JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يؤدي إساءة استخدام الكحول إلى إضعاف مناعة البلاعم السنخية (AM) بسبب تنفس الميتوكوندريا المكبوت والطاقة الحيوية. لقد أظهرنا مؤخرا أن التعرض للإيثانول (EtOH) يزيد من اعتماد الجلوتامين على تنفس الميتوكوندريا في AMs. هنا ، يتم توفير طرق لتحديد استخدام الجلوتامين لتنفس الميتوكوندريا في AMs المعالجة ب EtOH باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية.

Abstract

البلاعم السنخية (AMs) هي خط الدفاع الخلوي في مجرى الهواء السفلي ضد مسببات الأمراض. ومع ذلك ، فإن تعاطي الكحول المزمن والمفرط يضعف قدرة AMs على البلعمة وإزالة مسببات الأمراض من الفضاء السنخي ، جزئيا من خلال عدم تنظيم استقلاب الوقود والطاقة الحيوية. أظهر عملنا السابق أن استهلاك الإيثانول المزمن (EtOH) يضعف الطاقة الحيوية للميتوكوندريا ويزيد من مستويات اللاكتات في AMs. علاوة على ذلك ، أظهرنا مؤخرا أن EtOH يزيد من الاعتماد على الجلوتامين والتنفس الأقصى المعتمد على الجلوتامين مع تقليل المرونة ، والتحول بعيدا عن التنفس المعتمد على البيروفات ونحو التنفس المعتمد على الجلوتامين. يعد تحلل الجلوتامينات مسارا تعويضيا مهما لتنفس الميتوكوندريا عند استخدام البيروفات لإنتاج حمض اللاكتيك أو عندما تكون مصادر الوقود الأخرى غير كافية. باستخدام خط خلية AM للفأر ، خلايا MH-S ، التي تعرضت إما لعدم وجود EtOH أو EtOH (0.08٪) لمدة 72 ساعة ، حددنا اعتماد تنفس الميتوكوندريا والطاقة الحيوية على الجلوتامين كمصدر للوقود باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية. تم إجراء تدابير في الوقت الفعلي استجابة ل bis-2- (5-phenylacetamido-1،3،4-thiadiazol-2-yl) كبريتيد الإيثيل (BPTES) ، وهو مثبط للجلوتاميناز 1 ، والذي يمنع التحويل الأنزيمي للجلوتامين إلى غلوتامات ، في مركبة الوسائط أو استجابة للمركبة وحدها ، متبوعا باختبار إجهاد الميتوكوندريا. يصف البروتوكول التفصيلي المقدم هنا أساليبنا وحساباتنا لتحليل متوسط مستويات تنفس الميتوكوندريا القاعدي المعتمد على الجلوتامين ، والتنفس المرتبط ب ATP للميتوكوندريا ، وتنفس الميتوكوندريا الأقصى ، والقدرة التنفسية الاحتياطية للميتوكوندريا عبر العديد من التكرارات البيولوجية والتجريبية.

Introduction

يؤثر اضطراب تعاطي الكحول (AUD) على أكثر من 28 مليون شخص في الولايات المتحدة1. الأشخاص المصابون بالاضطراب الأسترالي أكثر عرضة للإصابة بعدوى الجهاز التنفسي2،3 ، مما يزيد من خطر الإصابة بالأمراض المبكرة والوفيات3،4،5. يزيد إساءة استخدام الكحول من القابلية للإصابة بالتهابات الجهاز التنفسي ، جزئيا من خلال قمع وظيفة المناعة في الرئة. البلاعم السنخية (AMs) هي خط الدفاع الخلوي ضد مسببات الأمراض في الرئة السفلية ، حيث تقوم بلعمة وإزالة الميكروبات المستنشقة. ومع ذلك ، فإن استهلاك الكحول المزمن يضعف قدرة AMs على ابتلاع ومسببات الأمراضوقتلها 6،7.

الوظائف المناعية ل AMs ، مثل البلعمة ، هي عمليات تتطلب الطاقة وتتطلب مسارات نشطة من الناحية الأيضية ضرورية لتوليد ثلاثي الفوسفات الأدينوسين (ATP). الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا هي العملية الخلوية الأكثر كفاءة لإنتاج ATP ، لكن التعرض المزمن للإيثانول (EtOH) يزيد من الإجهاد التأكسدي المشتق من الميتوكوندريا ، والذي يمكن أن يؤدي إلى خلل في الميتوكوندريا في AMs8،9،10. يمكن قياس تنفس الميتوكوندريا المقاس باستخدام معدل استهلاك الأكسجين الخلوي (OCR) باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية في الوقت الفعلي. يتم تقييم ملامح تنفس الميتوكوندريا استجابة للأوليغومايسين (مثبط سينسيز ATP) ، وكاربونيل سيانيد - ف ثلاثي فلورو ميثاوكسي فينيل هيدرازون (FCCP ، مفك اقتران البروتون) ، والروتينون / أنتيمايسين أ (R / A ، مثبطات الميتوكوندريا المركب الأول والثالث ، على التوالي) لتحديد الطاقة الحيوية للميتوكوندريا. يقلل EtOH المزمن من الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في AMs ، كما يتضح من تناقص التنفس القاعدي للميتوكوندريا ، والتنفس المرتبط ب ATP ، والتنفس الأقصى ، والقدرة التنفسيةالاحتياطية 10.

الخلايا لها مستويات مختلفة من الاعتماد على مصادر الوقود ، مثل البيروفات أو الجلوتامين أو الأحماض الدهنية ، لإنتاج ATP. لديهم أيضا مستوى من المرونة يمكنهم من خلاله تبديل استخدام الوقود لتنظيم الطاقة الحيوية الخلوية. يعد تحلل الجلوتامينات مسارا رئيسيا لتنفس الميتوكوندريا ، خاصة عندما يتم تحويل البيروفات نحو إنتاج حمض اللاكتيك أو عندما تكون الأحماض الدهنية غير كافية. أظهرت دراستنا الحديثة أن التعرض المزمن ل EtOH يزيد من اعتماد AM على الجلوتامين ويقلل من مرونة AM لاستخدام الجلوتامين ومصادر الوقود الأخرى لتنفس الميتوكوندريا11. هذه النتائج ، جنبا إلى جنب مع البيانات التي توضح أن معالجة خلايا MH-S المعرضة ل EtOH بمثبط أكسدة البيروفات UK5099 لم يغير الطاقة الحيوية للميتوكوندريا مقارنة بخلايا MH-S المعرضة للتحكم في الوسائط المعالجة ب UK5099 ، اقترحت تحولا بعيدا عن التنفس المعتمد على البيروفات ونحو التنفس المعتمد على الجلوتامين في خلايا EtOH MH-S. ومع ذلك ، فإن هذا التحول غير كاف لتلبية متطلبات الطاقة الحيوية AM11. هنا ، نصف طرق تقييم الجلوتامين كمصدر وقود لتنفس الميتوكوندريا في AMs المزمنة المعرضة ل EtOH باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية. تم إنشاء هذا البروتوكول وتحسينه لتنسيق 96 بئرا (مساحة 11.04 مم2 ) ويجب تعديله لأحجام آبار زراعة الخلايا الأكبر. يتم تحديد الاعتماد على الجلوتامين للطاقة الحيوية للميتوكوندريا باستخدام كبريتيد الإيثيل bis-2- (5-phenylacetamido-1،3،4-thiadiazol-2-yl) (BPTES ، مثبط الجلوتاميناز 1) لتثبيط التحويل الأنزيمي للجلوتامين إلى غلوتامات بشكل انتقائي البيانات المقدمة في هذه الدراسة عبارة عن مكررات بيولوجية إضافية للمجموعات التجريبية المعالجة بالتحكم في الوسائط والمجموعات التجريبية المعالجة ب BPTES من خط خلايا الفأر AM غير المعالج والمزمن المتعرض ل EtOH ، خلايا MH-S ، والتي تم نشرها في Crotty et al.11.

Protocol

1. التعرض المزمن ل EtOH في المختبر

  1. زراعة خلايا MH-S ، وهي خط خلايا بلاعم سنخي للفأر ، في وسائط كاملة تحتوي على RPMI-1640 مع 10٪ مصل بقري جنيني ، 1٪ بنسلين / ستربتومايسين ، 11.9 ملي مولار بيكربونات الصوديوم ، 40 مجم / مل جنتاميسين ، و 50 ميكرومتر 2-ميركابتو إيثانول عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة مرطبة.
  2. عالج خلايا MH-S المستنبتة مع أو بدون EtOH (0.8 مجم / مل أو 0.08٪) لمدة 72 ساعة ، حيث يجب تغيير EtOH كل 24 ساعة. احتضان خلايا MH-S المعالجة ب EtOH عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في حاضنة مرطب منفصلة تحتوي على 0.08٪ EtOH في مياه الحاضنة.

2. طلاء خلايا MH-S لتقييم الجلوتامين كمصدر للوقود باستخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية

  1. تأكد من نمو خلايا MH-S غير المعالجة (Con) والمزمنة المعالجة ب EtOH إلى التقاء 50٪ على الأقل (التقاء 70٪ -90٪ مثالي) في قوارير T-75 للمرور إلى لوحة زراعة دقيقة للتدفق خارج الخلية مكونة من 96 بئر. قم بإعداد خريطة لوحة ل 5-6 مكررات تقنية لكل تكرار بيولوجي للظروف التجريبية Con و EtOH وضوابط الوسائط لكل منها للمقارنة مع حقن BPTES (أربع مجموعات إجمالية للبيولوجية n = 1).
  2. اشطف الخلايا بالوسائط أو المحلول الملحي المخزن بالفوسفات.
  3. أضف 6 مل من الوسائط المحتوية على المصل إلى القارورة.
  4. اكشط الخلايا حتى يتم فصلها ويصبح الجزء السفلي من اللوحة واضحا. التربسين غير ضروري لانفصال خلايا MH-S ولكنه قد يكون مفيدا في أنواع الخلايا الأخرى.
  5. افصل الخلايا باستخدام ماصة مصلية أو ماصة سعة 1 مل.
  6. انقل الخلايا العالقة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وقم بطردها بمعدل 200 × جم لمدة 6 دقائق.
  7. شفط المادة الطافية.
  8. أضف 1 مل من الوسائط وأعد تعليق الخلايا جيدا.
  9. انقل 10 ميكرولتر إلى أنبوب طرد مركزي دقيق وأضف 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق. اخلط جيدا.
  10. انقل 10 ميكرولتر من خليط الخلية / التريبان الأزرق إلى جانب واحد من مقياس كثافة الدم أو عداد الخلية.
  11. احسب عدد الخلايا باستخدام مجهر ضوئي أو عداد خلية.
  12. احسب كثافة الخلية كمتوسط عدد الخلايا الحية لكل مليلتر.
  13. قم بإجراء حسابات للتخفيفات المطلوبة:
    عدد الآبار المطلوبة × 10000-15000 خلية = العدد الإجمالي للخلايا المطلوبة.
    عدد الآبار المطلوبة × 80 ميكرولتر = الحجم الإجمالي للخلايا المعلقة المطلوبة.
  14. ضع 80 ميكرولتر من الخلايا على الآبار الضرورية للوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية المكونة من 96 بئرا.
  15. اترك آبار الزاوية خالية تماما من أي خلايا أو وسائط. سيتم استخدام هذه الآبار لقياسات الخلفية.
  16. احتضان الخلايا في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 بين عشية وضحاها للسماح للخلايا بالالتصاق والتوازن في لوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية.
  17. عالج خلايا MH-S في لوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية المكونة من 96 بئرا لمدة 72 ساعة باستخدام الخطوة 1.
  18. قبل 4 ساعات على الأقل وحتى 24 ساعة قبل إجراء تجربة المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية ، قم بترطيب خرطوشة باك التدفق خارج الخلية 96 بئر.
    1. قم بإزالة الجزء العلوي من باك التدفق خارج الخلية وضع الجزء الذي تم فحصه من باك التدفق ووجهه لأعلى على المقعد. ضع 200 ميكرولتر من محلول التدفق خارج الخلية على كل بئر في الجزء السفلي من خرطوشة باك التدفق خارج الخلية.
    2. ضع الأقسام معا ولف خرطوشة باك التدفق خارج الخلية في بارافيلم ضعه في حاضنة مرطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية غير ثاني أكسيد الكربون2 أو حمام حبة 37 درجة مئوية.
  19. قم بتشغيل الكمبيوتر الذي يحتوي على تصميم الفحص وافتح برنامج التشغيل / التحليل المرفق بأداة المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية للسماح له بالتسخين لمدة 4 ساعات على الأقل قبل إجراء التجربة.

3. استخدام محلل حيوي للتدفق خارج الخلية لتقييم الجلوتامين كمصدر وقود لتنفس الميتوكوندريا في خلايا MH-S

ملاحظة: تظهر النظرة العامة العامة لهذا الإجراء في الشكل 1.

  1. افحص خلايا MH-S المستزرعة المعالجة ب Con و EtOH تحت المجهر الضوئي وتأكد من أن الخلايا سليمة وتلتصق بالآبار في طبقة أحادية. تأكد من أن الخلايا ملتقية بنسبة 70٪ على الأقل (التقاء 90٪ مثالي) لإجراء الفحص بشكل موثوق.
  2. تحضير وسط قاعدة التدفق خارج الخلية بالمكملات التالية:
    1. Aliquot 35 مل من وسط قاعدة التدفق خارج الخلية في أنبوب 50 مل.
    2. أضف 350 ميكرولتر من 100 ملي مولار بيروفات الصوديوم (التركيز النهائي 1 ملليمتر) ، و 350 ميكرولتر من جلوكوز الصوديوم (التركيز النهائي 10 مليمتر) ، و 350 ميكرولتر من الجلوتاماكس ، وهو أكثر ثباتا على الرف مقارنة ب L-glutamine (التركيز النهائي 2 مللي).
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام L-glutamine الطازج بنفس التركيز.
    3. قم بتسخين المحلول إلى 37 درجة مئوية وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني 7.4 ± 0.05 عند 37 درجة مئوية.
  3. استنشق وسط النمو برفق من لوحة الزراعة الدقيقة خارج الخلية. اترك أقل قدر ممكن من الوسائط دون شفط الخلايا من الأسفل. يغسل مرة واحدة بحد أقصى 50 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية.
  4. أضف 180 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية إلى كل بئر واحتضان لوحة الزراعة الدقيقة خارج الخلية في حاضنة مرطبة 37 درجة مئوية غير ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة للسماح بالتوازن.
  5. قم بإذابة كواشف اختبار أكسدة الجلوتامين:
    1. في أنبوب BPTES ، أضف 700 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية لعمل محلول مخزون 120 ملم. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لإذابة المركب بشكل صحيح.
      تنبيه: تسبب BPTES تهيج الجلد والعين وقد تسبب تهيج الجهاز التنفسي. ارتد قفازات واقية وحماية للعين وحماية للوجه عند التعامل معها. تخلص من المحتويات والحاويات في منشأة معتمدة للتخلص من النفايات.
    2. في أنبوب oligomycin ، أضف 630 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية لعمل محلول مخزون 100 ملليمتر. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لإذابة المركب بشكل صحيح.
    3. في أنبوب FCCP ، أضف 720 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية لعمل محلول مخزون 100 ملم. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لإذابة المركب بشكل صحيح.
      تنبيه: FCCP ضار إذا تم ابتلاعه ، ويسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين ، وقد يسبب رد فعل تحسسي للجلد ، وقد يسبب آثارا ضارة طويلة الأمد على الحياة المائية. ارتد قفازات واقية وملابس واقية وواقية للعين وحماية للوجه عند المناولة. تخلص من المحتويات والحاويات في منشأة معتمدة للتخلص من النفايات.
    4. في أنبوب R / A ، أضف 540 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية لعمل محلول مخزون 50 ملم. الماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لإذابة المركب بشكل صحيح.
      تنبيه: يعتبر Rotenone قاتلا إذا تم ابتلاعه أو استنشاقه ، ويسبب تهيجا للجلد ، ويسبب تهيجا خطيرا للعين ، وقد يسبب تهيجا في الجهاز التنفسي ، وهو شديد السمية للحياة المائية مع تأثيرات طويلة الأمد. ارتد قفازات واقية وحماية للعين وحماية الوجه وحماية الجهاز التنفسي. تخلص من المحتويات والحاويات في منشأة معتمدة للتخلص من النفايات. أنتيمايسين أ قاتل إذا ابتلع وهو شديد السمية للحياة المائية ، وله تأثيرات طويلة الأمد. تخلص من المحتويات والحاويات في منشأة معتمدة للتخلص من النفايات.
  6. تحضير تركيزات العمل من أكسدة الركيزة وكواشف اختبار إجهاد الميتوكوندريا:
    1. بالنسبة ل BPTES ، امزج 1,500 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية مع 500 ميكرولتر من محلول مخزون 120 ملي مولار BPTES لصنع حل عمل 30 ميكرومتر BPTES.
    2. بالنسبة للأوليغومايسين ، امزج 2،520 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية مع 480 ميكرولتر من 100 ملي مولار من oligomycin لصنع محلول عمل 16 ملي مولار.
    3. بالنسبة إلى FCCP ، امزج 2,865 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية مع 135 ميكرولتر من 100 ملي مولار FCCP لعمل حل عمل FCCP 4.5 ملي.
    4. بالنسبة ل R / A ، امزج 2,700 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية مع 300 ميكرولتر من 50 ملي مولار R / A لعمل حل عمل 5 ملي مولار R / A.
  7. قم بتحميل منافذ الجزء العلوي من خرطوشة باك التدفق خارج الخلية بما يلي:
    1. قم بتحميل آبار التحكم في الخلفية والوسائط ب 20 ميكرولتر من الوسط الأساسي المكمل بالتدفق خارج الخلية في المنفذ A ، و 22 ميكرولتر من oligomycin في المنفذ B ، و 25 ميكرولتر من FCCP في المنفذ C ، و 27 ميكرولتر من R / A في المنفذ D.
    2. تحميل الآبار المحتوية على الخلايا ب 20 ميكرولتر من التحكم في الوسائط أو BPTES في المنفذ A (التركيز النهائي 3 ميكرومتر ل BPTES) ، و 22 ميكرولتر من oligomycin في المنفذ B (التركيز النهائي 2 ميكرومتر للأوليغومايسين) ، و 25 ميكرولتر من FCCP في المنفذ C (التركيز النهائي 0.5 ميكرومتر ل FCCP) ، و 27 ميكرولتر من R / A (التركيز النهائي 0.5 ميكرومتر ل R / A) في المنفذ D.
  8. قم بإجراء تجربة المحلل الحيوي للتدفق خارج الخلية باستخدام برنامج الكمبيوتر لتصميم الفحص وتحليله المرفق بالجهاز باستخدام استراتيجية التوقيت والحقن التالية:
    1. بالنسبة للحقن باستخدام المنفذ A ل BPTES ، اضبط عدد القياسات على 6. اضبط وقت المزج على 3 دقائق ، مع وقت انتظار 0 دقيقة ووقت قياس 3 دقائق.
    2. بالنسبة للحقن بالمنفذ B للأوليغومايسين، اضبط عدد القياسات على 3. اضبط وقت المزج على 3 دقائق ، مع وقت انتظار 0 دقيقة ووقت قياس 3 دقائق.
    3. بالنسبة للحقن باستخدام المنفذ C ل FCCP ، اضبط عدد القياسات على 3. اضبط وقت الخلط على 3 دقائق ، مع وقت انتظار 6 دقائق ووقت قياس 3 دقائق.
    4. بالنسبة للحقن باستخدام المنفذ D ل R / A ، اضبط عدد القياسات على 3. اضبط وقت المزج على 3 دقائق ، مع وقت انتظار 0 دقيقة ووقت قياس 3 دقائق.
    5. راجع جميع الخلفية المحددة ، والتحكم في الوسائط ، وآبار المجموعة التجريبية. حفظ وتشغيل الفحص. أولا ، قم بتحميل باك التدفق خارج الخلية بحقن A-D. ستحدث المعايرة حتى تصبح لوحة الخلية جاهزة للتحميل.
    6. قم بإزالة لوحة الخلية مباشرة في نهاية الفحص. احفظ النتائج لتحليلها لاحقا على جهاز آخر.
    7. تحقق مما إذا كانت الخلايا لا تزال ملتزمة باستخدام المجهر الضوئي. اغسل 1x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات وخلايا الليز مع مخزن مؤقت مفضل لتحلل الخلايا. يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية أو يفحص على الفور لتركيز البروتين.

4. تحليل النتائج لتقييم الجلوتامين كمصدر وقود لتنفس الميتوكوندريا في خلايا MH-S

  1. استخراج البروتين من الخلايا في كل بئر لتطبيع بيانات معدل استهلاك الأكسجين (OCR) إلى البروتين:
    1. احسب تركيز (نانوجرام / ميكرولتر [نانوغرام / ميكرولتر]) للبروتين لكل بئر.
    2. احسب متوسط تركيز البروتين (نانوغرام / ميكرولتر) للوحة الزراعة الدقيقة للتدفق خارج الخلية بأكملها.
    3. اقسم تركيز بروتين كل بئر على متوسط تركيز البروتين في اللوحة للحصول على عامل التطبيع.
    4. تطبيق عامل التطبيع على ملف البيانات محل الاهتمام باستخدام برنامج الكمبيوتر لتصميم الفحص وتحليله.
  2. تأكد من أن قيم التعرف الضوئي على الحروف لجميع آبار الخلفية قريبة من 0.
  3. قم بإلغاء تحديد أي آبار خلوية حيث يكون التعرف الضوئي على الحروف < 10 عند خط الأساس. لن يتم حذف البيانات ، ولكن ستظهر الآبار المميزة في ملف البيانات المصدرة.
  4. تصدير البيانات من برنامج الكمبيوتر لتصميم الفحص وتحليله إلى برنامج جداول بيانات الكمبيوتر.
  5. افتح الملف في برنامج جدول بيانات الكمبيوتر وفرز جميع البيانات عن طريق تقليل قيم التعرف الضوئي على الحروف. حذف آبار الخلفية ، والآبار التي تم إلغاء تحديدها مسبقا (ولم يتم حذفها) ، وأي آبار ذات قابلية منخفضة للخلايا ، والآبار ذات التقاء الخلايا المنخفض ، والآبار التي لا تكتمل استراتيجية الحقن الكاملة ، والآبار ذات قراءات تركيز البروتين غير الدقيقة ، والآبار ذات خط الأساس OCR < 10 ، وأي معايير أخرى محددة مسبقا.
  6. قم بفرز جميع البيانات المتبقية حسب القياس ، ثم حسب المجموعة ، ثم حسب التعرف الضوئي على الحروف.
  7. يتكرر متوسط تقنية كل N البيولوجية بشكل مستقل عن طريق القياس. تأكد من وجود ما لا يقل عن 18 قيمة مختلفة (3 خط أساس ، 3 بعد الوسائط / BPTES ، 3 بعد oligomycin ، 3 بعد FCCP ، و 6 بعد rotenone / antimycin A) لكل مجموعة تجريبية لكل N بيولوجي بعد متوسط التكرارات التقنية. افعل ذلك لكل N بيولوجي على حدة بحيث يمكن حساب الانحراف المعياري أو الخطأ المعياري للمتوسط لاحقا للبيانات التي تم تحليلها.
  8. انسخ جميع القيم المتوسطة إلى جدول بيانات جديد، مفصولا بمجموعة تجريبية.
  9. متوسط قيم التعرف الضوئي على الحروف حسب استراتيجية الحقن في كل مجموعة تجريبية.
  10. احسب معلمات الطاقة الحيوية للميتوكوندريا بناء على استهلاك الأكسجين:
    1. احسب التنفس الأساسي:
      1. احسب تنفس الميتوكوندريا القاعدي على النحو التالي:
        تنفس الميتوكوندريا القاعدي (pmol O2 مستهلك) = ([قياسات AVG OCR # 1 ، 2 ، 3 - قياسات AVG OCR # 16 ، 17 ، 18] × [الوقت # 3 - الوقت # 1])
        ملاحظة: يجب أن يكون التنفس القاعدي متشابها بين التحكم في الوسائط ومجموعات BPTES لأن هذا قبل حقن المثبط.
      2. احسب تنفس الميتوكوندريا القاعدي الذي لا يعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        لا يعتمد تنفس الميتوكوندريا القاعدي على الجلوتامين (pmol O2 المستهلك) = ([قياسات AVG OCR # 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 - قياسات AVG OCR # 16 ، 17 ، 18] × [الوقت # 9 - الوقت # 4])
        ملاحظة: يجب أن يكون تنفس الميتوكوندريا القاعدي الذي لا يعتمد على الجلوتامين أقل من تنفس الميتوكوندريا القاعدي ما لم تكن الخلايا لا تعتمد بشكل كبير على الجلوتامين.
      3. احسب تنفس الميتوكوندريا القاعدي المعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        يعتمد تنفس الميتوكوندريا القاعدي على الجلوتامين (مستهلكة pmol O2 ) = ([قياسات AVG OCR # 1 ، 2 ، 3 - قياسات AVG OCR # 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9] × [الوقت # 9 - الوقت # 4])
        ملاحظة: لا ينبغي طرح تنفس الميتوكوندريا القاعدي الكلي من تنفس الميتوكوندريا القاعدي ، ولا ينبغي أن يعتمد على الجلوتامين لأنه يتم حسابه في نقاط زمنية مختلفة.
    2. احسب التنفس المرتبط ب ATP على النحو التالي:
      1. احسب إجمالي التنفس المرتبط ب ATP للميتوكوندريا من جميع أنواع الوقود على النحو التالي:
        إجمالي التنفس المرتبط ب ATP للميتوكوندريا من جميع أنواع الوقود (pmol O2 مستهلك) = ([قياسات AVG OCR # 1 ، 2 ، 3 - قياسات AVG OCR # 10 ، 11 ، 12] × [الوقت # 12 - الوقت # 10])
        ملاحظة: يجب أن يكون متوسط التعرف الضوئي على الحروف للقياسات # 10 و 11 و 12 متشابها بين التحكم في الوسائط ومجموعات BPTES لأن oligomycin يجب أن يثبط بقوة سينسيز ATP ، ويجب ألا يغير تثبيط مسار وقود واحد إجمالي التنفس المرتبط ب ATP.
      2. احسب تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP الذي لا يعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP لا يعتمد على الجلوتامين (pmol O2 المستهلك) = ([قياسات AVG OCR # 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 - قياسات AVG OCR # 10 ، 11 ، 12] × [الوقت # 12 - الوقت # 10])
        ملاحظة: يجب أن يكون تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP الذي لا يعتمد على الجلوتامين أقل من تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP ما لم تكن الخلايا لا تعتمد بشكل كبير على الجلوتامين.
      3. احسب تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP الذي يعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        يعتمد تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP على الجلوتامين (مستهلك pmol O2 ) = إجمالي تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP من جميع أنواع الوقود - تنفس الميتوكوندريا المرتبط ب ATP لا يعتمد على الجلوتامين
    3. احسب الحد الأقصى للتنفس على النحو التالي:
      1. احسب إجمالي الحد الأقصى لتنفس الميتوكوندريا على النحو التالي:
        إجمالي تنفس الميتوكوندريا الأقصى (pmol O2 المستهلكة) = ([قياسات AVG OCR # 13 ، 14 ، 15 - قياسات AVG OCR # 16 ، 17 ، 18] × [الوقت # 15 - الوقت # 13])
      2. احسب الحد الأقصى لتنفس الميتوكوندريا الذي لا يعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        الحد الأقصى لتنفس الميتوكوندريا لا يعتمد على الجلوتامين (pmol O2 مستهلك) = ([قياسات AVG OCR # 13 ، 14 ، 15 من مجموعات BPTES - قياسات AVG OCR # 16 ، 17 ، 18 من مجموعات BPTES] × [الوقت # 15 - #Time 13])
      3. احسب الحد الأقصى لتنفس الميتوكوندريا المعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        أقصى تنفس للميتوكوندريا يعتمد على الجلوتامين (مستهلك pmol O2 ) = إجمالي تنفس الميتوكوندريا الأقصى من جميع أنواع الوقود - أقصى تنفس للميتوكوندريا لا يعتمد على الجلوتامين
        ملاحظة: يمكن استخدام هذا الحساب لتحديد اعتماد الخلية على الطاقة الفائضة للجلوتامين مقارنة بأنواع الوقود الأخرى. كلما زاد الحد الأقصى لتنفس الميتوكوندريا ، زاد الاعتماد على الجلوتامين ، والذي يمكن التعبير عنه على أنه مجموعات BPTES - مجموعات التحكم لإظهار خسارة في أقصى تنفس للميتوكوندريا أو كنسبة مئوية من التنفس الكلي.
    4. احسب القدرة التنفسية الاحتياطية على النحو التالي:
      1. احسب إجمالي سعة التنفس الاحتياطية على النحو التالي:
        إجمالي سعة الجهاز التنفسي الاحتياطية (pmol O2 المستهلكة) = ([قياسات AVG OCR # 13 ، 14 ، 15 - قياسات AVG OCR # 1 ، 2 ، 3] × [الوقت # 15 - الوقت # 13])
      2. احسب القدرة التنفسية الاحتياطية التي لا تعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        القدرة التنفسية الاحتياطية لا تعتمد على الجلوتامين (pmol O2 المستهلكة) = ([قياسات AVG OCR # 13 ، 14 ، 15 من مجموعات BPTES - قياسات AVG OCR # 1 ، 2 ، 3 من مجموعات BPTES] × [الوقت # 15 - الوقت # 13])
      3. احسب القدرة التنفسية الاحتياطية التي تعتمد على الجلوتامين على النحو التالي:
        القدرة التنفسية الاحتياطية التي تعتمد على الجلوتامين (مستهلك PMOL O2 ) = إجمالي القدرة التنفسية الاحتياطية من جميع أنواع الوقود - القدرة التنفسية الاحتياطية التي لا تعتمد على الجلوتامين
        ملاحظة: يمثل هذا الحساب مرونة الخلايا التي تعتمد على الجلوتامين وما إذا كان بإمكانها تحقيق تنفس أكبر بدون الجلوتامين عند الحاجة.
  11. اطرح عناصر التحكم في الوسائط حسب مجموعات المثبطات وتطبيع pmol O2 المستهلك بالنسبة للمجموعة الضابطة إذا رغبت في ذلك.
  12. قم بإنشاء رسوم بيانية لملامح الطاقة الحيوية OCR (pmol O2 / min) ، والتنفس القاعدي (pmol O2) ، والتنفس المرتبط ب ATP (pmol O2) ، والتنفس الأقصى (pmol O2) ، والقدرة التنفسية الاحتياطية (pmol O2) التي تعتمد على الجلوتامين.
  13. تصور قيم نقطة نهاية الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في الرسوم البيانية الشريطية أو التعبير عنها كوسيلة لمجموعات المثبطات بالنسبة لمجموعات التحكم في الوسائط. إذا تم حساب كل N بيولوجي على حدة ، فقم بحساب الانحراف المعياري أو الخطأ المعياري لمتوسط البيانات التي تم تحليلها عبر جميع Ns البيولوجية.

5. التحليل الإحصائي

  1. إجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام برنامج تحليل البيانات المناسب.
  2. بالنسبة للنقاط الخطية لملامح الطاقة الحيوية OCR ، قم بإجراء ANOVA ثنائي الاتجاه متبوعا بتحليلات Tukey اللاحقة لمقارنة البيانات من هذه المجموعات التجريبية الأربع بعاملين (استراتيجية العلاج والحقن): Con + media و Con + BPTES و EtOH + media و EtOH + BPTES.
  3. بالنسبة للرسوم البيانية الشريطية للتنفس القاعدي ، والتنفس المرتبط ب ATP ، والتنفس الأقصى ، والقدرة التنفسية الاحتياطية التي تعتمد على الجلوتامين ، قم بإجراء تحليلات اختبار t للطالب لمقارنة البيانات من مجموعتين تجريبيتين ، Con + BPTES ، و EtOH + BPTES.
  4. عرض البيانات كوسيلة ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM). ضع في اعتبارك ص < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

يقلل التعرض المزمن ل EtOH من الاعتماد على الجلوتامين في خلايا MH-S.
يعد تحلل الجلوتامينات مسارا مهما لتنفس الميتوكوندريا ، حيث يدعم الجلوتامين كمصدر وقود مهم للطاقة الحيوية الخلوية. لتحديد ما إذا كان التعرض المزمن ل EtOH يغير اعتماد خلايا MH-S على الجلوتامين كمصدر لل...

Discussion

البيانات المعروضة هنا هي مكررات بيولوجية إضافية لخلايا MH-S غير المعالجة والمزمنة المعرضة ل EtOH المعالجة بالتحكم في الوسائط أو BPTES ، والتي تم نشرها في Crotty et al.11. يستخدم البروتوكول الموصوف لتقييم اعتماد خلايا MH-S المعرضة ل EtOH على الجلوتامين كمصدر للوقود لتنفس ال?...

Disclosures

ليس لدى جميع المؤلفين أي تضارب في المصالح المالية ذات الصلة للإبلاغ عنه.

Acknowledgements

نحن نقدر مساهمات سارة س. تشانغ ، BS ، في زراعة الخلايا الأولية وإعداد خلايا MH-S للتجريب. تم دعم هذا العمل من قبل NIAAA R01-AA026086 إلى SMY (ORCID: 0000-0001-9309-0233) ، و NIAAA F31-F31AA029938 إلى KMC ، و NIGMS T32-GM008602 إلى راندي هول ، قسم علم الأدوية والبيولوجيا الكيميائية ، جامعة إيموري. لا تمثل محتويات هذا التقرير وجهات نظر وزارة شؤون المحاربين القدامى أو حكومة الولايات المتحدة.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tube VWR International, Inc.21008-670Used for preparing stock concentrations of mitochondria-related reagents.
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich Co.M6250Used for culturing MH-S cells.
Cell scraperDot Scientific, Inc.70-1180Used for scraping MH-S cells from T-75 flasks.
Countess 3 FL Instrument: cell counterFisher Scientific CompanyAMQAF2000Used for counting the number of MH-S cells to plate for experiments.
D-glucose Sigma Aldrich Co.G8270Used for the extracellular flux base medium.
EthanolFisher Scientific Company4355720Experimental treatment for MH-S cells.
Fetal bovine serumSciencell Research Laboratories500Used for culturing MH-S cells.
GentamicinSigma Aldrich Co.G1397Used for culturing MH-S cells.
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Used for the extracellular flux base medium.
GraphPad Prism 10.2.3GraphPad SoftwareN/ASoftware for statistical analysis. Downloadable after purchase at https://www.graphpad.com/features.
MH-S cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-2019Mouse alveolar macrophage cell line.
Microcentrifuge tube USA Scientific, Inc.4036-3212Used for preparing working concentrations of mitochondria-related reagents.
Microsoft 365 Excel: computer spreadsheet programMicrosoftN/ASoftware for data organization and mitochondrial bioenergetics calculations. Downloadable after purchase at https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Penicillin/streptomycinFisher Scientific Company15140122Used for culturing MH-S cells.
Phosphate buffered salineVWR International, Inc.45000-446Used for washing MH-S cells.
RPMI-1640VWR International, Inc.45000-396Used for culturing MH-S cells.
Seahorse Wave Pro Software: computer software program for assay design and analysisAgilent Technologies, Inc.N/AThe computer is attached to the Seahorse XF Pro Analyzer instrument. Downloadable from  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: extracellular flux base medium, pH 7.4Agilent Technologies, Inc.103334-100Used for preparing stock and working concentrations of mitochondria-related reagents and culturing MH-S cells prior to experimental runs.
Seahorse XF Glutamine Oxidation Stress Test KitAgilent Technologies, Inc.103674-100Contains stock BPTES, oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A.
Seahorse XF Pro Analyzer: extracellular flux bioanalyzerAgilent Technologies, Inc.N/AExtracellular flux bioanalyzer.
Seahorse XFe96 FluxPak: 96-well extracellular flux pak cartridges, 96-well extracellular flux microculture plates, and calibrant solutionAgilent Technologies, Inc.102416-100Used to prepare MH-S cells for assays using an extracellular flux bioanalyzer.
Serological pipet Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-550678Used for removing media from MH-S cells.
Sodium bicarbonateSigma Aldrich Co.S6014Used for culturing MH-S cells.
Sodium pyruvate Sigma Aldrich Co.P4562Used for the extracellular flux base medium.
T-75 flasksSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-200263Used for culturing MH-S cells.

References

  1. . 2021 National Survey on Drug Use and Health (NSDUH). Table 5.6A - Alcohol Use Disorder in Past Year: Among People Aged 12 or Older; by Age Group and Demographic Characteristics, Numbers in Thousands, 2021 Available from: https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm (2021)
  2. Everts, R. J., et al. Nosocomial pneumonia in adult general medical and surgical patients at Christchurch Hospital. N Z Med J. 113 (1111), 221-224 (2000).
  3. de Roux, A., et al. Impact of alcohol abuse in the etiology and severity of community-acquired pneumonia. Chest. 129 (5), 1219-1225 (2006).
  4. Moss, M. Epidemiology of sepsis: race, sex, and chronic alcohol abuse. Clin Infect Dis. 41 (Suppl 7), S490-S497 (2005).
  5. Fernandez-Sola, J., et al. High alcohol intake as a risk and prognostic factor for community-acquired pneumonia. Arch Intern Med. 155 (15), 1649-1654 (1995).
  6. Yeligar, S. M., Harris, F. L., Hart, C. M., Brown, L. A. Glutathione attenuates ethanol-induced alveolar macrophage oxidative stress and dysfunction by downregulating NADPH oxidases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (5), L429-L441 (2014).
  7. Yeligar, S. M., Mehta, A. J., Harris, F. L., Brown, L. A., Hart, C. M. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulates chronic alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (1), 35-46 (2016).
  8. Liang, Y., Harris, F. L., Brown, L. A. Alcohol induced mitochondrial oxidative stress and alveolar macrophage dysfunction. Biomed Res Int. 2014, 371593 (2014).
  9. Liang, Y., Harris, F. L., Jones, D. P., Brown, L. A. Alcohol induces mitochondrial redox imbalance in alveolar macrophages. Free Radic Biol Med. 65, 1427-1434 (2013).
  10. Morris, N. L., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Yeligar, S. M. Alcohol induces mitochondrial derangements in alveolar macrophages by upregulating NADPH oxidase 4. Alcohol. 90, 27-38 (2021).
  11. Crotty, K. M., Kabir, S. A., Chang, S. S., Mehta, A. J., Yeligar, S. M. Pioglitazone reverses alcohol-induced alterations in alveolar macrophage mitochondrial phenotype. Alcohol Clin Exp Res (Hoboken). 48 (5), 810-826 (2024).
  12. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  13. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  14. Chacko, B. K., et al. The Bioenergetic Health Index: a new concept in mitochondrial translational research. Clin Sci (Lond). 127 (6), 367-373 (2014).
  15. Fan, Y., et al. Analyzing mitochondrial respiration of human induced pluripotent stem cell-derived myeloid progenitors using Seahorse technology. STAR Protoc. 4 (1), 102073 (2023).
  16. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protoc. 2 (1), 100245 (2021).
  17. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
  18. Winnica, D., et al. Bioenergetic differences in the airway epithelium of lean versus obese asthmatics are driven by nitric oxide and reflected in circulating platelets. Antioxid Redox Signal. 31 (10), 673-686 (2019).
  19. Nickens, K. P., Wikstrom, J. D., Shirihai, O. S., Patierno, S. R., Ceryak, S. A bioenergetic profile of non-transformed fibroblasts uncovers a link between death-resistance and enhanced spare respiratory capacity. Mitochondrion. 13 (6), 662-667 (2013).
  20. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age related bioenergetics profiles in isolated rat cardiomyocytes using extracellular flux analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
  21. Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic Biol Med. 51 (9), 1621-1635 (2011).
  22. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
  23. Tyrrell, D. J., Bharadwaj, M. S., Jorgensen, M. J., Register, T. C., Molina, A. J. Blood cell respirometry is associated with skeletal and cardiac muscle bioenergetics: Implications for a minimally invasive biomarker of mitochondrial health. Redox Biol. 10, 65-77 (2016).
  24. Shah-Simpson, S., Pereira, C. F., Dumoulin, P. C., Caradonna, K. L., Burleigh, B. A. Bioenergetic profiling of Trypanosoma cruzi life stages using Seahorse extracellular flux technology. Mol Biochem Parasitol. 208 (2), 91-95 (2016).
  25. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. 46, e2511 (2010).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  27. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Anal Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  28. Yeligar, S. M., et al. PPARgamma regulates mitochondrial structure and function and human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation. Am J Respir Cell Mol Biol. 58 (5), 648-657 (2018).
  29. Yeligar, S., Tsukamoto, H., Kalra, V. K. Ethanol-induced expression of ET-1 and ET-BR in liver sinusoidal endothelial cells and human endothelial cells involves hypoxia-inducible factor-1alpha and microrNA-199. J Immunol. 183 (8), 5232-5243 (2009).
  30. Yeligar, S. M., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Hart, C. M. Pharmacological reversal of post-transcriptional alterations implicated in alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction. Alcohol. 106, 30-43 (2023).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BPTES ATP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved