Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחילוץ וטיהור מיקרו-גרעינים מלימפוציטים אנושיים באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות סוכרוז. הוא מספק בסיס ניסיוני לחקירת ההרכב והתפקוד של מיקרו-גרעינים.

Abstract

מיקרו-גרעין (MN) הוא מבנה גרעיני לא תקין הנוצר בתאים, במיוחד במח העצם או בתאי דם, כאשר הם נחשפים לנזק חיצוני, כגון קרינה, עקב נזק לא פתור ל-DNA או שגיאות מיטוטיות. לאחר היווצרותם, MNs יכולים לתרום באופן פעיל לתהליכים מסרטנים שונים, כולל איתות דלקתי וסידורים גנטיים כרומוזומליים. MNs מכילים DNA גרעיני, היסטונים, שברי נוקלאופרוטאין וחלבונים פעילים אחרים, הקשורים קשר הדוק לתפקודיהם. חקר היווצרותם ומרכיביהם של MNs הוא חיוני להבנת תפקידם בהנעת תהליכים מסרטנים. מיצוי וטיהור של MNs חיוניים להשגת יעדי מחקר אלה. עם זאת, חוסר היציבות של הממברנה הגרעינית MN ורגישותה לקרע הופכים את התהליכים הללו למאתגרים מבחינה טכנית. נכון לעכשיו, רק מחקרים מעטים דיווחו על שימוש בצנטריפוגה של שיפוע צפיפות להפרדת MN. מחקר זה מסכם ומפשט את תהליכי ההפרדה והטיהור של MN. בודדו לימפוציטים בדם היקפי אנושי שנחשפו לקרינה, ו-MNs הופרדו וטוהרו באמצעות חוצצי סוכרוז בריכוזים שונים בתהליך דו-שלבי. השלמות והטוהר של ה-MNs אומתו, וסיפקו הדגמה ברורה ומעשית של הליך הניסוי לחוקרים החוקרים את הגורמים והתפקודים של MNs.

Introduction

המיקרו-גרעין (MN) הוא מבנה תת-תאי בציטופלזמה המכיל DNA גרעיני, היסטונים ושברי נוקלאופרוטאין, המוקפים במבני ממברנה 1,2. ה-MN נפרד לחלוטין מהגרעין הראשי ומופיע בדרך כלל בקרבתו בצורה אליפסה או מעגלית, עם גודל שנע בין 1/16 ל-1/3 מקוטר הגרעין הראשי. היווצרות MNs קשורה בעיקר לשברי כרומוזומים א-צנטריים, מיסגרגציה כרומוזומלית, שבירת כרומוזומים דיצנטרית, חוסר יציבות כרומוזומלית וצבירה של דקות כפולות (DBs)3. MNs מתרחשים לעתים רחוקות בתאים בריאים ונגרמים בעיקר מחשיפה לגנוטוקסינים אקסוגניים, מה שמוביל לנזק ל-DNA או לטעויות מיטוטיות 4,5. נזקי קרינה הם תורם משמעותי להיווצרות MN, וחשיפה אנושית לקרינה מייננת (IR) גדלה עם התקדמות ביישומים קליניים וטכנולוגיים 6,7. חשיפה ל-IR גורמת לשבירות חד-גדיליות (SSBs) ושבירות דו-גדיליות (DSBs) ב-DNA התאי, מה שעלול לגרום למוות תאים או לאפופטוזיס 8,9,10. MNs הם שברים של כרומוזומים, כרומוזומים שלמים או כרומטידים המיוצרים עקב תיקון DSB לא מתוקן או לא תואם. הם משמשים כאינדיקטורים קריטיים למידת הנזק שנגרם על ידי IR 7,11,12. הבנה מקיפה של הרכיבים בתוך MNs חיונית להפחתת תופעות הלוואי של טיפול בקרינה ולמזעור חשיפת הציבור לקרינה לא רצויה 6,13. עם זאת, החלבונים וחומצות הגרעין הכלולים ב-MNs נותרו מאופיינים באופן חלקי עד היום.

מאמינים כי MNs נובעים מאינדוקציה של סוגים שונים של נזק ל-DNA. מנגנוני השכפול ויכולות תיקון ה-DNA שלהם נפגעים, מה שמוביל לנזק נרחב ל-DNA תוך תקופה קצרה 3,14,15. MNs הם גם אינדיקטורים חשובים לחוסר יציבות כרומוזומלית, הקיימת באופן עקבי בתאים טרום סרטניים 3,14,16,17,18,19. MNs שימשו זה מכבר כסמנים ביולוגיים לרעילות גנומית, סיכון לגידול ודרגת גידול 3,20,21. לאחר היווצרותם, MNs יכולים להניע באופן פעיל תהליכים מסרטנים רבים, כולל איתות דלקתי22,23 וסידור מחדש גנטי כרומוזומלי 24,25,26. לדוגמה, MNs יוזמים מפל דלקתי על ידי גיוס קולטן זיהוי דפוס ויראלי (PRR) סינתאז GMP-AMP מחזורי (cGAS) מהציטופלזמה 4,22,23,27. חלבונים אחרים שעשויים להיות נוכחים ב-MNs כוללים אקסונוקלאזים28, מנגנוני שעתוק4 וקופקטורים תרגום. עדיין לא ברור אם MNs מרכיבים פרופיל חלבון ייחודי ומוטה מספריית החלבונים הציטופלזמיים או רוכשים באופן פסיבי חלבונים בשפע גבוה מהגרעין והציטופלזמה במהלך היווצרותם. מעבר לחלבונים בודדים כגון cGAS, המידה שבה סביבות ספציפיות משפיעות על הרכב ה-MN הכולל עדיין לא נקבעה. ההבנה של כל נוף המיקרו-גרעינים מוגבלת, ללא מערכי נתונים זמינים לציבור לחקירה. לכן, יש צורך בדחיפות במיצוי MNs שלמים ומטוהרים לניתוחים מעמיקים ומקיפים של מרכיביהם.

אחת הסיבות לעיכוב בשכפול ה-DNA ב-MNs עשויה להיות מתח שכפול הנגרם על ידי מחסור באנזימים וקופקטורים הנדרשים לסינתזה ותיקון DNA. מחסור זה עשוי לנבוע מהרכבה לקויה של המעטפת הגרעינית של MN, מה שמוביל להיעדר קומפלקס נקבוביות גרעיניות20. כתוצאה מכך, MNs אינם מסוגלים לייבא חלבוני מפתח החיוניים לשמירה על שלמות הממברנה הגרעינית ויציבות הגנום 2,29,30,31. הממברנה הגרעינית הלא שלמה של MN נוטה להיקרע, מה שהופך את מיצוי ה-MN למאתגרת ביותר.

נכון לעכשיו, MNs מופקים בעיקר באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות סוכרוז 27,32,33 ומטוהרים על ידי זרימה ציטומטרית 34. במחקר זה, תהליך ההפרדה והטיהור של MNs סוכם ופשט. בודדו לימפוציטים בדם היקפי מבני אדם שנחשפו לקרינה, ו-MNs טוהרו פעמיים באמצעות חוצצי סוכרוז בריכוזים שונים. השלמות והטוהר של ה-MNs אומתו, וסיפקו לחוקרים הדגמה ניסויית מעשית ואינטואיטיבית לחקר הגורמים והתפקודים של MNs.

Protocol

כל הניסויים שכללו דגימות דם היקפיות אנושיות נערכו בהתאם להנחיות ולתקנות הרלוונטיות. מחקר זה אושר על ידי הוועדה האתית של בית החולים 416 לתעשייה גרעינית בסין (סקירת 2020 [מס' 48]), והתקבלה הסכמה מדעת מכל המשתתפים. קריטריוני ההחרגה כללו אנשים עם מחלות כרוניות עיקריות, כגון גידולים, גאוט או הפרעות דם, כמו גם כאלה שנחשפו לחומרים רדיואקטיביים או גנוטוקסיים במקצועם. לצורך מחקר זה, 10 מ"ל של דם היקפי נאספו מגבר בריא בן 28 לתוך צינור איסוף דם המכיל נתרן הפרין כנוגד קרישה. הדגימה הוקרנה במבחנה עם 60קרני Co γ ב-37 מעלות צלזיוס באמצעות מכשיר סטנדרטי ברמה טיפולית של אנרגיה קינטית גמא אוויר. מינון ההקרנה הוגדר ל-4.0 Gy, עם קצב מינון של 0.6350 Gy/min. לאחר ההקרנה, הדגימה הודגרה ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, חוסנה למדיום RPMI-1640 ותרבית ב-37 מעלות צלזיוס למשך 60 שעות. פרטים על הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מסופקים בטבלת החומרים.

1. הכנת מיקרוגרעין וגרעין

  1. הוסף ציטוכלזין B למדיום תאי הדם ההיקפי כדי להשיג ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל. דוגרים על התערובת למשך 45 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: ציטוכלזין B הוא מעכב פילמור אקטין המאפשר הפרדה יעילה של מיקרו-גרעינים מהגרעין לפני ליזה של תאים35.
  2. צנטריפוגה של תאי הדם בטמפרטורה של 200 × גרם למשך 5 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
  3. השעו מחדש את תאי הדם ב-10 מ"ל של 0.01 M PBS מקוררים מראש ב-4 מעלות צלזיוס.

2. בידוד לימפוציטים

  1. הוסף 15 מ"ל של תמיסת הפרדת לימפוציטים אנושיים לצינור חרוטי של 50 מ"ל. שכבו בזהירות את תאי הדם ההיקפיים התלויים על גבי תמיסת ההפרדה.
  2. צנטריפוגה את הצינור ב-400 × גרם למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
    הערה: לאחר הצנטריפוגה, תאי הדם בצינור ייפרדו לארבע שכבות נפרדות מלמעלה למטה: השכבה הראשונה היא שכבת הפלזמה (טסיות דם), השכבה השנייה היא שכבת הלימפוציטים הלבנים החלביים הטבעתיים, השכבה השלישית היא שכבת נוזל ההפרדה השקוף, והשכבה הרביעית היא שכבת תאי הדם האדומים.
  3. העבירו בזהירות את השכבה השנייה (לימפוציטים) לצינור צנטריפוגה נפרד. מוסיפים PBS (0.01 מ') בנפח פי שלושה מנפח התאים המועברים, מערבבים היטב וצנטריפוגה ב-200 × גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט בעזרת פיפטה.

3. ליזיס של לימפוציטים

  1. הניחו את כדור התא שנאסף בצינור החרוטי על קרח.
  2. הוסף 6 מ"ל של מאגר ליזיס קר (טבלה 1, משלים file 1) והשהה מחדש את גלולת התא במאגר הליזיס.
    הערה: יש להשלים את מאגר הליזיס עם המרכיבים המפורטים בטבלה 2, משלים file 1, מיד לפני השימוש.
  3. העבירו את ליזט התא להומוגנייזר זכוכית.
  4. השתמש בעדינות בטחינה רופפת כדי להומוגניזציה ידנית של הדגימה על ידי הזזת ההומוגנייזר למעלה ולמטה 10 פעמים.
  5. העבר את ליזט התא ההומוגני בחזרה לצינור החרוטי של 50 מ"ל.
    הערה: בצע את כל השלבים בעדינות ושמור את הדגימה על קרח.

4. בידוד ראשוני של MNs באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז

  1. מערבבים 5 מ"ל של ליזאט התא עם נפח שווה של 1.8 M מאגר סוכרוז (טבלה 3, קובץ משלים 1) כדי להשיג יחס של 1:1 של ליזאט למאגר סוכרוז.
    הערה: יש להשלים את מאגר הסוכרוז 1.8M עם המרכיבים המפורטים בטבלה 4, קובץ משלים 1, מיד לפני השימוש.
  2. הכן את שיפוע צפיפות הסוכרוז: הוסף 15 מ"ל של מאגר סוכרוז 1.6 M (טבלה 5, משלים file 1) לתחתית צינור חרוטי של 50 מ"ל. הוסף לאט לאט 20 מ"ל של מאגר סוכרוז 1.8 M (טבלה 3, קובץ משלים 1) על גבי מאגר הסוכרוז של 1.6 M.
    הערה: יש להוסיף גם את מאגר הסוכרוז של 1.6 M וגם את מאגר הסוכרוז של 1.8 M עם המרכיבים בטבלה 4, קובץ משלים 1, בהתאמה, מיד לפני השימוש. כדי להוסיף את מאגרי הסוכרוז, הנח את קצה הפיפטה כנגד הצד הפנימי העליון של הצינור החרוטי ופיפטה לאט את התמיסה.
  3. פיפטה לאט 10 מ"ל מתערובת [מאגר סוכרוז ליזאט 1:1 1.8 מ'] על גבי שיפוע צפיפות הסוכרוז הדו-שכבתי.
    הערה: הוסף את השכבות לאט כדי להבטיח ששכבת החיץ האמצעית של 1.8 M לא תתערבב עם שכבת החיץ התחתונה של 1.6 M, והתערובת העליונה של 1:1 של תאים ליזים ומאגר סוכרוז 1.8 M לא תתערבב עם שכבת החיץ של 1.8 M.
  4. צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגת רוטור אופקית בטמפרטורה של 1000 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: לאחר הצנטריפוגה, הנוזל ייפרד לשלוש שכבות: השכבה העליונה מכילה כ-3 מ"ל של פסולת תאים, השכבה האמצעית מכילה כ-3 מ"ל מיקרו-גרעינים (MNs), השכבה התחתונה מכילה כ-39 מ"ל גרעינים.
  5. הסר את 3 מ"ל הנוזל העליונים ליד פני השטח ואסוף את 3 מ"ל המיקרו-גרעינים הלא מטוהרים מהשכבה האמצעית עבור שיפוע צפיפות הסוכרוז השני.

5. טיהור משני של MNs באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז

  1. הכן את שיפוע צפיפות הסוכרוז:
    1. הוסף 3 מ"ל של מאגר סוכרוז 1.8 M (טבלה 3, קובץ משלים 1) לתחתית צינור חרוטי של 15 מ"ל.
    2. הוסף 3 מ"ל של מאגר סוכרוז של 1.5 M (טבלה 6, קובץ משלים 1) על גבי מאגר הסוכרוז של 1.8 M.
    3. לבסוף, הוסף 3 מ"ל של מאגר סוכרוז של 1.4 M (טבלה 7, קובץ משלים 1) על גבי מאגר הסוכרוז של 1.5 M.
      הערה: מקם את קצה הפיפטה כנגד הצד הפנימי העליון של הצינור החרוטי והעבר לאט את התמיסה.
  2. פיפטה לאט 3 מ"ל מהשכבה האמצעית משיפוע צפיפות הסוכרוז השני על החלק העליון של שיפוע צפיפות הסוכרוז התלת-שכבתי.
    הערה: הוסף את השכבות לאט כדי למנוע ערבוב.
  3. צנטריפוגה את הצינור בצנטריפוגת רוטור אופקית בטמפרטורה של 500 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: לאחר הצנטריפוגה, השכבה העליונה תכיל 1-4 מ"ל של מיקרו-גרעינים מטוהרים (MN), והשכבה התחתונה תכיל בעיקר 8 מ"ל גרעינים.
  4. שמור את 1-4 מ"ל העליונים של מיקרו-גרעינים מטוהרים לשימוש מאוחר יותר.

6. זיהוי MNs

  1. קחו את תמיסת המיקרו-גרעין הלא מטוהרת (שהושגה בשלב 4) ואת תמיסת המיקרו-גרעין המטוהרת (המתקבלת בשלב 5) והכינו מריחות תאים על השקופית.
  2. הוסף תמיסת פרפורמלדהיד של 4% כדי לתקן את הדגימה בטמפרטורת החדר (RT) למשך 15 דקות.
  3. שטפו את השקופיות עם PBS (0.01 מ ') פעמיים, 3 דקות לכל כביסה.
  4. הוסף 0.1% טריטון X-100 כדי לחדור לתאים ב-RT למשך 5 דקות.
  5. חסום את התאים ב-5% BSA ב-RT למשך 30 דקות.
  6. הוסף את הנוגדן העיקרי נגד anti-γ-H2AX (מדולל ב-5% BSA, 1:200) ודגר ב-RT למשך שעה.
  7. שטפו את המגלשות עם PBS (0.01 מ ') פעמיים, 5 דקות לכל כביסה.
  8. הוסיפו את הנוגדן המשני (מדולל ב-5% BSA, 1:500) ודגרו ב-RT למשך שעה אחת בחושך.
  9. הוסף תמיסת צבע DAPI ודגר ב-RT למשך 15 דקות.
  10. שטפו את השקופיות עם PBS (0.01 מ ') פעמיים, 3 דקות לכל כביסה.
  11. מרחו תמיסת איטום על השקופית כדי לאטום אותה.
  12. התבונן בפלואורסצנטיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי (הגדלה: 400×, פוקוס אוטומטי וחשיפה אוטומטית), וספור את המיקרו-גרעינים באמצעות לוחית ספירת תאים.
    הערה: 4% פרפורמלדהיד, 0.1% טריטון X-100 ו-5% BSA מדוללים ב-PBS (0.01 M). γ-H2AX (Gamma H2AX) הוא צורה זרחנית של חלבון היסטון H2AX, שנוצר בתגובה לנזק ל-DNA. בגרעין, הזרחן של היסטון H2AX מרוכז באזורים מסוימים, כך שהפלואורסצנציה נגד γ-H2AX עשויה להיראות נקודתית. הזרחן של היסטון H2AX מרוכז במיקרו-גרעין, וכתוצאה מכך פלואורסצנטיות בהירה יותר עם כתמים מובהקים36. DAPI הוא צבע פלואורסצנטי שנקשר חזק ל-DNA ומשמש לעתים קרובות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית. מכיוון שמיקרו-גרעינים מכילים שברי DNA שבור ושברי היסטון, הם יכולים להיות מוכתמים על ידי נוגדנים פלואורסצנטיים נגד γ-H2AX ו-DAPI. הקרינה תציין את מספרם, גודלם ושלמותם של המיקרו-גרעינים, ותעזור להבדיל ביניהם לבין הגרעינים ולהעריך את יעילות הטיהור32.

תוצאות

לאחר חשיפה לקרינה, דם היקפי אנושי הודגר עם RPMI-1640 למשך 60 שעות, ולאחר מכן נוסף ציטוכלזין B להכנת מיקרו-גרעין (MN). לימפוציטים בודדו באמצעות תמיסת הפרדת לימפוציטים, ואחריה ליזה עם ליזאט תאים שהוגדר במיוחד והומוגניזציה עדינה בהומוגנייזר זכוכית. ההומוגנאט היה מעורבב 1:1 עם מאגר ס...

Discussion

בשיטה זו נעשה שימוש בלימפוציטים של דם היקפי אנושי מוקרן לבידוד וטיהור של מיקרו-גרעינים (MNs). מחקרים קודמים רבים דיווחו על השלבים המפורטים לליזה תאית והפרדה ראשונית של MNs 4,32,33,34. תמיסת הליזיס של התאים כו?...

Disclosures

ללא.

Acknowledgements

כל הדמויות נוצרו על ידי המחברים באמצעות משרד WPS. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן למדעי הטבע של המכללה הרפואית צ'נגדו (CYZ19-38), ותוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (2024NSFSC0592).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tubeThermo339650
4% paraformaldehyde solutionBeyotimeP0099
50 mL conical tubeThermo339652
Anti-γ-H2AX antibodyBiossbsm-52163R
Bovine serum albuminBeyotimeST023
Calcium chlorideBiosharpBS249
Cytochalasin BMacklin14930-96-2
DAPI dyeing solutionBiossS0001
Dithiothreitol (DTT)CoolaberCD4941
EDTABiosharpBS107Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
Fluorescence microscopeNikonTi2-U
HomogenizerYbscienceYB101103-1(20 mL)
Horizontal controlled temperature centrifugeThermoSorvall ST1R plusBrake speed is set to "5"
Human lymphocyte separation solutionBeyotimeC0025
Magnesium acetateMacklinM833330
NP-40CoolaberSL932010% solution
Phosphate buffer solution(PBS)HyCloneSH30256.01B
Protease inhibitorsCoolaberSL1086Cocktail (100×)
Secondary antibodyBiossBs-0295GGoat Anti-Rabbit IgG H&L/FITC
SpermidineCoolaberCS10431
SpermineCoolaberCS10441
SucroseCoolaberCS10581
Tris-HClBiosharpBS157
Triton X-100BeyotimeP0096

References

  1. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154, 47-60 (2013).
  2. Liu, S., Kwon, M., Mannino, N. Nuclear envelope assembly defects link mitotic errors to chromothripsis. Nature. 561, 551-555 (2018).
  3. Sommer, S., Buraczewska, I., Kruszewski, M. Micronucleus assay: The state of art, and future directions. Int J Mol Sci. 21 (4), 1534 (2020).
  4. MacDonald, K. M., et al. Antecedent chromatin organization determines cGAS recruitment to ruptured micronuclei. Nat. Commun. 14, 556 (2023).
  5. Abdisalaam, S., Mukherjee, S., Bhattacharya, S. NBS1-CtIP–mediated DNA end resection suppresses cGAS binding to micronuclei. Nucleic Acids Res. 50, 2681-2699 (2022).
  6. Li, L., Kim, H. S., Kwon, S. W. Inhibitory effects of saeu-jeot extract on NLRP3 inflammasome activation and radiation-induced micronucleus formation. Food Sci Nutr. 10 (6), 1921-1927 (2022).
  7. Qian, Q. Z., Cao, X., Ke, F. H., Shen, Effects of ionising radiation on micronucleus formation and chromosomal aberrations in Chinese radiation workers. Radiat Prot Dosimetry. 168 (2), 197-203 (2016).
  8. Rzeszowska-Wolny, J., Przybyszewski, W. M., Widel, M. Ionizing radiation-induced bystander effects, potential targets for modulation of radiotherapy. Eur J Pharmacol. 625 (1-3), 156-164 (2009).
  9. Zuo, Y. H., Dang, X. H., Zhang, H. F. Genomic instability induced by ionizing radiation in human hepatocytes. J Toxicol Environ Health A. 75 (12), 700-706 (2012).
  10. Eken, A., Aydin, A., Erdem, O. Cytogenetic analysis of peripheral blood lymphocytes of hospital staff occupationally exposed to low doses of ionizing radiation. Toxicol Ind Health. 26 (5), 273-280 (2010).
  11. Gutierrez-Enriquez, S., Ramon, Y. C. T., Alonso, C. Ionizing radiation or mitomycin-induced micronuclei in lymphocytes of BRCA1 or BRCA2 mutation carriers. Breast Cancer Res Treat. 127 (3), 611-622 (2011).
  12. Brzozowska, K., et al. Effect of temperature during irradiation on the level of micronuclei in human peripheral blood lymphocytes exposed to X-rays and neutrons. Int J Radiat Biol. 85 (10), 891-899 (2009).
  13. Yamini, K., Gopal, V. Natural radioprotective agents against ionizing radiation-an overview. Int J PharmTech Res. 2 (2), 1421-1426 (2010).
  14. Terradas, M., Martín, M., Genescà, A. Impaired nuclear functions in micronuclei results in genome instability and chromothripsis. Arch Toxicol. 90, 2657-2667 (2016).
  15. Crasta, K., Ganem, N. J., Dagher, R. DNA breaks and chromosome pulverization from errors in mitosis. Nature. 482, 53-58 (2012).
  16. Fenech, M., Morley, A. Measurement of micronuclei in lymphocytes. Mutat Res. 147, 29-36 (1985).
  17. Kirsch-Volders, M., Bonassi, S., Knasmueller, S. Commentary: Critical questions, misconceptions and a road map for improving the use of the lymphocyte cytokinesis-block micronucleus assay for in vivo biomonitoring of human exposure to genotoxic chemicals-a HUMN project perspective. Mutat Res Rev Mutat Res. 759, 49-58 (2014).
  18. Fenech, M., et al. Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis. 26, 125-132 (2011).
  19. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nat Protoc. 2, 1084-1104 (2007).
  20. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay evolution into a more comprehensive method to measure chromosomal instability. Genes (Basel). 11 (10), 1203 (2020).
  21. Kwon, M., Leibowitz, M. L., Lee, J. H. Small but mighty: The causes and consequences of micronucleus rupture. Exp Mol Med. 52 (11), 1777-1786 (2020).
  22. Harding, S. M., et al. Mitotic progression following DNA damage enables pattern recognition within micronuclei. Nature. 548, 466-470 (2017).
  23. Mackenzie, K. J., et al. cGAS surveillance of micronuclei links genome instability to innate immunity. Nature. 548, 461-465 (2017).
  24. Tang, S., Stokasimov, E., Cui, Y. Breakage of cytoplasmic chromosomes by pathological DNA base excision repair. Nature. 606, 930-936 (2022).
  25. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  26. Umbreit, N. T., Zhang, C. Z. Z., Lynch, L. D. Mechanisms generating cancer genome complexity from a single cell division error. Science. 368, eaba0712 (2020).
  27. Li, Q. J., Wu, P., Du, Q. J. cGAS-STING, an important signaling pathway in diseases and their therapy. Med Comm. 5 (4), e511 (2024).
  28. Mohr, L., Toufektchan, E., von Morgen, P. ER-directed TREX1 limits cGAS activation at micronuclei. Mol Cell. 81, 724-738.e9 (2021).
  29. Okamoto, A., Utani, K., Shimizu, N. DNA replication occurs in all lamina positive micronuclei, but never in lamina negative micronuclei. Mutagenesis. 27, 323-327 (2012).
  30. Hatch, E. M., Fischer, A. H., Deerinck, T. J. Catastrophic nuclear envelope collapse in cancer cell micronuclei. Cell. 154, 47-60 (2013).
  31. Guo, X., Dai, X., Wu, X. Understanding the birth of rupture-prone and irreparable micronuclei. Chromosoma. 129 (3-4), 181-200 (2020).
  32. MacDonald, K. M., et al. The proteomic landscape of genotoxic stress-induced micronuclei. Molecular Cell. 84 (7), 1377-1391.e6 (2024).
  33. Agustinus, A. S., Al-Rawi, D., Dameracharla, B. Epigenetic dysregulation from chromosomal transit in micronuclei. Nature. 619 (7968), 176-183 (2023).
  34. Toufektchan, E., Maciejowski, J. Purification of micronuclei from cultured cells by flow cytometry. STAR Protoc. 2 (1), 100378 (2021).
  35. Shimizu, N., Kanda, T., Wahl, G. M. Selective capture of acentric fragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat Genet. 12, 65 (1996).
  36. Samur, B. M., et al. Assessment of extracorporeal photopheresis related cell damage. Transfus Apher Sci. 61 (6), 103472 (2022).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE217

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved