Evaluación de la glutamina como fuente de combustible para macrófagos alveolares expuestos a etanol crónico utilizando un bioanalizador de flujo extracelular

Resumen

El abuso del alcohol perjudica la inmunidad de los macrófagos alveolares (AM) debido a la supresión de la respiración mitocondrial y la bioenergética. Recientemente demostramos que la exposición al etanol (EtOH) aumenta la dependencia de la glutamina para la respiración mitocondrial en los AM. En este artículo, se proporcionan métodos para determinar el uso de glutamina para la respiración mitocondrial en AM tratados con EtOH utilizando un bioanalizador de flujo extracelular.

Resumen

Los macrófagos alveolares (AM) son la primera línea de defensa celular en las vías respiratorias inferiores contra los patógenos. Sin embargo, el consumo crónico y excesivo de alcohol afecta la capacidad de los AM para fagocitar y eliminar patógenos del espacio alveolar, en parte a través del metabolismo del combustible desregulado y la bioenergética. Nuestro trabajo previo ha demostrado que el consumo crónico de etanol (EtOH) perjudica la bioenergética mitocondrial y aumenta los niveles de lactato en los AM. Además, recientemente demostramos que el EtOH aumenta la dependencia de la glutamina y la respiración máxima dependiente de la glutamina, al tiempo que disminuye la flexibilidad, alejándose de la respiración dependiente de piruvato y acercándose a la respiración dependiente de la glutamina. La glutaminólisis es una vía compensatoria importante para la respiración mitocondrial cuando se utiliza piruvato para la producción de ácido láctico o cuando otras fuentes de combustible son insuficientes. Utilizando una línea celular AM de ratón, células MH-S, expuestas a ningún EtOH o a EtOH (0,08%) durante 72 h, determinamos la dependencia de la respiración mitocondrial y la bioenergética de la glutamina como fuente de combustible utilizando un bioanalizador de flujo extracelular. Se realizaron mediciones en tiempo real en respuesta al sulfuro de etilo de bis-2-(5-fenilacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-il) (BPTES), un inhibidor de la glutaminasa 1, que previene la conversión enzimática de glutamina en glutamato, en el medio o en respuesta al vehículo solo, seguido de pruebas de estrés mitocondrial. El protocolo paso a paso proporcionado en este documento describe nuestros métodos y cálculos para analizar los niveles promedio de respiración mitocondrial basal dependiente de glutamina, respiración mitocondrial ligada a ATP, respiración mitocondrial máxima y capacidad respiratoria mitocondrial de reserva en múltiples réplicas biológicas y experimentales.

Introducción

El trastorno por consumo de alcohol (TCA) afecta a más de 28 millones de personas en^{los Estados Unidos}. Las personas con trastorno por consumo de alcohol tienen entre 2 y 4 veces más probabilidades de desarrollar infecciones respiratorias ^2,3, lo que aumenta el riesgo de morbilidad y mortalidad prematuras ^3,4,5. El abuso del alcohol aumenta la susceptibilidad a las infecciones respiratorias, en parte a través de la supresión de la función inmunitaria pulmonar. ....

Protocolo

1. Exposición crónica a EtOH in vitro

1. Cultivo de células MH-S, una línea celular de macrófagos alveolares de ratón, en medios completos que contienen RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino, 1% de penicilina/estreptomicina, 11,9 mM de bicarbonato de sodio, 40 mg/mL de gentamicina y 50 μM de 2-mercaptoetanol a 37 °C con 5% de CO₂ en una incubadora humidificada.
2. Tratar las células MH-S cultivadas con o sin EtOH (0,8 mg/ml o 0,08%) durante 72 h, donde el EtOH debe cambiarse cada 24 h. Incubar las células MH-S tratadas con EtOH a 37 °C con 5% de CO₂ en ....

Resultados

La exposición crónica al EtOH disminuye la dependencia de la glutamina en las células MH-S.
La glutaminólisis es una vía crítica para la respiración mitocondrial, ya que apoya a la glutamina como una importante fuente de combustible para la bioenergética celular. Para determinar si la exposición crónica a EtOH altera la dependencia de las células MH-S de la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial, las células MH-S se trataron.......

Discusión

Los datos presentados en este documento son réplicas biológicas adicionales para células MH-S no tratadas y crónicas expuestas a EtOH tratadas con control de medios o BPTES, que se publican en Crotty et ^al.11. El protocolo descrito se utiliza para evaluar la dependencia de las células MH-S expuestas a EtOH de la glutamina como fuente de combustible para la respiración mitocondrial y la bioenergética utilizando un bioanalizador de flujo extracelular. Hay var.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tube	VWR International, Inc.	21008-670	Used for preparing stock concentrations of mitochondria-related reagents.
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich Co.	M6250	Used for culturing MH-S cells.
Cell scraper	Dot Scientific, Inc.	70-1180	Used for scraping MH-S cells from T-75 flasks.
Countess 3 FL Instrument: cell counter	Fisher Scientific Company	AMQAF2000	Used for counting the number of MH-S cells to plate for experiments.
D-glucose	Sigma Aldrich Co.	G8270	Used for the extracellular flux base medium.
Ethanol	Fisher Scientific Company	4355720	Experimental treatment for MH-S cells.
Fetal bovine serum	Sciencell Research Laboratories	500	Used for culturing MH-S cells.
Gentamicin	Sigma Aldrich Co.	G1397	Used for culturing MH-S cells.
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Used for the extracellular flux base medium.
GraphPad Prism 10.2.3	GraphPad Software	N/A	Software for statistical analysis. Downloadable after purchase at https://www.graphpad.com/features.
MH-S cells	American Type Culture Collection	CRL-2019	Mouse alveolar macrophage cell line.
Microcentrifuge tube	USA Scientific, Inc.	4036-3212	Used for preparing working concentrations of mitochondria-related reagents.
Microsoft 365 Excel: computer spreadsheet program	Microsoft	N/A	Software for data organization and mitochondrial bioenergetics calculations. Downloadable after purchase at https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Penicillin/streptomycin	Fisher Scientific Company	15140122	Used for culturing MH-S cells.
Phosphate buffered saline	VWR International, Inc.	45000-446	Used for washing MH-S cells.
RPMI-1640	VWR International, Inc.	45000-396	Used for culturing MH-S cells.
Seahorse Wave Pro Software: computer software program for assay design and analysis	Agilent Technologies, Inc.	N/A	The computer is attached to the Seahorse XF Pro Analyzer instrument. Downloadable from  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: extracellular flux base medium, pH 7.4	Agilent Technologies, Inc.	103334-100	Used for preparing stock and working concentrations of mitochondria-related reagents and culturing MH-S cells prior to experimental runs.
Seahorse XF Glutamine Oxidation Stress Test Kit	Agilent Technologies, Inc.	103674-100	Contains stock BPTES, oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A.
Seahorse XF Pro Analyzer: extracellular flux bioanalyzer	Agilent Technologies, Inc.	N/A	Extracellular flux bioanalyzer.
Seahorse XFe96 FluxPak: 96-well extracellular flux pak cartridges, 96-well extracellular flux microculture plates, and calibrant solution	Agilent Technologies, Inc.	102416-100	Used to prepare MH-S cells for assays using an extracellular flux bioanalyzer.
Serological pipet	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-550678	Used for removing media from MH-S cells.
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich Co.	S6014	Used for culturing MH-S cells.
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich Co.	P4562	Used for the extracellular flux base medium.
T-75 flasks	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-200263	Used for culturing MH-S cells.