Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يحدد هذا البروتوكول طريقة لاستخراج وتنقية النوى الدقيقة من الخلايا الليمفاوية البشرية باستخدام الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز. يوفر أساسا تجريبيا للتحقيق في تكوين ووظيفة النوى الدقيقة.

Abstract

النواة الدقيقة (MN) هي بنية نووية غير طبيعية تتشكل في الخلايا ، وخاصة نخاع العظام أو خلايا الدم ، عند تعرضها لتلف خارجي ، مثل الإشعاع ، بسبب تلف الحمض النووي الذي لم يتم حله أو الأخطاء الانقسامية. بمجرد تكوينها ، يمكن أن تساهم MNs بنشاط في العديد من العمليات المسببة للسرطان ، بما في ذلك الإشارات الالتهابية وإعادة الترتيب الجيني للكروموسومات. تحتوي MNs على الحمض النووي النووي ، والهيستونات ، وشظايا البروتين النووي ، والبروتينات النشطة الأخرى ، والتي ترتبط ارتباطا وثيقا بوظائفها. تعد دراسة تكوين ومكونات MNs أمرا بالغ الأهمية لفهم دورها في قيادة العمليات المسببة للسرطان. يعد استخراج وتنقية MNs ضروريين لتحقيق أهداف البحث هذه. ومع ذلك ، فإن عدم استقرار الغشاء النووي MN وقابليته للتمزق يجعل هذه العمليات صعبة من الناحية الفنية. حاليا ، أبلغ عدد قليل فقط من الدراسات عن استخدام الطرد المركزي المتدرج للكثافة لفصل MN. تلخص هذه الدراسة وتبسط عمليات فصل وتنقية MN. تم عزل الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي البشري المعرضة للإشعاع ، وتم فصل MNs وتنقيتها باستخدام مخازن السكروز بتركيزات مختلفة في عملية من خطوتين. تم التحقق من سلامة ونقاء MNs ، مما يوفر عرضا واضحا وعمليا للإجراء التجريبي للباحثين الذين يحققون في أسباب ووظائف MNs.

Introduction

النواة الدقيقة (MN) هي بنية فرعية في السيتوبلازم تحتوي على الحمض النووي النووي والهستوين وشظايا البروتين النووي ، وتحيط بها هياكل الغشاء1،2. MN منفصل تماما عن النواة الرئيسية ويظهر عادة بالقرب منه في شكل بيضاوي أو دائري ، بحجم يتراوح من 1/16 إلى 1/3 من قطر النواة الرئيسية. يرتبط تكوين MNs بشكل أساسي بشظايا الكروموسوم اللامركزية ، وخلل الكروموسومات ، وكسر الكروموسوم ثنائي المركز ، وعدم استقرار الكروموسوم ، وتجميع الدقائق المزدوجة (DBs)3. نادرا ما تحدث MNs في الخلايا السليمة وتنتج في الغالب عن التعرض للسموم الجينية الخارجية ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي أو الأخطاء الانقسامية4،5. يعد الضرر الإشعاعي مساهما كبيرا في تكوين MN ، وقد زاد التعرض البشري للإشعاع المؤين (IR) مع التقدم في التطبيقات السريرية والتكنولوجية6،7. يؤدي التعرض للأشعة تحت الحمراء إلى حدوث فواصل أحادية الخيط (SSBs) وفواصل مزدوجة الخيط (DSBs) في الحمض النووي الخلوي ، مما قد يؤدي إلى موت الخلايا أو موت الخلايا المبرمج8،9،10. MNs عبارة عن شظايا من الكروموسومات أو الكروموسومات الكاملة أو الكروماتيدات التي يتم إنتاجها بسبب إصلاح DSB غير الإصلاح أو غير المتطابق. وهي بمثابة مؤشرات حاسمة لدرجة الضرر الناجم عن IR7،11،12. يعد الفهم الشامل للمكونات داخل MNs ضروريا للتخفيف من الآثار الجانبية للعلاج الإشعاعي وتقليل التعرض العام للإشعاع غير المرغوب فيه6،13. ومع ذلك ، فإن البروتينات والأحماض النووية الموجودة في MNs لا تزال غير مميزة بشكل كامل حتى الآن.

يعتقد أن MNs ناتجة عن تحريض أنواع مختلفة من تلف الحمض النووي. تضعف آليات النسخ المتماثل وقدرات إصلاح الحمض النووي ، مما يؤدي إلى تلف الحمض النووي بشكل كبير خلال فترة قصيرة3،14،15. تعد MNs أيضا مؤشرات مهمة لعدم استقرار الكروموسومات ، والتي توجد باستمرار في الخلايا محتملة التسرطن3،14،16،17،18،19. لطالما استخدمت MNs كمؤشرات حيوية للسمية الجينية ومخاطر الورم ودرجةالورم 3،20،21. بمجرد تشكيلها ، يمكن ل MNs أن تقود بنشاط العديد من العمليات المسببة للسرطان ، بما في ذلك الإشارات الالتهابية22،23وإعادة الترتيب الجيني للكروموسومات24،25،26. على سبيل المثال ، تبدأ MNs سلسلة التهابية عن طريق تجنيد مستقبلات التعرف على النمط الفيروسي (PRR) دوري GMP-AMP synthase (cGAS) من السيتوبلازم4،22،23،27. تشمل البروتينات الأخرى التي قد تكون موجودة في MNs نوكلياز خارجي28 ، وآليات النسخ4 ، وعوامل الترجمة المساعدة. لا يزال من غير الواضح ما إذا كانت MNs تجمع ملف تعريف بروتيني فريد ومتحيز من مكتبة البروتين السيتوبلازمي أو تكتسب بشكل سلبي بروتينات عالية الوفرة من النواة والسيتوبلازم أثناء تكوينها. بالإضافة إلى البروتينات الفردية مثل cGAS ، لم يتم تحديد مدى تأثير بيئات معينة على التكوين الكلي ل MN. فهم مشهد النوى الدقيقة بأكمله محدود ، مع عدم وجود مجموعات بيانات متاحة للجمهور للاستكشاف. لذلك ، هناك حاجة ماسة إلى استخراج MNs كاملة ومنقاة لإجراء تحليلات متعمقة وشاملة لمكوناتها.

قد يكون أحد أسباب تأخر تكرار الحمض النووي في MNs هو إجهاد النسخ المتماثل الناجم عن نقص الإنزيمات والعوامل المساعدة اللازمة لتخليق الحمض النووي وإصلاحه. قد ينتج هذا النقص عن التجميع المعيب للغلاف النووي MN ، مما يؤدي إلى عدم وجود مجمع المسام النووية20. وبالتالي ، فإن MNs غير قادرة على استيراد البروتينات الرئيسية الضرورية للحفاظ على سلامة الغشاء النووي واستقرار الجينوم2،29،30،31. الغشاء النووي MN غير المكتمل عرضة للتمزق ، مما يجعل استخراج MN صعبا للغاية.

حاليا ، يتم استخراج MNs بشكل أساسي باستخدام الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز27،32،33ويتم تنقيته عن طريق قياس التدفقالخلوي 34. في هذه الدراسة ، تم تلخيص وتبسيط عملية فصل وتنقية MNs. تم عزل الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي من البشر المعرضين للإشعاع ، وتم تنقية MNs مرتين باستخدام مخازن السكروز بتركيزات مختلفة. تم التحقق من سلامة ونقاء MNs ، مما يوفر للباحثين عرضا تجريبيا عمليا وبديهايا لدراسة أسباب ووظائف MNs.

Protocol

أجريت جميع التجارب التي شملت عينات دم محيطية بشرية وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح ذات الصلة. تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل اللجنة الأخلاقية لمستشفى الصناعة النووية 416 ، الصين (مراجعة 2020 [رقم 48]) ، وتم الحصول على موافقة مستنيرة من جميع المشاركين. وشملت معايير الاستبعاد الأفراد المصابين بأمراض مزمنة رئيسية ، مثل الأورام أو النقرس أو اضطرابات الدم ، وكذلك أولئك الذين تعرضوا لمواد مشعة أو سامة للجينات في مهنتهم. في هذه الدراسة ، تم جمع 10 مل من الدم المحيطي من رجل سليم يبلغ من العمر 28 عاما في أنبوب لجمع الدم يحتوي على الهيبارين الصوديوم كمضاد للتخثر. تم تشعيع العينة في المختبر ب 60أشعة γ ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية باستخدام جهاز قياسي على المستوى العلاجي لطاقة جوية جاما. تم ضبط جرعة التشعيع على 4.0 غراي ، بمعدل جرعة 0.6350 غراي / دقيقة. بعد التشعيع ، تم تحضين العينة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، وتلقيحها في وسط RPMI-1640 ، وزرعتها عند 37 درجة مئوية لمدة 60 ساعة. وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير النواة الدقيقة والنواة

  1. أضف السيتوكالاسين B إلى وسط خلايا الدم المحيطية لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام / مل. احتضن الخليط لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: السيتوكالاسين ب هو مثبط لبلمرة الأكتين يسهل الفصل الفعال للنوى الدقيقة عن النواة قبل تحلل الخلية35.
  2. الطرد المركزي لخلايا الدم عند 200 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  3. أعد تعليق خلايا الدم في 10 مل من 0.01 M PBS المبردة مسبقا عند 4 درجات مئوية.

2. عزل الخلايا الليمفاوية

  1. أضف 15 مل من محلول فصل الخلايا الليمفاوية البشرية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. ضع طبقة من خلايا الدم المحيطية العالقة بعناية فوق محلول الفصل.
  2. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، ستنفصل خلايا الدم في الأنبوب إلى أربع طبقات متميزة من أعلى إلى أسفل: الطبقة الأولى هي طبقة البلازما (الصفائح الدموية) ، والطبقة الثانية هي طبقة الخلايا الليمفاوية البيضاء اللبنية الحلقية ، والطبقة الثالثة هي طبقة سائل الفصل الشفافة ، والطبقة الرابعة هي طبقة خلايا الدم الحمراء.
  3. انقل الطبقة الثانية (الخلايا الليمفاوية) بعناية إلى أنبوب طرد مركزي منفصل. أضف PBS (0.01 M) بثلاثة أضعاف حجم الخلايا المنقولة ، واخلطها جيدا ، وأجهزة الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.

3. تحلل الخلايا الليمفاوية

  1. ضع حبيبات الخلية المجمعة في الأنبوب المخروطي على الجليد.
  2. أضف 6 مل من المخزن المؤقت للتحلل البارد (الجدول 1 ، الملف التكميلي 1) وأعد تعليق حبيبات الخلية في المخزن المؤقت للتحلل.
    ملاحظة: يجب استكمال المخزن المؤقت للتحلل بالمكونات المدرجة في الجدول 2 ، الملف التكميلي 1 ، قبل الاستخدام مباشرة.
  3. انقل محللة الخلية إلى الخالط الزجاجي.
  4. استخدم طحنا فضفاضا برفق لتجانس العينة يدويا عن طريق تحريك الخالط لأعلى ولأسفل 10 مرات.
  5. انقل محللة الخلية المتجانسة مرة أخرى إلى الأنبوب المخروطي سعة 50 مل.
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات برفق واحتفظ بالعينة على الثلج.

4. العزل الأولي ل MNs عبر تدرج كثافة السكروز

  1. امزج 5 مل من محللة الخلية بحجم متساو من 1.8 مليون مخزن مؤقت من السكروز (الجدول 3 ، الملف التكميلي 1) لتحقيق نسبة 1: 1 من المحللة إلى السكروز المؤقتة.
    ملاحظة: يجب استكمال المخزن المؤقت للسكروز 1.8 M بالمكونات المدرجة في الجدول 4 ، الملف التكميلي 1 ، قبل الاستخدام مباشرة.
  2. تحضير تدرج كثافة السكروز: أضف 15 مل من عازلة السكروز 1.6 M (الجدول 5 ، الملف التكميلي 1) إلى قاع أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف ببطء 20 مل من المخزن المؤقت للسكروز 1.8 M (الجدول 3 ، الملف التكميلي 1) فوق المخزن المؤقت للسكروز 1.6 متر.
    ملاحظة: يجب استكمال كل من المخزن المؤقت للسكروز 1.6 M و 1.8 M من السكروز بالمكونات الواردة في الجدول 4 ، الملف التكميلي 1 ، على التوالي ، قبل الاستخدام مباشرة. لإضافة مخازن السكروز ، ضع طرف الماصة على الجانب الداخلي العلوي من الأنبوب المخروطي وقم بتقطيع المحلول ببطء.
  3. قم ببطء بتعبئة 10 مل من خليط [محلول السكروز 1: 1 1.8 M] فوق تدرج كثافة السكروز المكون من طبقتين.
    ملاحظة: أضف الطبقات ببطء للتأكد من أن الطبقة العازلة الوسطى 1.8 متر لا تختلط مع الطبقة العازلة السفلية 1.6 M ، ولا يختلط الخليط العلوي 1: 1 من الخلايا المحللة و 1.8 M المخزن المؤقت للسكروز مع الطبقة العازلة 1.8 M.
  4. جهاز طرد مركزي للأنبوب في جهاز طرد مركزي دوار أفقي عند 1000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، سينفصل السائل إلى ثلاث طبقات: تحتوي الطبقة العليا على ما يقرب من 3 مل من بقايا الخلية ، وتحتوي الطبقة الوسطى على ما يقرب من 3 مل من النوى الدقيقة (MNs) ، وتحتوي الطبقة السفلية على ما يقرب من 39 مل من النوى.
  5. قم بإزالة الجزء العلوي من 3 مل من السائل بالقرب من السطح واجمع 3 مل من النوى الدقيقة غير المنقاة من الطبقة الوسطى لتدرج كثافة السكروز الثاني.

5. التنقية الثانوية ل MNs عبر تدرج كثافة السكروز

  1. تحضير تدرج كثافة السكروز:
    1. أضف 3 مل من محلول السكروز 1.8 M (الجدول 3 ، الملف التكميلي 1) إلى الجزء السفلي من أنبوب مخروطي 15 مل.
    2. أضف 3 مل من المخزن المؤقت للسكروز 1.5 M (الجدول 6 ، الملف التكميلي 1) فوق المخزن المؤقت للسكروز 1.8 M.
    3. أخيرا ، أضف 3 مل من 1.4 M من السكروز المؤقت (الجدول 7 ، الملف التكميلي 1) فوق المخزن المؤقت للسكروز 1.5 M.
      ملاحظة: ضع طرف الماصة على الجانب الداخلي العلوي للأنبوب المخروطي وقم بسحب المحلول ببطء.
  2. قم بإخراج 3 مل من الطبقة الوسطى ببطء من تدرج كثافة السكروز الثاني إلى الجزء العلوي من تدرج كثافة السكروز ثلاثي الطبقات.
    ملاحظة: أضف الطبقات ببطء لتجنب الخلط.
  3. جهاز الطرد المركزي للأنبوب في جهاز طرد مركزي دوار أفقي عند 500 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، ستحتوي الطبقة العليا على 1-4 مل من النوى الدقيقة المنقاة (MN) ، وستحتوي الطبقة السفلية بشكل أساسي على 8 مل من النوى.
  4. احتفظ بالجزء العلوي من 1-4 مل من النوى الدقيقة المنقاة لاستخدامها لاحقا.

6. تحديد MNs

  1. خذ محلول النواة الدقيقة غير المنقى (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4) ومحلول النواة الدقيقة المنقى (الذي تم الحصول عليه في الخطوة 5) وقم بإعداد مسحات الخلايا على الشريحة.
  2. أضف محلول بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ لتثبيت العينة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
  3. اغسل الشرائح باستخدام PBS (0.01 م) مرتين ، 3 دقائق لكل غسلة.
  4. أضف 0.1٪ Triton X-100 لاختراق الخلايا عند RT لمدة 5 دقائق.
  5. قم بحظر الخلايا في 5٪ BSA في RT لمدة 30 دقيقة.
  6. أضف الجسم المضاد الأساسي ضد γ-H2AX (مخفف في 5٪ BSA ، 1: 200) واحتضنه عند RT لمدة 1 ساعة.
  7. اغسل الشرائح باستخدام PBS (0.01 م) مرتين ، 5 دقائق لكل غسلة.
  8. أضف الجسم المضاد الثانوي (المخفف في 5٪ BSA ، 1: 500) واحتضن في RT لمدة ساعة واحدة في الظلام.
  9. أضف محلول صبغة DAPI واحتضنه في RT لمدة 15 دقيقة.
  10. اغسل الشرائح باستخدام PBS (0.01 م) مرتين ، 3 دقائق لكل غسلة.
  11. ضع محلول مانع للتسرب على الشريحة لإغلاقها.
  12. راقب التألق تحت المجهر الفلوري (التكبير: 400× ، والتركيز التلقائي ، والتعرض التلقائي) ، واحسب النوى الدقيقة باستخدام لوحة عد الخلايا.
    ملاحظة: يتم تخفيف 4٪ بارافورمالدهيد ، و 0.1٪ Triton X-100 ، و 5٪ BSA باستخدام PBS (0.01 م). γ-H2AX (Gamma H2AX) هو شكل فسفرة من بروتين هيستون H2AX ، يتكون استجابة لتلف الحمض النووي. في النواة ، تتركز فسفرة هيستون H2AX في مناطق معينة ، لذلك قد يبدو التألق المضاد ل γ-H2AX متقطعا. تتركز فسفرة هيستون H2AX في النواة الدقيقة ، مما ينتج عنه مضان أكثر إشراقا بشكل عام مع بقع مميزة36. DAPI هي صبغة فلورية ترتبط بقوة بالحمض النووي وغالبا ما تستخدم في الفحص المجهري الفلوري. نظرا لأن النوى الدقيقة تحتوي على شظايا الحمض النووي والهيستون المكسورة ، فيمكن تلطيخها بالأجسام المضادة الفلورية المضادة γ-H2AX و DAPI. سيشير التألق إلى عدد النوى الدقيقة وحجمها واكتمالها ، مما يساعد على تمييزها عن النوى وتقييم فعالية التنقية32.

النتائج

بعد التعرض للإشعاع ، تم تحضين الدم المحيطي البشري باستخدام RPMI-1640 لمدة 60 ساعة ، ثم تمت إضافة Cytochalasin B لتحضير النواة الدقيقة (MN). تم عزل الخلايا الليمفاوية باستخدام محلول فصل الخلايا الليمفاوية ، متبوعا بالتحلل باستخدام محللة خلية مهيأة خصيصا وتجانس لطيف في الخالط الزجاجي. ...

Discussion

في هذه الطريقة ، تم استخدام الخلايا الليمفاوية للدم المحيطي البشري المشع لعزل وتنقية النوى الدقيقة (MNs). أبلغت العديد من الدراسات السابقة عن الخطوات التفصيلية لتحلل الخلايا والفصل الأولي ل MNs4،32،33،34. ?...

Disclosures

اي.

Acknowledgements

تم إنشاء جميع الأرقام من قبل المؤلفين عبر مكتب WPS. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم الطبيعية التابعة لكلية الطب في تشنغدو (CYZ19-38) ، وبرنامج دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (2024NSFSC0592).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tubeThermo339650
4% paraformaldehyde solutionBeyotimeP0099
50 mL conical tubeThermo339652
Anti-γ-H2AX antibodyBiossbsm-52163R
Bovine serum albuminBeyotimeST023
Calcium chlorideBiosharpBS249
Cytochalasin BMacklin14930-96-2
DAPI dyeing solutionBiossS0001
Dithiothreitol (DTT)CoolaberCD4941
EDTABiosharpBS107Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
Fluorescence microscopeNikonTi2-U
HomogenizerYbscienceYB101103-1(20 mL)
Horizontal controlled temperature centrifugeThermoSorvall ST1R plusBrake speed is set to "5"
Human lymphocyte separation solutionBeyotimeC0025
Magnesium acetateMacklinM833330
NP-40CoolaberSL932010% solution
Phosphate buffer solution(PBS)HyCloneSH30256.01B
Protease inhibitorsCoolaberSL1086Cocktail (100×)
Secondary antibodyBiossBs-0295GGoat Anti-Rabbit IgG H&L/FITC
SpermidineCoolaberCS10431
SpermineCoolaberCS10441
SucroseCoolaberCS10581
Tris-HClBiosharpBS157
Triton X-100BeyotimeP0096

References

  1. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154, 47-60 (2013).
  2. Liu, S., Kwon, M., Mannino, N. Nuclear envelope assembly defects link mitotic errors to chromothripsis. Nature. 561, 551-555 (2018).
  3. Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus assay: The state of art, and future directions. Int J Mol Sci. 21 (4), 1534 (2020).
  4. MacDonald, K. M., et al. Antecedent chromatin organization determines cGAS recruitment to ruptured micronuclei. Nat. Commun. 14, 556 (2023).
  5. Abdisalaam, S., Mukherjee, S., Bhattacharya, S. NBS1-CtIP–mediated DNA end resection suppresses cGAS binding to micronuclei. Nucleic Acids Res. 50, 2681-2699 (2022).
  6. Li, L., Kim, H. S., Kwon, S. W. Inhibitory effects of saeu-jeot extract on NLRP3 inflammasome activation and radiation-induced micronucleus formation. Food Sci Nutr. 10 (6), 1921-1927 (2022).
  7. Qian, Q. Z., Cao, X., Ke, F. H., Shen, Effects of ionising radiation on micronucleus formation and chromosomal aberrations in Chinese radiation workers. Radiat Prot Dosimetry. 168 (2), 197-203 (2016).
  8. Rzeszowska-Wolny, J., Przybyszewski, W. M., Widel, M. Ionizing radiation-induced bystander effects, potential targets for modulation of radiotherapy. Eur J Pharmacol. 625 (1-3), 156-164 (2009).
  9. Zuo, Y. H., Dang, X. H., Zhang, H. F. Genomic instability induced by ionizing radiation in human hepatocytes. J Toxicol Environ Health A. 75 (12), 700-706 (2012).
  10. Eken, A., Aydin, A., Erdem, O. Cytogenetic analysis of peripheral blood lymphocytes of hospital staff occupationally exposed to low doses of ionizing radiation. Toxicol Ind Health. 26 (5), 273-280 (2010).
  11. Gutierrez-Enriquez, S., Ramon, Y. C. T., Alonso, C. Ionizing radiation or mitomycin-induced micronuclei in lymphocytes of BRCA1 or BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res Treat. 127 (3), 611-622 (2011).
  12. Brzozowska, K., et al. Effect of temperature during irradiation on the level of micronuclei in human peripheral blood lymphocytes exposed to X-rays and neutrons. Int J Radiat Biol. 85 (10), 891-899 (2009).
  13. Yamini, K., Gopal, V. Natural radioprotective agents against ionizing radiation-an overview. Int J PharmTech Res. 2 (2), 1421-1426 (2010).
  14. Terradas, M., Martín, M., Genescà, A. Impaired nuclear functions in micronuclei results in genome instability and chromothripsis. Arch Toxicol. 90, 2657-2667 (2016).
  15. Crasta, K., Ganem, N. J., Dagher, R. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482, 53-58 (2012).
  16. Fenech, M., Morley, A. Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutat Res. 147, 29-36 (1985).
  17. Kirsch-Volders, M., Bonassi, S., Knasmueller, S. Commentary: Critical questions, misconceptions and a road map for improving the use of the lymphocyte cytokinesis-block micronucleus assay for in vivo biomonitoring of human exposure to genotoxic chemicals-a HUMN project perspective. Mutat Res Rev Mutat Res. 759, 49-58 (2014).
  18. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  19. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nat Protoc. 2, 1084-1104 (2007).
  20. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay evolution into a more comprehensive method to measure chromosomal instability. Genes (Basel). 11 (10), 1203 (2020).
  21. Kwon, M., Leibowitz, M. L., Lee, J. H. Small but mighty: The causes and consequences of micronucleus rupture. Exp Mol Med. 52 (11), 1777-1786 (2020).
  22. Harding, S. M., et al. Mitotic progression following DNA damage enables pattern recognition within micronuclei. Nature. 548, 466-470 (2017).
  23. Mackenzie, K. J., et al. cGAS surveillance of micronuclei links genome instability to innate immunity. Nature. 548, 461-465 (2017).
  24. Tang, S., Stokasimov, E., Cui, Y. Breakage of cytoplasmic chromosomes by pathological DNA base excision repair. Nature. 606, 930-936 (2022).
  25. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  26. Umbreit, N. T., Zhang, C. Z. Z., Lynch, L. D. Mechanisms generating cancer genome complexity from a single cell division error. Science. 368, eaba0712 (2020).
  27. Li, Q. J., Wu, P., Du, Q. J. cGAS-STING, an important signaling pathway in diseases and their therapy. Med Comm. 5 (4), e511 (2024).
  28. Mohr, L., Toufektchan, E., von Morgen, P. ER-directed TREX1 limits cGAS activation at micronuclei. Mol Cell. 81, 724-738.e9 (2021).
  29. Okamoto, A., Utani, K., Shimizu, N. DNA replication occurs in all lamina positive micronuclei, but never in lamina negative micronuclei. Mutagenesis. 27, 323-327 (2012).
  30. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154, 47-60 (2013).
  31. Guo, X., Dai, X., Wu, X. Understanding the birth of rupture-prone and irreparable micronuclei. Chromosoma. 129 (3-4), 181-200 (2020).
  32. MacDonald, K. M., et al. The proteomic landscape of genotoxic stress-induced micronuclei. Molecular Cell. 84 (7), 1377-1391.e6 (2024).
  33. Agustinus, A. S., Al-Rawi, D., Dameracharla, B. Epigenetic dysregulation from chromosomal transit in micronuclei. Nature. 619 (7968), 176-183 (2023).
  34. Toufektchan, E., Maciejowski, J. Purification of micronuclei from cultured cells by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (1), 100378 (2021).
  35. Shimizu, N., Kanda, T., Wahl, G. M. Selective capture of acentric fragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat Genet. 12, 65 (1996).
  36. Samur, B. M., et al. Assessment of extracorporeal photopheresis related cell damage. Transfus Apher Sci. 61 (6), 103472 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 217

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved