JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Злоупотребление алкоголем ухудшает иммунитет альвеолярных макрофагов (АМ) из-за угнетения митохондриального дыхания и биоэнергетики. Недавно мы продемонстрировали, что воздействие этанола (EtOH) увеличивает зависимость от глутамина для митохондриального дыхания при АМ. В данной работе представлены методы определения использования глутамина для митохондриального дыхания в АМ, обработанных EtOH, с использованием биоанализатора внеклеточного потока.

Аннотация

Альвеолярные макрофаги (АМ) являются первой линией клеточной защиты нижних дыхательных путей от патогенов. Тем не менее, хроническое и чрезмерное употребление алкоголя ухудшает способность АМ фагоцитировать и выводить патогены из альвеолярного пространства, отчасти из-за нарушения регуляции топливного метаболизма и биоэнергетики. Наша предыдущая работа показала, что хроническое потребление этанола (EtOH) ухудшает митохондриальную биоэнергетику и повышает уровень лактата в АМ. Кроме того, недавно мы продемонстрировали, что EtOH увеличивает зависимость от глютамина и глютамин-зависимое максимальное дыхание при одновременном снижении гибкости, переходя от пируват-зависимого дыхания к глутамин-зависимому дыханию. Глутаминолиз является важным компенсаторным путем для митохондриального дыхания, когда пируват используется для производства молочной кислоты или когда других источников топлива недостаточно. Используя мышиную линию АМ-клеток, MH-S клетки, подвергшиеся воздействию либо отсутствия EtOH, либо EtOH (0,08%) в течение 72 ч, мы определили зависимость митохондриального дыхания и биоэнергетики от глутамина в качестве источника топлива с помощью биоанализатора внеклеточного потока. Измерения в режиме реального времени проводили в ответ на бис-2-(5-фенилацетамидо-1,3,4-тиадиазол-2-ил) этилсульфид (BPTES), ингибитор глутаминазы 1, который предотвращает ферментативное превращение глутамина в глутамат, в носителе среды или в ответ только на носитель, с последующим тестированием митохондриального стресса. Пошаговый протокол, представленный в настоящем документе, описывает наши методы и расчеты для анализа средних уровней глутамин-зависимого базального митохондриального дыхания, митохондриального АТФ-связанного дыхания, максимального митохондриального дыхания и митохондриальной резервной дыхательной способности в нескольких биологических и экспериментальных репликациях.

Введение

Расстройство, связанное с употреблением алкоголя (AUD), затрагивает более 28 миллионов человек в Соединенных Штатах1. У людей с AUD вероятность развития респираторных инфекций в 2-4 раза выше2,3, что повышает риск преждевременной заболеваемости и смертности 3,4,5. Злоупотребление алкоголем повышает восприимчивость к респираторным инфекциям, отчасти за счет подавления иммунной функции легких. Альвеолярные макрофаги (АМ) являются первой линией клеточной защиты от патогенов в нижних отделах легких, где они фагоцитируют и выводят вдыхаемые микробы. Тем не менее, хроническое употребление алкоголя ухудшает способность аддитивных средств поглощать и убивать патогенные микроорганизмы 6,7.

Иммунные функции АМ, такие как фагоцитоз, являются энергоемкими процессами, требующими метаболически активных путей, необходимых для образования высокого уровня аденозинтрифосфата (АТФ). Митохондриальное окислительное фосфорилирование является наиболее эффективным клеточным процессом для производства АТФ, но хроническое воздействие этанола (EtOH) увеличивает окислительный стресс митохондриального происхождения, что может привести к митохондриальной дисфункции в AMs 8,9,10. Митохондриальное дыхание, измеренное с помощью клеточной скорости потребления кислорода (OCR), может быть количественно определено с помощью биоанализатора внеклеточного потока в режиме реального времени. Для определения митохондриальной биоэнергетики используются профили митохондриального дыхания, оцененные в ответ на олигомицин (ингибитор АТФ-синтазы), карбонильцианид--трифторметоксифенилгидразон (FCCP, развязка протонов) и ротенон/антимицин А (r/a, ингибиторы митохондриального комплекса I и III соответственно). Хронический EtOH снижает митохондриальную биоэнергетику в АМ, о чем свидетельствует снижение митохондриального базального дыхания, АТФ-связанного дыхания, максимального дыхания и резервной дыхательной способности10.

Клетки имеют различные уровни зависимости от источников топлива, таких как пируват, глутамин или жирные кислоты, для производства АТФ. Они также обладают уровнем гибкости, благодаря которому они могут переключать использование топлива для регулирования клеточной биоэнергетики. Глутаминолиз является ключевым путем для митохондриального дыхания, особенно когда пируват шунтируется в направлении производства молочной кислоты или когда жирных кислот недостаточно. Наше недавнее исследование показало, что хроническое воздействие этиона увеличивает зависимость АМ от глутамина и снижает гибкость АМ при использовании глутамина и других источников топлива для митохондриальногодыхания. Эти результаты, наряду с данными, свидетельствующими о том, что обработка MH-S клеток, подвергшихся воздействию EtOH, ингибитором окисления пирувата UK5099 не изменяла митохондриальную биоэнергетику по сравнению с MH-S клетками, подвергшимися воздействию контрольной среды, обработанными UK5099, свидетельствуют о переходе от пируват-зависимого дыхания к глутамин-зависимому дыханию в клетках MH-S с EtOH. Однако этого сдвига недостаточно для удовлетворения биоэнергетических потребностей АД11. В данной работе мы описываем методы оценки глутамина в качестве источника топлива для митохондриального дыхания в АМ, подвергшихся воздействию хронического этиленоксида, с использованием биоанализатора внеклеточного потока. Этот протокол был создан и оптимизирован для формата 96 лунок (площадь 11,04мм2 ) и должен быть скорректирован для больших размеров лунок клеточных культур. Зависимость глутамина от митохондриальной биоэнергетики определена с помощью бис-2-(5-фенилацетамидо-1,3,4-тиадиазол-2-ил) этилсульфида (BPTES, ингибитор глутаминазы 1) для селективного ингибирования ферментативного превращения глутамина в глутамат. Данные, представленные в этом исследовании, представляют собой дополнительные биологические репликации для контрольных и обработанных BPTES экспериментальных групп необработанной контрольной и хронической линии мышиных AM-клеток, MH-S, подвергшихся воздействию EtOH, которые опубликованы в Crotty et al.11.

протокол

1. Хроническое воздействие этиона in vitro

  1. Культивирование MH-S клеток, линии альвеолярных макрофагов мыши, в полной среде, содержащей RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллин/стрептомицина, 11,9 мМ бикарбоната натрия, 40 мг/мл гентамицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола при 37°C с 5%CO2 в увлажненном инкубаторе.
  2. Культивируемые MH-S клетки с EtOH или без него (0,8 мг/мл или 0,08%) в течение 72 ч, при этом EtOH следует менять каждые 24 ч. Инкубировать MH-S клетки, обработанные EtOH, при 37 °C с 5% CO2 в отдельном увлажненном инкубаторе, содержащем 0,08% EtOH в воде инкубатора.

2. Гальванизация MH-S клеток для оценки глутамина в качестве источника топлива с помощью биоанализатора внеклеточного потока

  1. Убедитесь, что необработанные контрольные (Con)- и хронические MH-S клетки, обработанные EtOH, выращиваются по крайней мере до 50% конфлюенции (идеально 70%-90% конфлюенции) в колбах T-75 для прохождения в 96-луночный микрокультуральный планшет для внеклеточного потока. Подготовьте карту планшетов для 5-6 технических реплик на каждую биологическую реплику Con и EtOH в экспериментальных условиях и контрольных сред для каждой из них для сравнения с инъекциями BPTES (всего четыре группы для биологических n= 1).
  2. Промойте клетки с помощью среды или фосфатно-солевого буфера.
  3. Добавьте в колбу 6 мл среды, содержащей сыворотку.
  4. Соскабливайте ячейки до тех пор, пока они не отсоединится и дно пластины не станет чистым. Трипсин не требуется для отслойки MH-S клеток, но может быть полезен при других типах клеток.
  5. Разделите клетки с помощью серологической пипетки или пипетки объемом 1 мл.
  6. Перенесите взвешенные элементы в коническую пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте их при температуре 200 x g в течение 6 минут.
  7. Аспирируйте надосадочную жидкость.
  8. Добавьте 1 мл среды и тщательно суспендируйте клетки.
  9. Переложите 10 μL в микроцентрифужную пробирку и добавьте 10 μL трипанового синего. Хорошо перемешайте.
  10. Перенесите 10 μL смеси клеточно-трипанового синего на одну сторону гемоцитометра или счетчика клеток.
  11. Подсчитайте количество клеток с помощью светового микроскопа или счетчика клеток.
  12. Рассчитайте плотность клеток как среднее количество живых клеток на миллилитр.
  13. Произведите расчеты для разведений, которые необходимы:
    Количество необходимых скважин x 10000-15000 ячеек = общее количество необходимых ячеек.
    Количество необходимых лунок x 80 мкл = общий объем необходимых ресуспендированных элементов.
  14. Нанесите 80 мкл клеток в необходимые лунки 96-луночного микрокультурального планшета для внеклеточного потока.
  15. Оставьте угловые лунки полностью лишенными каких-либо ячеек или сред. Эти скважины будут использоваться для фоновых измерений.
  16. Инкубируйте клетки в увлажнённом инкубаторе с температурой 37 °C с 5%CO2 в течение ночи, чтобы позволить клеткам прилипнуть и уравновеситься в микрокультуральной пластине для внеклеточного потока.
  17. Обрабатывайте MH-S клетки в 96-луночном микрокультуральном планшете для внеклеточного потока в течение 72 ч, используя шаг 1.
  18. Не менее чем за 4 ч и до 24 ч перед проведением эксперимента с биоанализатором внеклеточного потока увлажните 96-луночный картридж с внеклеточным флюсом.
    1. Снимите верхнюю часть внеклеточного флюсового пака и положите щупнутую часть флюсового пака лицевой стороной вверх на скамейку. Нанесите 200 мкл внеклеточного раствора флюсового калибра на каждую лунку в нижней части картриджа с внеклеточным флюсом.
    2. Соедините срезы вместе и оберните картридж с внеклеточным флюсом в парапленку. Поместите его в увлажнённый инкубатор с температурой 37 °C без CO2 или ванну с шариками при температуре 37 °C.
  19. Включите компьютер с дизайном анализа и откройте программное обеспечение для запуска/анализа, прикрепленное к прибору биоанализатора внеклеточного потока, чтобы дать ему нагреться не менее чем за 4 часа до проведения эксперимента.

3. Использование биоанализатора внеклеточного потока для оценки глутамина в качестве источника топлива для митохондриального дыхания в MH-S клетках

ПРИМЕЧАНИЕ: Общий обзор этой процедуры показан на рисунке 1.

  1. Проверьте обработанные Con- и EtOH культивируемые MH-S клетки под световым микроскопом и убедитесь, что клетки здоровы и прилегают к лункам в виде монослоя. Убедитесь, что клетки слиты не менее чем на 70% (идеально 90% конфлюенции) для надежного выполнения анализа.
  2. Приготовьте внеклеточную флюсовую базовую среду со следующими добавками:
    1. Аликвоту 35 мл внеклеточного флюсового основного средства в пробирку объемом 50 мл.
    2. Добавьте 350 мкл 100 мМ пирувата натрия (конечная концентрация 1 мМ), 350 мкл D-глюкозы (конечная концентрация 10 мМ) и 350 мкл GlutaMAX, который более устойчив при хранении по сравнению с L-глютамином (конечная концентрация 2 мМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Свежий L-глютамин также можно использовать в той же концентрации.
    3. Нагрейте раствор до 37 °C и убедитесь, что pH составляет 7,4 ± 0,05 при 37 °C.
  3. Аккуратно отсасывайте питательную среду из планшета для внеклеточной микрокультуры. Оставляйте как можно меньше сред без отсасывания клеток снизу. Один раз промойте не более чем 50 мкл внеклеточной базовой среды с добавлением флюса.
  4. Добавьте 180 мкл внеклеточного флюса в каждую лунку и инкубируйте планшет для внеклеточной микрокультуры в увлажнённом инкубаторе без CO2 при температуре 37 °C в течение от 30 минут до 1 часа для обеспечения равновесия.
  5. Растворяемые реагенты для тестирования окисления глютамина:
    1. В пробирку BPTES добавьте 700 мкл внеклеточной базовой среды с добавлением флюса, чтобы получить 120 мМ исходный раствор. Делайте пипеткой вверх и вниз 10 раз, чтобы правильно растворить соединение.
      ВНИМАНИЕ: BPTES вызывает раздражение кожи и глаз и может вызвать раздражение дыхательных путей. При работе с ними надевайте защитные перчатки, средства защиты глаз и лица. Утилизируйте содержимое и контейнеры в утвержденном пункте утилизации отходов.
    2. В олигомициновую пробирку добавьте 630 мкл внеклеточного флюса основной среды, чтобы получить 100 мМ исходный раствор. Делайте пипеткой вверх и вниз 10 раз, чтобы правильно растворить соединение.
    3. В пробирку FCCP добавьте 720 мкл внеклеточной базовой среды с добавлением флюса, чтобы получить 100 мМ исходный раствор. Делайте пипеткой вверх и вниз 10 раз, чтобы правильно растворить соединение.
      ВНИМАНИЕ: FCCP вреден при проглатывании, вызывает серьезные ожоги кожи и повреждение глаз, может вызвать аллергическую реакцию кожи и может вызвать долгосрочные вредные последствия для водных организмов. При обращении надевайте защитные перчатки, защитную одежду, средства защиты глаз и лица. Утилизируйте содержимое и контейнеры в утвержденном пункте утилизации отходов.
    4. В R/A пробирку добавьте 540 мкл внеклеточной базовой среды с добавлением флюса, чтобы получить исходный раствор с массой 50 мМ. Делайте пипеткой вверх и вниз 10 раз, чтобы правильно растворить соединение.
      ВНИМАНИЕ: Ротенон смертелен при проглатывании или вдыхании, вызывает раздражение кожи, вызывает серьезное раздражение глаз, может вызвать раздражение дыхательных путей и очень токсичен для водной флоры и фауны с долгосрочными последствиями. Надевайте защитные перчатки, средства защиты глаз, лица и органов дыхания. Утилизируйте содержимое и контейнеры в утвержденном пункте утилизации отходов. Антимицин А смертелен при проглатывании и очень токсичен для водных организмов с длительными последствиями. Утилизируйте содержимое и контейнеры в утвержденном пункте утилизации отходов.
  6. Приготовьте рабочие концентрации реагентов для окисления субстрата и митохондриального стресс-теста:
    1. Для BPTES смешайте 1500 мкл внеклеточной флюсовой основной среды с 500 мкл 120 мМ стокового раствора BPTES с получением рабочего раствора 30 мкМ BPTES.
    2. Для олигомицина смешивают 2520 мкл внеклеточного флюса с добавлением основной среды с 480 мкл 100 мМ олигомицина с получением рабочего раствора олигомицина с концентрацией 16 мМ.
    3. Для FCCP смешайте 2865 мкл внеклеточной флюсовой основной среды с 135 мкл 100 мМ FCCP с получением рабочего раствора 4,5 мМ FCCP.
    4. Для R/A смешайте 2700 мкл внеклеточной флюсовой основной среды с 300 мкл 50 мМ R/A с получением рабочего раствора с концентрацией 5 мМ R/A.
  7. Зарядите порты верхней части картриджа с внеклеточным флюсом следующим:
    1. Загрузите в фоновые лунки и контрольные лунки среды 20 мкл внеклеточной флюсовой основной среды в порт А, 22 мкл олигомицина в порт В, 25 мкл FCCP в порт С и 27 мкл R/A в порт D.
    2. Загрузите в лунки, содержащие клетки, 20 мкл контрольной среды или BPTES в порт A (конечная концентрация 3 мкМ для BPTES), 22 мкл олигомицина в порт B (конечная концентрация 2 мкМ для олигомицина), 25 мкл FCCP в порт C (конечная концентрация 0,5 мкМ для FCCP) и 27 мкл R/A (конечная концентрация 0,5 мкМ для R/A) в порт D.
  8. Проведите эксперимент с биоанализатором внеклеточного потока с использованием компьютерной программы для разработки и анализа анализов, которая прилагается к прибору, используя следующую стратегию выбора времени и инъекции:
    1. Для впрыска с портом A для BPTES установите количество измерений равным 6. Установите время смешивания на 3 минуты с временем ожидания 0 минут и временем измерения 3 минуты.
    2. Для инъекции с портом В для олигомицина установите количество измерений равным 3. Установите время смешивания на 3 минуты с временем ожидания 0 минут и временем измерения 3 минуты.
    3. Для впрыска с портом C для FCCP установите количество измерений равным 3. Установите время смешивания на 3 минуты с 6-минутным временем ожидания и 3-минутным временем измерения.
    4. Для впрыска с портом D для R/A установите количество измерений равным 3. Установите время смешивания на 3 минуты с временем ожидания 0 минут и временем измерения 3 минуты.
    5. Просмотрите все заданные фоны, контрольные среды и экспериментальные групповые скважины. Сохраните и запустите анализ. Во-первых, загрузите внеклеточный флюсовый пак с помощью A-D инъекций. Калибровка будет выполняться до тех пор, пока пластина ячейки не будет готова к загрузке.
    6. Удалите клеточную пластину сразу же по окончании анализа. Сохраните результаты для последующего анализа на другом устройстве.
    7. Проверьте, прилипли ли клетки к клеткам с помощью светового микроскопа. Промойте 1 раз фосфатно-солевым буфером и лизируйте клетки предпочтительным буфером для лизиса клеток. Хранить при температуре -80 °C или немедленно провести анализ на концентрацию белка.

4. Анализ результатов для оценки глутамина как источника топлива для митохондриального дыхания в MH-S клетках

  1. Извлеките белок из клеток в каждой лунке, чтобы нормализовать скорость потребления кислорода (OCR) по отношению к белку:
    1. Рассчитайте концентрацию белка (нанограммы/микролитры [нг/л]) в лунке.
    2. Рассчитайте среднюю концентрацию белка (нг/мкл) для всего микрокультурального планшета с внеклеточным потоком.
    3. Разделите концентрацию белка в каждой лунке на среднюю концентрацию белка в планшете, чтобы получить коэффициент нормализации.
    4. Примените коэффициент нормализации к интересующему файлу данных с помощью компьютерного программного обеспечения для разработки и анализа анализов.
  2. Убедитесь, что значения OCR для всех фоновых скважин близки к 0.
  3. Отмените выбор всех ячеек, где OCR составляет < 10 на исходном уровне. Данные не будут удалены, но выделенные скважины отобразятся в экспортированном файле данных.
  4. Экспортируйте данные из компьютерной программы для разработки и анализа анализов в компьютерную программу для работы с электронными таблицами.
  5. Откройте файл в компьютерной программе для работы с электронными таблицами и отсортируйте все данные, уменьшив значения OCR. Удалите фоновые скважины, скважины, которые ранее были исключены (и не были удалены), любые скважины с низкой жизнеспособностью клеток, скважины с низкой флюенсацией клеток, скважины без полного завершения стратегии закачки, скважины с неточными показаниями концентрации белка, скважины с исходным уровнем OCR < 10 и любые другие заранее определенные критерии.
  6. Отсортируйте все оставшиеся данные по измерениям, затем по группам, а затем по OCR.
  7. Усредните технические репликации каждого биологического N независимо путем измерения. Убедитесь, что существует как минимум 18 различных значений (3 исходных, 3 после среды/BPTES, 3 после олигомицина, 3 после FCCP и 6 после ротенона/антимицина А) для каждой экспериментальной группы для каждого биологического N после усреднения технических репликатов. Делайте это для каждого биологического N отдельно, чтобы стандартное отклонение или стандартная ошибка среднего могли быть рассчитаны позже для анализируемых данных.
  8. Скопируйте все усредненные значения в новую таблицу, разделив их по экспериментальным группам.
  9. Усреднить значения OCR по стратегии инъекции в каждой экспериментальной группе.
  10. Рассчитайте параметры митохондриальной биоэнергетики на основе потребления кислорода:
    1. Рассчитать базальное дыхание:
      1. Рассчитайте базальное митохондриальное дыхание следующим образом:
        Базальное митохондриальное дыхание (потребляется pmol O2 ) = ([Измерения AVG OCR #1, 2, 3 - Средние измерения OCR #16, 17, 18] x [Время #3 - Время #1])
        ПРИМЕЧАНИЕ: Базальное дыхание должно быть одинаковым между контрольной средой и группами BPTES, потому что это происходит до введения ингибитора.
      2. Рассчитайте базальное митохондриальное дыхание, не зависящее от глутамина, следующим образом:
        Базальное митохондриальное дыхание не зависит от глутамина (потребляется pmol O2 ) = ([Измерения AVG OCR #4, 5, 6, 7, 8, 9 - Измерения AVG OCR #16, 17, 18] x [Время #9 - Время #4])
        Базальное митохондриальное дыхание, не зависящее от глутамина, должно быть меньше, чем базальное митохондриальное дыхание, если только клетки не сильно зависят от глутамина.
      3. Рассчитайте базальное митохондриальное дыхание в зависимости от глютамина следующим образом:
        Базальное митохондриальное дыхание зависит от глутамина (потребляется pmol O2 ) = ([Измерения AVG OCR #1, 2, 3 - Измерения AVG OCR #4, 5, 6, 7, 8, 9] x [Время #9 - Время #4])
        ПРИМЕЧАНИЕ: Общее базальное митохондриальное дыхание не следует вычитать из базального митохондриального дыхания, и оно не должно зависеть от глутамина, поскольку они рассчитываются в разные моменты времени.
    2. Рассчитайте дыхание, связанное с АТФ, следующим образом:
      1. Рассчитайте общее митохондриальное дыхание, связанное с АТФ, от всех видов топлива следующим образом:
        Общее митохондриальное дыхание, связанное с АТФ, от всех видов топлива (pmol O2 потребляется) = ([Измерения AVG OCR #1, 2, 3 - Измерения AVG OCR #10, 11, 12] x [Время #12 - Время #10])
        ПРИМЕЧАНИЕ: Среднее значение OCR для измерений #10, 11 и 12 должно быть одинаковым между контрольной средой и группами BPTES, поскольку олигомицин должен сильно ингибировать АТФ-синтазу, а ингибирование одного топливного пути не должно изменять общее АТФ-связанное дыхание.
      2. Рассчитайте АТФ-сцепленное митохондриальное дыхание, не зависящее от глутамина, следующим образом:
        АТФ-связанное митохондриальное дыхание не зависит от глутамина (потребляется pmol O2 ) = ([Измерения AVG OCR #4, 5, 6, 7, 8, 9 - Измерения AVG OCR #10, 11, 12] x [Время #12 - Время #10])
        ПРИМЕЧАНИЕ: АТФ-сцепленное митохондриальное дыхание, не зависящее от глутамина, должно быть меньше, чем АТФ-сцепленное митохондриальное дыхание, если клетки не сильно зависят от глутамина.
      3. Рассчитайте АТФ-сцепленное митохондриальное дыхание в зависимости от глутамина следующим образом:
        АТФ-связанное митохондриальное дыхание зависит от глутамина (потребляется pmol O2 ) = Общее АТФ-связанное митохондриальное дыхание от всех видов топлива - АТФ-связанное митохондриальное дыхание не зависит от глутамина
    3. Рассчитайте максимальное дыхание следующим образом:
      1. Рассчитайте общее максимальное митохондриальное дыхание следующим образом:
        Общее максимальное митохондриальное дыхание (потреблено pmol O2 ) = ([Измерения AVG OCR #13, 14, 15 - Измерения AVG OCR #16, 17, 18] x [Время #15 - Время #13])
      2. Рассчитайте максимальное митохондриальное дыхание, не зависящее от глютамина, следующим образом:
        Максимальное митохондриальное дыхание не зависит от глутамина (потребляется pmol O2 ) = ([Измерения AVG OCR #13, 14, 15 групп BPTES - Измерения AVG OCR #16, 17, 18 групп BPTES] x [Время #15 - #Time 13])
      3. Рассчитайте максимальное митохондриальное дыхание в зависимости от глютамина следующим образом:
        Максимальное митохондриальное дыхание зависит от глутамина (потребляется pmol O2 ) = Общее максимальное митохондриальное дыхание от всех видов топлива - Максимальное митохондриальное дыхание не зависит от глутамина
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот расчет может быть использован для определения зависимости ячейки от резервной емкости глютамина по сравнению с другими видами топлива. Чем больше максимальное митохондриальное дыхание, тем больше зависимость от глутамина, которая может быть выражена в группах BPTES - контрольных группах, показывающих потерю максимального митохондриального дыхания или в процентах от общего дыхания.
    4. Рассчитать запасную дыхательную способность можно следующим образом:
      1. Рассчитайте общую резервную дыхательную способность следующим образом:
        Общая запасная дыхательная способность (израсходовано pmol O2 ) = ([Измерения AVG OCR #13, 14, 15 - Измерения AVG OCR #1, 2, 3] x [Время #15 - Время #13])
      2. Рассчитать запасную дыхательную способность не зависящую от глутамина можно следующим образом:
        Резервная дыхательная способность не зависит от глутамина (потребляется pmol O2 ) = ([Измерения AVG OCR #13, 14, 15 групп BPTES - Измерения AVG OCR #1, 2, 3 групп BPTES] x [Время #15 - Время #13])
      3. Рассчитайте запасную дыхательную способность в зависимости от глутамина следующим образом:
        Резервная дыхательная способность зависит от глутамина (потребляется pmol O2 ) = Общая резервная дыхательная способность от всех видов топлива - Резервная дыхательная способность не зависит от глутамина
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот расчет отражает гибкость клеток, зависящих от глютамина, и то, могут ли они достичь лучшего дыхания без глютамина, когда это необходимо.
  11. Вычтите контрольную среду по группам ингибиторов и при желании нормализуйте потребляемый pmolO2 по отношению к контрольной группе.
  12. Создание графиков биоэнергетических профилей OCR (pmol O2/min), базального дыхания (pmol O2), АТФ-связанного дыхания (pmol O2), максимального дыхания (pmol O2) и резервной дыхательной способности (pmol O2) в зависимости от глутамина.
  13. Отображайте значения митохондриальных биоэнергетических конечных точек на гистограммах или выражайте как средства групп ингибиторов по отношению к контрольным группам среды. Если каждый биологический N вычисляется отдельно, то вычисляется стандартное отклонение или стандартная ошибка среднего значения для анализируемых данных по всем биологическим N.

5. Статистический анализ

  1. Выполняйте все статистические анализы с использованием соответствующего программного обеспечения для анализа данных.
  2. Для линейных точек биоэнергетических профилей OCR выполните двусторонний ANOVA с последующим апостериорным анализом Тьюки для сравнения данных из этих четырех экспериментальных групп с двумя факторами (стратегия лечения и инъекции): Con + среда, Con + BPTES, EtOH + среда и EtOH + BPTES.
  3. Для получения гистограмм базального дыхания, АТФ-связанного дыхания, максимального дыхания и резервной дыхательной способности, зависящей от глутамина, проведите анализ t-критерия Стьюдента для сравнения данных двух экспериментальных групп: Con + BPTES и EtOH + BPTES.
  4. Представление данных в виде средств ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). Рассмотрим p < 0,05 статистически значимыми.

Результаты

Хроническое воздействие EtOH снижает зависимость от глутамина в MH-S клетках.
Глутаминолиз является важнейшим путем для митохондриального дыхания, поддерживая глутамин в качестве важного источника топлива для клеточной биоэнергетики. Чтобы определить, изме?...

Обсуждение

Представленные здесь данные представляют собой дополнительные биологические репликации для необработанных и хронически подверженных воздействию EtOH MH-S клеток, обработанных контролем среды или BPTES, которые опубликованы в Crotty et al.11. Описанный протокол ис?...

Раскрытие информации

У всех авторов нет соответствующих финансовых конфликтов интересов, о которых можно было бы сообщить.

Благодарности

Мы выражаем признательность Саре С. Чанг, бакалавру наук, за ее вклад в создание начальной клеточной культуры и подготовку MH-S клеток к экспериментам. Эта работа была поддержана NIAAA R01-AA026086 для SMY (ORCID: 0000-0001-9309-0233), NIAAA F31-F31AA029938 для KMC и NIGMS T32-GM008602 для Рэнди Холла, факультет фармакологии и химической биологии, Университет Эмори. Содержание настоящего доклада не отражает точку зрения Департамента по делам ветеранов или правительства США.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tube VWR International, Inc.21008-670Used for preparing stock concentrations of mitochondria-related reagents.
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich Co.M6250Used for culturing MH-S cells.
Cell scraperDot Scientific, Inc.70-1180Used for scraping MH-S cells from T-75 flasks.
Countess 3 FL Instrument: cell counterFisher Scientific CompanyAMQAF2000Used for counting the number of MH-S cells to plate for experiments.
D-glucose Sigma Aldrich Co.G8270Used for the extracellular flux base medium.
EthanolFisher Scientific Company4355720Experimental treatment for MH-S cells.
Fetal bovine serumSciencell Research Laboratories500Used for culturing MH-S cells.
GentamicinSigma Aldrich Co.G1397Used for culturing MH-S cells.
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Used for the extracellular flux base medium.
GraphPad Prism 10.2.3GraphPad SoftwareN/ASoftware for statistical analysis. Downloadable after purchase at https://www.graphpad.com/features.
MH-S cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-2019Mouse alveolar macrophage cell line.
Microcentrifuge tube USA Scientific, Inc.4036-3212Used for preparing working concentrations of mitochondria-related reagents.
Microsoft 365 Excel: computer spreadsheet programMicrosoftN/ASoftware for data organization and mitochondrial bioenergetics calculations. Downloadable after purchase at https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Penicillin/streptomycinFisher Scientific Company15140122Used for culturing MH-S cells.
Phosphate buffered salineVWR International, Inc.45000-446Used for washing MH-S cells.
RPMI-1640VWR International, Inc.45000-396Used for culturing MH-S cells.
Seahorse Wave Pro Software: computer software program for assay design and analysisAgilent Technologies, Inc.N/AThe computer is attached to the Seahorse XF Pro Analyzer instrument. Downloadable from  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: extracellular flux base medium, pH 7.4Agilent Technologies, Inc.103334-100Used for preparing stock and working concentrations of mitochondria-related reagents and culturing MH-S cells prior to experimental runs.
Seahorse XF Glutamine Oxidation Stress Test KitAgilent Technologies, Inc.103674-100Contains stock BPTES, oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A.
Seahorse XF Pro Analyzer: extracellular flux bioanalyzerAgilent Technologies, Inc.N/AExtracellular flux bioanalyzer.
Seahorse XFe96 FluxPak: 96-well extracellular flux pak cartridges, 96-well extracellular flux microculture plates, and calibrant solutionAgilent Technologies, Inc.102416-100Used to prepare MH-S cells for assays using an extracellular flux bioanalyzer.
Serological pipet Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-550678Used for removing media from MH-S cells.
Sodium bicarbonateSigma Aldrich Co.S6014Used for culturing MH-S cells.
Sodium pyruvate Sigma Aldrich Co.P4562Used for the extracellular flux base medium.
T-75 flasksSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-200263Used for culturing MH-S cells.

Ссылки

  1. . 2021 National Survey on Drug Use and Health (NSDUH). Table 5.6A - Alcohol Use Disorder in Past Year: Among People Aged 12 or Older; by Age Group and Demographic Characteristics, Numbers in Thousands, 2021 Available from: https://www.samhsa.gov/data/sites/default/files/reports/rpt39441/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetailedTabs2021/NSDUHDetTabsSect5pe2021.htm (2021)
  2. Everts, R. J., et al. Nosocomial pneumonia in adult general medical and surgical patients at Christchurch Hospital. N Z Med J. 113 (1111), 221-224 (2000).
  3. de Roux, A., et al. Impact of alcohol abuse in the etiology and severity of community-acquired pneumonia. Chest. 129 (5), 1219-1225 (2006).
  4. Moss, M. Epidemiology of sepsis: race, sex, and chronic alcohol abuse. Clin Infect Dis. 41 (Suppl 7), S490-S497 (2005).
  5. Fernandez-Sola, J., et al. High alcohol intake as a risk and prognostic factor for community-acquired pneumonia. Arch Intern Med. 155 (15), 1649-1654 (1995).
  6. Yeligar, S. M., Harris, F. L., Hart, C. M., Brown, L. A. Glutathione attenuates ethanol-induced alveolar macrophage oxidative stress and dysfunction by downregulating NADPH oxidases. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 306 (5), L429-L441 (2014).
  7. Yeligar, S. M., Mehta, A. J., Harris, F. L., Brown, L. A., Hart, C. M. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma regulates chronic alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction. Am J Respir Cell Mol Biol. 55 (1), 35-46 (2016).
  8. Liang, Y., Harris, F. L., Brown, L. A. Alcohol induced mitochondrial oxidative stress and alveolar macrophage dysfunction. Biomed Res Int. 2014, 371593 (2014).
  9. Liang, Y., Harris, F. L., Jones, D. P., Brown, L. A. Alcohol induces mitochondrial redox imbalance in alveolar macrophages. Free Radic Biol Med. 65, 1427-1434 (2013).
  10. Morris, N. L., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Yeligar, S. M. Alcohol induces mitochondrial derangements in alveolar macrophages by upregulating NADPH oxidase 4. Alcohol. 90, 27-38 (2021).
  11. Crotty, K. M., Kabir, S. A., Chang, S. S., Mehta, A. J., Yeligar, S. M. Pioglitazone reverses alcohol-induced alterations in alveolar macrophage mitochondrial phenotype. Alcohol Clin Exp Res (Hoboken). 48 (5), 810-826 (2024).
  12. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: A key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795 (2019).
  13. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biol Chem. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  14. Chacko, B. K., et al. The Bioenergetic Health Index: a new concept in mitochondrial translational research. Clin Sci (Lond). 127 (6), 367-373 (2014).
  15. Fan, Y., et al. Analyzing mitochondrial respiration of human induced pluripotent stem cell-derived myeloid progenitors using Seahorse technology. STAR Protoc. 4 (1), 102073 (2023).
  16. Gu, X., Ma, Y., Liu, Y., Wan, Q. Measurement of mitochondrial respiration in adherent cells by Seahorse XF96 Cell Mito Stress Test. STAR Protoc. 2 (1), 100245 (2021).
  17. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850 (2018).
  18. Winnica, D., et al. Bioenergetic differences in the airway epithelium of lean versus obese asthmatics are driven by nitric oxide and reflected in circulating platelets. Antioxid Redox Signal. 31 (10), 673-686 (2019).
  19. Nickens, K. P., Wikstrom, J. D., Shirihai, O. S., Patierno, S. R., Ceryak, S. A bioenergetic profile of non-transformed fibroblasts uncovers a link between death-resistance and enhanced spare respiratory capacity. Mitochondrion. 13 (6), 662-667 (2013).
  20. Mdaki, K. S., Larsen, T. D., Weaver, L. J., Baack, M. L. Age related bioenergetics profiles in isolated rat cardiomyocytes using extracellular flux analyses. PLoS One. 11 (2), e0149002 (2016).
  21. Dranka, B. P., et al. Assessing bioenergetic function in response to oxidative stress by metabolic profiling. Free Radic Biol Med. 51 (9), 1621-1635 (2011).
  22. Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
  23. Tyrrell, D. J., Bharadwaj, M. S., Jorgensen, M. J., Register, T. C., Molina, A. J. Blood cell respirometry is associated with skeletal and cardiac muscle bioenergetics: Implications for a minimally invasive biomarker of mitochondrial health. Redox Biol. 10, 65-77 (2016).
  24. Shah-Simpson, S., Pereira, C. F., Dumoulin, P. C., Caradonna, K. L., Burleigh, B. A. Bioenergetic profiling of Trypanosoma cruzi life stages using Seahorse extracellular flux technology. Mol Biochem Parasitol. 208 (2), 91-95 (2016).
  25. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. 46, e2511 (2010).
  26. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).
  27. Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Anal Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).
  28. Yeligar, S. M., et al. PPARgamma regulates mitochondrial structure and function and human pulmonary artery smooth muscle cell proliferation. Am J Respir Cell Mol Biol. 58 (5), 648-657 (2018).
  29. Yeligar, S., Tsukamoto, H., Kalra, V. K. Ethanol-induced expression of ET-1 and ET-BR in liver sinusoidal endothelial cells and human endothelial cells involves hypoxia-inducible factor-1alpha and microrNA-199. J Immunol. 183 (8), 5232-5243 (2009).
  30. Yeligar, S. M., Harris, F. L., Brown, L. A. S., Hart, C. M. Pharmacological reversal of post-transcriptional alterations implicated in alcohol-induced alveolar macrophage dysfunction. Alcohol. 106, 30-43 (2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

BPTES

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены