Экстракция и идентификация микроядер из лимфоцитов периферической крови человека

Резюме

В этом протоколе описан метод извлечения и очистки микроядер из лимфоцитов человека с помощью центрифугирования градиента плотности сахарозы. Он обеспечивает экспериментальную основу для исследования состава и функции микроядер.

Аннотация

Микроядро (МН) — это аномальная ядерная структура, которая образуется в клетках, особенно в клетках костного мозга или крови, при воздействии внешних повреждений, таких как радиация, из-за неразрешенного повреждения ДНК или митотических ошибок. После образования МН могут активно участвовать в различных канцерогенных процессах, включая воспалительную сигнализацию и хромосомные генетические перестройки. МН содержат ядерную ДНК, гистоны, фрагменты нуклеопротеинов и другие активные белки, которые тесно связаны с их функциями. Изучение образования и компонентов МН имеет решающее значение для понимания их роли в управлении канцерогенными процессами. Извлечение и очистка МН имеют важное значение для достижения этих исследовательских целей. Однако нестабильность ядерной мембраны MN и ее подверженность разрыву делают эти процессы технически сложными. В настоящее время только в нескольких исследованиях сообщалось об использовании центрифугирования с градиентом плотности для разделения MN. Данное исследование обобщает и упрощает процессы разделения и очистки MN. Лимфоциты периферической крови человека, подвергшиеся воздействию радиации, изолировали, а МН отделили и очистили с помощью буферов сахарозы разной концентрации в двухступенчатом процессе. Целостность и чистота МН были проверены, что обеспечило четкую и практическую демонстрацию экспериментальной процедуры для исследователей, изучающих причины и функции МН.

Введение

Микроядро (МН) — субклеточная структура цитоплазмы, содержащая ядерную ДНК, гистоны и фрагменты нуклеопротеинов, окруженная мембранными структурами ^1,2. MN полностью отделен от основного ядра и обычно появляется рядом с ним в овальной или круглой форме, с размером от 1/16 до 1/3 диаметра основного ядра. Образование МН в первую очередь связано с ацентрическими фрагментами хромосом, хромосомной миссегрегацией, разрывом дицентрической хромосомы, нестабильностью хромосом и агрегацией двойных минут (ДБ)³. МН редко встречаются в здоровых клетках и вызваны преимущественно воздействием экзогенных генотоксинов, что приводит к повреждению ДНК или митотическим ошибкам ^4,5. Радиационное повреждение является значительным фактором образования МН, и воздействие ионизирующего излучения (ИК) на человека увеличивается с развитием клинических и технологических применений ^6,7. Инфракрасное воздействие вызывает одноцепочечные разрывы (SSB) и двухцепочечные разрывы (DSB) в клеточной ДНК, что может привести к гибели клеток или апоптозу ^8,9,10. МН — это фрагменты хромосом, целых хромосом или хроматид, образующиеся в результате неотремонтированной или несоответствующей репарации DSB. Они служат критическими индикаторами степени ущерба, нанесенного ИК ^7,11,12. Всестороннее понимание компонентов МН имеет важное значение для смягчения побочных эффектов лучевой терапии и минимизации воздействия нежелательного излучения^{на население 6,13}. Тем не менее, белки и нуклеиновые кислоты, содержащиеся в МН, до сих пор остаются не полностью охарактеризованными.

Считается, что МН возникают в результате индукции различных типов повреждений ДНК. Их механизмы репликации и способности к восстановлению ДНК нарушаются, что приводит к обширному повреждению ДНК в течение короткого периода^{времени 3,14,15}. МН также являются важными индикаторами хромосомной нестабильности, которая неизменно присутствует в предраковых клетках 3,14,16,17,18,19. МН уже давно используются в качестве биомаркеров генотоксичности, риска развития опухолей и степени^{злокачественности опухоли 3,20,21}. После образования МН могут активно управлять многочисленными канцерогенными процессами, включая воспалительную сигнализацию^22,23 и хромосомную генетическую перестройку 24,25,26. Например, МН инициируют воспалительный каскад, рекрутируя рецептор распознавания вирусных образов (PRR) циклическую синтазу GMP-АМФ (cGAS) из цитоплазмы 4,22,23,27. Другие белки, которые могут присутствовать в МН, включают экзонуклеазы²⁸, транскрипционные механизмы⁴ и кофакторы трансляции. Остается неясным, собирают ли МН уникальный, смещенный белковый профиль из библиотеки цитоплазматических белков или пассивно приобретают белки с высоким содержанием из ядра и цитоплазмы во время их формирования. Помимо отдельных белков, таких как cGAS, степень, в которой конкретные среды влияют на общий состав MN, еще не определена. Понимание всего ландшафта микроядер ограничено, нет общедоступных наборов данных для исследования. Таким образом, извлечение полных и очищенных МН крайне необходимо для глубокого и всестороннего анализа их компонентов.

Одной из причин задержки репликации ДНК в МН может быть репликационный стресс, вызванный недостатком ферментов и кофакторов, необходимых для синтеза и репарации ДНК. Этот недостаток может быть результатом дефектной сборки ядерной оболочки MN, что приводит к отсутствию комплекса ядерных пор²⁰. Следовательно, МН не могут импортировать ключевые белки, необходимые для поддержания целостности ядерной мембраны и стабильности генома 2,29,30,31. Неполная ядерная мембрана MN подвержена разрыву, что делает экстракцию MN очень сложной.

В настоящее время МН в основном экстрагируются с помощью центрифугирования с градиентом плотности сахарозы ^27,32,33 и очищаются с помощью проточной цитометрии³⁴. В этом исследовании процесс разделения и очистки МН был обобщен и упрощен. Лимфоциты периферической крови человека, подвергшегося воздействию радиации, были выделены, а МН дважды очищены с использованием буферов сахарозы разной концентрации. Целостность и чистота МН были проверены, что предоставило исследователям практическую и интуитивно понятную экспериментальную демонстрацию для изучения причин и функций МН.

протокол

Все эксперименты с образцами периферической крови человека проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Данное исследование было одобрено Этическим комитетом больницы 416 атомной отрасли, Китай (Обзор 2020 г. [No 48]), и было получено информированное согласие всех участников. Критерии исключения включали лиц с серьезными хроническими заболеваниями, такими как опухоли, подагра или заболевания крови, а также тех, кто подвергался воздействию радиоактивных или генотоксических веществ в своей профессии. Для этого исследования 10 мл периферической крови было собрано у здорового 28-летнего мужчины в пробирку для сбора крови, содержащую гепарин натрия в качестве антикоагулянта. Образец облучали in vitro ⁶⁰Co γ-лучами при 37 °C с использованием стандартного устройства для терапии кинетической энергией гамма-воздуха. Доза облучения была установлена на уровне 4,0 Гр при мощности дозы 0,6350 Гр/мин. После облучения образец инкубировали при 37 °C в течение 2 ч, инокулировали в среду RPMI-1640 и культивировали при 37 °C в течение 60 ч. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в данном исследовании, представлена в Таблице материалов.

1. Получение микроядра и ядра

1. Добавьте цитохалазин B в среду для клеток периферической крови до достижения конечной концентрации 10 мкг/мл. Выдерживать смесь в течение 45 минут при температуре 37 °C.
   Цитохалазин В является ингибитором полимеризации актина, который способствует эффективному отделению микроядер от ядра перед лизисом клетки³⁵.
2. Центрифугируйте клетки крови при 200 × г в течение 5 минут при 4 °C.
3. Ресуспендируйте клетки крови в 10 мл 0,01 М PBS, предварительно охлажденном при 4 °C.

2. Выделение лимфоцитов

1. Добавьте 15 мл раствора для разделения лимфоцитов человека в коническую пробирку объемом 50 мл. Аккуратно нанесите слой взвешенных клеток периферической крови поверх разделительного раствора.
2. Центрифугируйте пробирку при 400 × г в течение 30 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования клетки крови в пробирке разделяются на четыре отдельных слоя сверху донизу: первый слой - это слой плазмы (тромбоциты), второй слой - это слой кольцевых молочно-белых лимфоцитов, третий слой - прозрачный слой разделительной жидкости, а четвертый слой - слой эритроцитов.
3. Осторожно перенесите второй слой (лимфоциты) в отдельную центрифужную пробирку. Добавьте PBS (0,01 M) в три раза больше объема переносимых клеток, хорошо перемешайте и центрифугируйте при 200 × г в течение 10 мин при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки.

3. Лизис лимфоцитов

1. Поместите собранную в коническую трубку клеточную гранулу на лед.
2. Добавьте 6 мл буфера для холодного лизиса (Таблица 1, Дополнительный файл 1) и повторно суспендируйте клеточную гранулу в буфере для лизиса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для лизиса следует дополнить ингредиентами, перечисленными в Таблице 2, Дополнительном файле 1, непосредственно перед использованием.
3. Переложите лизат клеток в стеклянный гомогенизатор.
4. Аккуратно используйте рыхлый помол для ручной гомогенизации образца, перемещая гомогенизатор вверх и вниз 10 раз.
5. Перенесите гомогенизированный лизат клеток обратно в коническую пробирку объемом 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все шаги осторожно и держите образец на льду.

4. Первоначальная изоляция МН с помощью градиента плотности сахарозы

1. Смешайте 5 мл клеточного лизата с равным объемом 1,8 М сахарозного буфера (Таблица 3, Дополнительный файл 1) для получения соотношения лизата и сахарозы 1:1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер сахарозы 1,8 М следует дополнить ингредиентами, перечисленными в Таблице 4, Дополнительном файле 1, непосредственно перед использованием.
2. Приготовьте градиент плотности сахарозы: Добавьте 15 мл буфера сахарозы 1,6 М (Таблица 5, Дополнительный файл 1) на дно конической пробирки объемом 50 мл. Медленно добавьте 20 мл 1,8 М сахарозного буфера (Таблица 3, Дополнительный файл 1) поверх 1,6 М сахарозного буфера.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как 1,6 М буфер сахарозы, так и 1,8 М сахарозный буфер следует дополнять ингредиентами, указанными в Таблице 4, Дополнительном файле 1, соответственно, непосредственно перед использованием. Чтобы добавить буферы сахарозы, приложите кончик пипетки к верхней внутренней стороне конической трубки и медленно пипетируйте раствор.
3. Медленно нанесите пипеткой 10 мл смеси [Lysate 1:1 1,8 M sucrose buffer] поверх двухслойного градиента плотности сахарозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Медленно добавляйте слои, чтобы убедиться, что средний буферный слой 1,8 М не смешивается с нижним буферным слоем 1,6 М, а верхняя смесь лизированных клеток 1:1 и буфера сахарозы 1,8 М не смешивается с буферным слоем 1,8 М.
4. Центрифугируйте пробирку в центрифуге с горизонтальным ротором при давлении 1000 × g в течение 20 мин при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования жидкость разделится на три слоя: верхний слой содержит примерно 3 мл клеточного мусора, средний слой содержит примерно 3 мл микроядер (МН), нижний слой содержит примерно 39 мл ядер.
5. Удалите верхние 3 мл жидкости у поверхности и соберите 3 мл неочищенных микроядер из среднего слоя для второго градиента плотности сахарозы.

5. Вторичная очистка МН с помощью градиента плотности сахарозы

1. Подготовьте градиент плотности сахарозы:
   1. Добавьте 3 мл 1,8 М сахарозного буфера (Таблица 3, Дополнительный файл 1) на дно конической пробирки объемом 15 мл.
   2. Добавьте 3 мл 1,5 М сахарозного буфера (Таблица 6, Дополнительный файл 1) поверх 1,8 М сахарозного буфера.
   3. Наконец, добавьте 3 мл 1,4 М сахарозного буфера (Таблица 7, Дополнительный файл 1) поверх 1,5 М сахарозного буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расположите кончик пипетки напротив верхней внутренней стороны конической трубки и медленно пипетируйте раствор.
2. Медленно пипеткой нанесите 3 мл среднего слоя из второго градиента плотности сахарозы на вершину трехслойного градиента плотности сахарозы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляйте слои медленно, чтобы избежать смешивания.
3. Центрифугируйте пробирку в центрифуге с горизонтальным ротором при давлении 500 × г в течение 20 мин при температуре 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования верхний слой будет содержать 1-4 мл очищенных микроядер (МН), а нижний слой будет содержать в основном 8 мл ядер.
4. Оставьте верхние 1-4 мл очищенных микроядер для последующего использования.

6. Идентификация МН

1. Возьмите неочищенный раствор микроядер (полученный на шаге 4) и очищенный раствор микроядер (полученный на шаге 5) и приготовьте мазки клеток на предметном стекле.
2. Добавьте 4% раствор параформальдегида для фиксации образца при комнатной температуре (RT) в течение 15 минут.
3. Вымойте предметные стекла PBS (0,01 М) дважды, по 3 мин на промывку.
4. Добавьте 0,1% Triton X-100 для проникновения в клетки при RT в течение 5 минут.
5. Заблокируйте клетки в 5% BSA при RT на 30 минут.
6. Добавьте первичное антитело против анти-γ-H2AX (разведенное в 5% BSA, 1:200) и инкубируйте в режиме лучевой терапии в течение 1 ч.
7. Вымойте предметные стекла PBS (0,01 М) дважды, по 5 мин на промывку.
8. Добавьте вторичное антитело (разведенное в 5% BSA, 1:500) и инкубируйте при RT в течение 1 ч в темноте.
9. Добавьте раствор красителя DAPI и инкубируйте при RT в течение 15 минут.
10. Вымойте предметные стекла PBS (0,01 М) дважды, по 3 мин на промывку.
11. Нанесите на предметное стекло герметизирующий раствор, чтобы запечатать его.
12. Наблюдайте за флуоресценцией под флуоресцентным микроскопом (увеличение: 400×, автофокус и автоэкспозиция) и подсчитывайте микроядра с помощью планшета для подсчета клеток.
    Примечание: 4% параформальдегида, 0,1% Triton X-100 и 5% BSA разбавляют PBS (0,01 M). γ-H2AX (Gamma H2AX) представляет собой фосфорилированную форму белка гистона H2AX, образующуюся в ответ на повреждение ДНК. В ядре фосфорилирование гистона H2AX концентрируется в определенных областях, поэтому флуоресценция против γ-H2AX может казаться пятнистой. Фосфорилирование гистона H2AX концентрируется в микроядре, что приводит к общей более яркой флуоресценции с отчетливыми пятнами³⁶. DAPI представляет собой флуоресцентный краситель, который прочно связывается с ДНК и часто используется во флуоресцентной микроскопии. Поскольку микроядра содержат разрушенные фрагменты ДНК и гистонов, они могут быть окрашены флуоресцентными антителами против γ-H2AX и DAPI. Флуоресценция покажет количество, размер и полноту микроядер, помогая отличить их от ядер и^{оценить эффективность очистки}.

Результаты

После облучения периферическую кровь человека инкубировали с RPMI-1640 в течение 60 ч, а затем добавляли цитохалазин В для получения микроядер (МН). Лимфоциты выделяли с помощью раствора для разделения лимфоцитов с последующим лизисом специально сконфигурированным клето?...

Обсуждение

В этом методе для выделения и очистки микроядер (МН) использовались облученные лимфоциты периферической крови человека. Во многих предыдущих исследованиях сообщалось о подробных этапах лизиса клеток и первичного разделения MNs 4,32,33,34.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tube	Thermo	339650
4% paraformaldehyde solution	Beyotime	P0099
50 mL conical tube	Thermo	339652
Anti-γ-H2AX antibody	Bioss	bsm-52163R
Bovine serum albumin	Beyotime	ST023
Calcium chloride	Biosharp	BS249
Cytochalasin B	Macklin	14930-96-2
DAPI dyeing solution	Bioss	S0001
Dithiothreitol (DTT)	Coolaber	CD4941
EDTA	Biosharp	BS107	Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
Fluorescence microscope	Nikon	Ti2-U
Homogenizer	Ybscience	YB101103-1(20 mL)
Horizontal controlled temperature centrifuge	Thermo	Sorvall ST1R plus	Brake speed is set to "5"
Human lymphocyte separation solution	Beyotime	C0025
Magnesium acetate	Macklin	M833330
NP-40	Coolaber	SL9320	10% solution
Phosphate buffer solution(PBS)	HyClone	SH30256.01B
Protease inhibitors	Coolaber	SL1086	Cocktail (100×)
Secondary antibody	Bioss	Bs-0295G	Goat Anti-Rabbit IgG H&L/FITC
Spermidine	Coolaber	CS10431
Spermine	Coolaber	CS10441
Sucrose	Coolaber	CS10581
Tris-HCl	Biosharp	BS157
Triton X-100	Beyotime	P0096