从人外周血淋巴细胞中提取和鉴定微核

摘要

该方案概述了一种使用蔗糖密度梯度离心从人淋巴细胞中提取和纯化微核的方法。它为研究微核的组成和功能提供了实验基础。

摘要

微核 （MN） 是一种异常的核结构，当由于未解决的 DNA 损伤或有丝分裂错误而受到辐射等外部损伤时，它会在细胞中形成，尤其是骨髓或血细胞。一旦形成，MN 可以积极促进各种致癌过程，包括炎症信号传导和染色体基因重排。MN 包含核 DNA、组蛋白、核蛋白片段和其他活性蛋白，这些蛋白与其功能密切相关。研究 MN 的形成和成分对于了解它们在驱动致癌过程中的作用至关重要。MN 的提取和纯化对于实现这些研究目标至关重要。然而，MN 核膜的不稳定性及其易破裂性使这些过程在技术上具有挑战性。目前，只有少数研究报道了使用密度梯度离心法进行 MN 分离。本研究总结并简化了 MN 分离和纯化的过程。分离暴露于辐射的人外周血淋巴细胞，并使用不同浓度的蔗糖缓冲液分两步分离和纯化 MNs。验证了 MN 的完整性和纯度，为研究 MN 原因和功能的研究人员提供了清晰实用的实验程序演示。

引言

微核 （MN） 是细胞质中的一种亚细胞结构，包含核 DNA、组蛋白和核蛋白片段，周围环绕着膜结构 ^1,2。MN 与主核完全分开，通常以椭圆形或圆形出现在其附近，大小从主核直径的 1/16 到 1/3 不等。MN 的形成主要与无着丝粒染色体片段、染色体错误分离、双着丝粒染色体断裂、染色体不稳定和双分 （DB） 聚集有关³。MN 很少发生在健康细胞中，主要由暴露于外源性基因毒素引起，这会导致 DNA 损伤或有丝分裂错误 ^4,5。辐射损伤是 MN 形成的重要因素，随着临床和技术应用的进步，人类对电离辐射 （IR） 的暴露有所增加 ^6,7。IR 暴露会诱导细胞 DNA 中的单链断裂 （SSB） 和双链断裂 （DSB），从而导致细胞死亡或细胞凋亡 ^8,9,10。MN 是由于未修复或不匹配的 DSB 修复而产生的染色体、全染色体或染色单体的片段。它们是 IR ^7,11,12 造成的损害程度的关键指标。全面了解 MN 中的成分对于减轻放射治疗的副作用和最大限度地减少公众暴露于不需要的辐射至关重要 ^6,13。然而，迄今为止，MNs 中包含的蛋白质和核酸仍未完全表征。

MN 被认为是由诱导各种类型的 DNA 损伤引起的。它们的复制机制和 DNA 修复能力受损，导致短时间内出现广泛的 DNA 损伤 ^3,14,15。MN 也是染色体不稳定的重要指标，它始终存在于癌前细胞中 3,14,16,17,18,19。长期以来，MN 一直被用作遗传毒性、肿瘤风险和肿瘤^3、20、21 级的生物标志物。一旦形成，MNs 可以主动驱动许多致癌过程，包括炎症信号转导^22,23 和染色体基因重排 24,25,26。例如，MN 通过从细胞质中募集病毒模式识别受体 （PRR） 环状 GMP-AMP 合酶 （cGAS） 来启动炎症级联反应 4,22,23,27。MN 中可能存在的其他蛋白质包括核酸外切酶²⁸、转录机制⁴ 和翻译辅因子。目前尚不清楚 MN 是从细胞质蛋白库中组装独特的、偏倚的蛋白质谱，还是在形成过程中从细胞核和细胞质中被动获得高丰度蛋白质。除了 cGAS 等单个蛋白质之外，特定环境对整体 MN 组成的影响程度尚未确定。对整个微核景观的理解是有限的，没有公开可用的数据集可供探索。因此，迫切需要提取完整和纯化的 MNs，以便对其成分进行深入和全面的分析。

MN 中 DNA 复制延迟的一个原因可能是由于缺乏 DNA 合成和修复所需的酶和辅因子而导致的复制应激。这种缺陷可能是由于 MN 核膜的组装缺陷引起的，导致不存在核孔复合体²⁰。因此，MN 无法输入维持核膜完整性和基因组稳定性所必需的关键蛋白 2,29,30,31。不完全的 MN 核膜容易破裂，使 MN 提取极具挑战性。

目前，MN 主要使用蔗糖密度梯度离心法提取 27,32,33 并通过流式细胞术 ³⁴ 纯化。本研究对 MNs 的分离纯化过程进行了总结和简化。分离暴露于辐射的人类的外周血淋巴细胞，并使用不同浓度的蔗糖缓冲液纯化 MNs 两次。验证了 MNs 的完整性和纯度，为研究人员研究 MNs 的原因和功能提供了实用和直观的实验示范。

研究方案

所有涉及人外周血样本的实验均按照相关指南和规定进行。本研究经中国核工业 416 医院伦理委员会批准 （2020 Review [No. 48]），并获得所有参与者的知情同意。排除标准包括患有主要慢性病（如肿瘤、痛风或血液疾病）的个体，以及在其职业中暴露于放射性或遗传毒性物质的个体。在这项研究中，将一名健康的 28 岁男性的 10 mL 外周血采集到含有肝素钠作为抗凝剂的采血管中。使用 γ 空气动能治疗级标准装置在 37 °C 下用 ⁶⁰Co γ射线对样品进行体外照射。照射剂量设置为 4.0 Gy，剂量率为 0.6350 Gy/min。照射后，将样品在 37 °C 下孵育 2 小时，接种到 RPMI-1640 培养基中，并在 37 °C 下培养 60 小时。材料表中提供了本研究中使用的试剂和设备的详细信息。

1. 微核和细胞核的制备

1. 将细胞松弛素 B 添加到外周血细胞培养基中，使终浓度达到 10 μg/mL。将混合物在 37 °C 下孵育 45 分钟。
   注：细胞松弛素 B 是一种肌动蛋白聚合抑制剂，有助于在细胞裂解之前从细胞核中有效分离微核³⁵。
2. 将血细胞在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟。
3. 将血细胞重悬于 10 mL 在 4 °C 预冷的 0.01 M PBS 中。

2. 淋巴细胞的分离

1. 将 15 mL 人淋巴细胞分离溶液加入 50 mL 锥形管中。小心地将悬浮的外周血细胞放在分离溶液的顶部。
2. 将试管在 4 °C 下以 400 × g 离心 30 分钟。
   注意：离心后，管内的血细胞会从上到下分离成四个不同的层：第一层是血浆层（血小板），第二层是环状乳白色淋巴细胞层，第三层是透明分离液层，第四层是红细胞层。
3. 小心地将第二层（淋巴细胞）转移到单独的离心管中。加入三倍于转移细胞体积的 PBS （0.01 M），充分混合，并在 4 °C 下以 200 × g 离心 10 分钟。 使用移液管弃去上清液。

3. 淋巴细胞的裂解

1. 将收集在锥形管中的细胞沉淀置于冰上。
2. 加入 6 mL 冷裂解缓冲液（表 1， 补充文件 1），并将细胞沉淀重悬于裂解缓冲液中。
   注：裂解缓冲液应在使用前补充补充文件 1 表 2 中列出的成分。
3. 将细胞裂解物转移到玻璃匀浆器中。
4. 轻轻使用松散的研磨物，通过上下移动均质器 10 次来手动匀浆样品。
5. 将匀浆的细胞裂解物转移回 50 mL 锥形管中。
   注意：轻轻执行所有步骤并将样品保存在冰上。

4. 通过 蔗糖密度梯度初步分离 MN

1. 将 5 mL 细胞裂解物与等体积的 1.8 M 蔗糖缓冲液（表 3， 补充文件 1）混合，以达到 1：1 的裂解物与蔗糖缓冲液的比例。
   注：1.8 M 蔗糖缓冲液应在使用前补充补充文件 1 表 4 中列出的成分。
2. 准备蔗糖密度梯度：向 50 mL 锥形管底部添加 15 mL 1.6 M 蔗糖缓冲液（表 5， 补充文件 1）。在 1.6 M 蔗糖缓冲液上缓慢添加 20 mL 1.8 M 蔗糖缓冲液（表 3， 补充文件 1）。
   注：1.6 M 蔗糖缓冲液和 1.8 M 蔗糖缓冲液均应在使用前分别补充文件 1 表 4 中的成分。要添加蔗糖缓冲液，请将移液管的尖端靠在锥形管的顶部内侧，然后缓慢移液溶液。
3. 在两层蔗糖密度梯度的顶部缓慢移液 10 mL [Lysate 1：1 1.8 M 蔗糖缓冲液] 混合物。
   注意：缓慢添加各层，以确保中间的 1.8 M 缓冲层不与下层 1.6 M 缓冲层混合，并且裂解细胞和 1.8 M 蔗糖缓冲液的上部 1：1 混合物不与 1.8 M 缓冲层混合。
4. 将试管放入水平转子离心机中，在 4 °C 下以 1000 × g 离心 20 分钟。
   注：离心后，液体将分离成三层：上层包含约 3 mL 细胞碎片，中层包含约 3 mL 微核 （MN），下层包含约 39 mL 细胞核。
5. 去除表面附近的上层 3 mL 液体，并从中间层收集 3 mL 未纯化的微核，用于第二个蔗糖密度梯度。

5. 通过 蔗糖密度梯度对 MN 进行二次纯化

1. 准备蔗糖密度梯度：
   1. 将 3 mL 的 1.8 M 蔗糖缓冲液（表 3， 补充文件 1）添加到 15 mL 锥形管的底部。
   2. 在 1.8 M 蔗糖缓冲液上加入 3 mL 1.5 M 蔗糖缓冲液（表 6， 补充文件 1）。
   3. 最后，在 1.5 M 蔗糖缓冲液上加入 3 mL 1.4 M 蔗糖缓冲液（表 7， 补充文件 1）。
      注：将移液器的尖端靠在锥形管的顶部内侧，然后缓慢移液溶液。
2. 将 3 mL 中间层从第二个蔗糖密度梯度缓慢移液到三层蔗糖密度梯度的顶部。
   注意：慢慢添加图层以避免混合。
3. 将试管在水平转子离心机中，在 4 °C 下以 500 × g 离心 20 分钟。
   注意：离心后，上层将包含 1-4 mL 纯化的微核 （MN），下层将主要包含 8 mL 的细胞核。
4. 保留上层 1-4 mL 纯化的微核以备后用。

6. MN 的识别

1. 取未纯化的微核溶液（在步骤 4 中获得）和纯化的微核溶液（在步骤 5 中获得），并在载玻片上制备细胞涂片。
2. 加入 4% 多聚甲醛溶液，在室温 （RT） 下将样品固定 15 分钟。
3. 用 PBS （0.01 M） 洗涤载玻片两次，每次洗涤 3 分钟。
4. 加入 0.1% Triton X-100 以在 RT 下透化细胞 5 分钟。
5. 在 RT 下用 5% BSA 封闭细胞 30 分钟。
6. 添加抗 γ-H2AX 的一抗（用 5% BSA 稀释，1：200）并在室温下孵育 1 小时。
7. 用 PBS （0.01 M） 洗涤载玻片两次，每次洗涤 5 分钟。
8. 加入二抗（用 5% BSA 稀释，1：500）并在 RT 下避光孵育 1 小时。
9. 加入 DAPI 染料溶液并在 RT 下孵育 15 分钟。
10. 用 PBS （0.01 M） 洗涤载玻片两次，每次洗涤 3 分钟。
11. 在载玻片上涂抹密封溶液以密封它。
12. 在荧光显微镜下观察荧光（放大倍数：400×，自动对焦和自动曝光），并使用细胞计数板对微核进行计数。
    注：用 PBS （0.01 M） 稀释 4% 多聚甲醛、0.1% Triton X-100 和 5% BSA。γ-H2AX （Gamma H2AX） 是组蛋白 H2AX 蛋白的磷酸化形式，在 DNA 损伤后形成。在细胞核中，组蛋白 H2AX 的磷酸化集中在某些区域，因此抗 γ-H2AX 荧光可能会出现斑点状。组蛋白 H2AX 的磷酸化集中在微核中，导致整体荧光更亮，具有不同的斑点³⁶。DAPI 是一种与 DNA 结合较强的荧光染料，常用于荧光显微镜检查。由于微核含有断裂的 DNA 和组蛋白片段，因此可以用抗 γ-H2AX 荧光抗体和 DAPI 对其进行染色。荧光将指示微核的数量、大小和完整性，有助于将它们与细胞核区分开来并评估纯化效果³²。

结果

辐射暴露后，人外周血与 RPMI-1640 孵育 60 h，然后加入细胞松弛素 B 用于微核 （MN） 制备。使用淋巴细胞分离溶液分离淋巴细胞，然后用特殊配置的细胞裂解物裂解并在玻璃匀浆器中温和匀浆。将匀浆与 1.8 M 蔗糖缓冲液以 1：1 混合。在第一次蔗糖密度梯度离心后获得未纯化的微核，在第二次蔗糖密度梯度离心后获得纯化的微核（图 1）。

讨论

在该方法中，使用辐照的人外周血淋巴细胞分离和纯化微核 （MNs）。许多以前的研究已经报道了 MNs^{4、32、33、34} 的细胞裂解和初级分离的详细步骤。细胞裂解液通常包括 0.1% NP-40 以破坏细胞膜，同时对核膜的影响最小，从而保持细胞核和 MN 的完整性。值得注意的是，裂解物?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tube	Thermo	339650
4% paraformaldehyde solution	Beyotime	P0099
50 mL conical tube	Thermo	339652
Anti-γ-H2AX antibody	Bioss	bsm-52163R
Bovine serum albumin	Beyotime	ST023
Calcium chloride	Biosharp	BS249
Cytochalasin B	Macklin	14930-96-2
DAPI dyeing solution	Bioss	S0001
Dithiothreitol (DTT)	Coolaber	CD4941
EDTA	Biosharp	BS107	Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
Fluorescence microscope	Nikon	Ti2-U
Homogenizer	Ybscience	YB101103-1(20 mL)
Horizontal controlled temperature centrifuge	Thermo	Sorvall ST1R plus	Brake speed is set to "5"
Human lymphocyte separation solution	Beyotime	C0025
Magnesium acetate	Macklin	M833330
NP-40	Coolaber	SL9320	10% solution
Phosphate buffer solution(PBS)	HyClone	SH30256.01B
Protease inhibitors	Coolaber	SL1086	Cocktail (100×)
Secondary antibody	Bioss	Bs-0295G	Goat Anti-Rabbit IgG H&L/FITC
Spermidine	Coolaber	CS10431
Spermine	Coolaber	CS10441
Sucrose	Coolaber	CS10581
Tris-HCl	Biosharp	BS157
Triton X-100	Beyotime	P0096