеномного перепрограммирования нейтрофилов при воздействии различных микроэкологических проблем. Ожидается, что это найдет широкое применение в фундаментальных и клинических иммунологических исследованиях.
Все представленные ниже процедуры для животных соответствовали национальным этическим рекомендациям и правилам по защите животных, которые были одобрены Комитетом по этике исследований в области ухода за животными Столичного медицинского университета, Пекин, Китай (sjtkl11-1x-2022(060)).
1. Приготовление суспензии клеток костного мозга (БМК)
2. Иммуномагнитное мечение нейтрофилов анти-Ly6G магнитными шариками
3. Разделение нейтрофилов с иммуномагнитной сортировкой клеток
4. Экстракция ядра
5. Нуклеосомно-привязанная маркация транспозазой
6. Построение библиотеки для секвенирования нового поколения (NGS)
7. Контроль качества библиотеки и секвенирование
Описанный протокол был использован для выделения нейтрофилов из костного мозга мышей C57BL/6 и сравнения их соответствующих различий в доступности хроматина до и после стимуляции липополисахаридами (ЛПС) с помощью ATAC-seq. Как правило, 2 x 107 BMC могут быть собраны из об?...
В данной рукописи представлен экспериментальный протокол подготовки библиотек ATAC-seq, оптимизированных для нейтрофилов, полученных из образцов костного мозга грызунов. Из-за того, что нейтрофилы обладают высокой восприимчивостью и легко активируются иммунными клетк...
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана грантами Программы исследований и разработок Пекинской муниципальной комиссии по образованию (KZ202010025041) и Китайского института медицинских исследований, Пекин (грант No. CX24PY29).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.4% Trypan Blue | Scientific | T10282 | |
1x phosphate-buffered saline | Biosharp | BL302A | |
20 bp–5000 bp Alignment marker | Bioptic | C109102-100A | DNA fragment analyzer supporting products |
5k Size marker(Standard 50 bp Ladder) | Bioptic | C109101-100A | DNA fragment analyzer supporting products |
Amplicons Purification Beads | Beckman | A63881 | Amplicons Purification Beads is a nucleic acid purification kit for obtaining high quality DNA products. |
Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, mouse | miltenyi | 130-120-337 | The Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure, mouse were developed for positive selection or depletion of mouse neutrophils from single-cell suspensions of mouse bone marrow. |
Anti-mouse CD11b-BV605 (1:200) | BD | Cat#563015 | |
Anti-mouse CD48-PE-Cy7 (1:400) | BD | Cat#560731 | |
Anti-mouse Ly6G-BV510 (1:200) | BD | Cat#740157 | |
C57BL/6J mice, wild type, 8-week-old, male | The Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences | The Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences | |
DNA Separation Buffer | Bioptic | C104406 | DNA fragment analyzer supporting products |
E. coli derived ultrapure LPS (serotype0111: B4) | Sigma-Aldrich | Cat#L-2630 | |
DNA Quantitative Reagent | vazyme | EQ111 | DNA Quantitative Reagentt is a simple, sensitive and accurate double-stranded DNA (dsDNA) fluorescence quantitative assay kit. |
Erythrocyte lysis buffer (10x) | BioLegend | Cat#420301 | |
Fetal bovine serum | Gibco | Cat#10099141C | |
MS Separation columns | miltenyi | 130-042-201 | MS Columns are designed for positive selection of cells. |
RPMI 1640 medium | Gibco | C11875500BT | |
S2 Gel electrophoresis needle | Bioptic | C105101 | DNA fragment analyzer supporting products |
Surgical instruments: scalpel, dissection scissors, microdissection scissors, fine forceps, blunt anatomical forceps, needle holder | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools | Can be purchased from other qualified suppliers |
Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464 | Can be purchased from other qualified suppliers |
TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | vazyme | TD501-01 | TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina is a purpose-built kit specifically developed for Illumina's high-throughput sequencing platform. Using the kit, DNA can be prepared into sequencing libraries dedicated to Illumina's high-throughput sequencing platform. |
TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina | vazyme | TD202 | TruePrep Index Kit V2 for Illumina is a Kit for the TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina. It can be used to prepare 96 different double-ended Index libraries. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены