Оценка глутамина в качестве источника топлива для альвеолярных макрофагов, подвергшихся воздействию хронического этанола, с помощью биоанализатора внеклеточного потока

Резюме

Злоупотребление алкоголем ухудшает иммунитет альвеолярных макрофагов (АМ) из-за угнетения митохондриального дыхания и биоэнергетики. Недавно мы продемонстрировали, что воздействие этанола (EtOH) увеличивает зависимость от глутамина для митохондриального дыхания при АМ. В данной работе представлены методы определения использования глутамина для митохондриального дыхания в АМ, обработанных EtOH, с использованием биоанализатора внеклеточного потока.

Аннотация

Альвеолярные макрофаги (АМ) являются первой линией клеточной защиты нижних дыхательных путей от патогенов. Тем не менее, хроническое и чрезмерное употребление алкоголя ухудшает способность АМ фагоцитировать и выводить патогены из альвеолярного пространства, отчасти из-за нарушения регуляции топливного метаболизма и биоэнергетики. Наша предыдущая работа показала, что хроническое потребление этанола (EtOH) ухудшает митохондриальную биоэнергетику и повышает уровень лактата в АМ. Кроме того, недавно мы продемонстрировали, что EtOH увеличивает зависимость от глютамина и глютамин-зависимое максимальное дыхание при одновременном снижении гибкости, переходя от пируват-зависимого дыхания к глутамин-зависимому дыханию. Глутаминолиз является важным компенсаторным путем для митохондриального дыхания, когда пируват используется для производства молочной кислоты или когда других источников топлива недостаточно. Используя мышиную линию АМ-клеток, MH-S клетки, подвергшиеся воздействию либо отсутствия EtOH, либо EtOH (0,08%) в течение 72 ч, мы определили зависимость митохондриального дыхания и биоэнергетики от глутамина в качестве источника топлива с помощью биоанализатора внеклеточного потока. Измерения в режиме реального времени проводили в ответ на бис-2-(5-фенилацетамидо-1,3,4-тиадиазол-2-ил) этилсульфид (BPTES), ингибитор глутаминазы 1, который предотвращает ферментативное превращение глутамина в глутамат, в носителе среды или в ответ только на носитель, с последующим тестированием митохондриального стресса. Пошаговый протокол, представленный в настоящем документе, описывает наши методы и расчеты для анализа средних уровней глутамин-зависимого базального митохондриального дыхания, митохондриального АТФ-связанного дыхания, максимального митохондриального дыхания и митохондриальной резервной дыхательной способности в нескольких биологических и экспериментальных репликациях.

Введение

Расстройство, связанное с употреблением алкоголя (AUD), затрагивает более 28 миллионов человек в Соединенных Штатах¹. У людей с AUD вероятность развития респираторных инфекций в ^{2-4 раза выше2,3}, что повышает риск преждевременной заболеваемости и смертности ^3,4,5. Злоупотребление алкоголем повышает восприимчивость к респираторным инфекциям, отчасти за счет подавления иммунной функции легких. Альвеолярные макрофаги (АМ) являются первой линией клеточной защиты от....

протокол

1. Хроническое воздействие этиона in vitro

1. Культивирование MH-S клеток, линии альвеолярных макрофагов мыши, в полной среде, содержащей RPMI-1640 с 10% фетальной бычьей сыворотки, 1% пенициллин/стрептомицина, 11,9 мМ бикарбоната натрия, 40 мг/мл гентамицина и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола при 37°C с 5%_CO2 в увлажненном инкубаторе.
2. Культивируемые MH-S клетки с EtOH или без него (0,8 мг/мл или 0,08%) в течение 72 ч, при этом EtOH следует менять каждые 24 ч. Инкубировать MH-S клетки, обработанные EtOH, при 37 °C с 5% CO₂ в отдельном увлажненном инкубаторе, с....

Результаты

Хроническое воздействие EtOH снижает зависимость от глутамина в MH-S клетках.
Глутаминолиз является важнейшим путем для митохондриального дыхания, поддерживая глутамин в качестве важного источника топлива для клеточной биоэнергетики. Чтобы определить, изме?.......

Обсуждение

Представленные здесь данные представляют собой дополнительные биологические репликации для необработанных и хронически подверженных воздействию EtOH MH-S клеток, обработанных контролем среды или BPTES, которые опубликованы в Crotty et ^al.11. Описанный протокол ис?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tube	VWR International, Inc.	21008-670	Used for preparing stock concentrations of mitochondria-related reagents.
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich Co.	M6250	Used for culturing MH-S cells.
Cell scraper	Dot Scientific, Inc.	70-1180	Used for scraping MH-S cells from T-75 flasks.
Countess 3 FL Instrument: cell counter	Fisher Scientific Company	AMQAF2000	Used for counting the number of MH-S cells to plate for experiments.
D-glucose	Sigma Aldrich Co.	G8270	Used for the extracellular flux base medium.
Ethanol	Fisher Scientific Company	4355720	Experimental treatment for MH-S cells.
Fetal bovine serum	Sciencell Research Laboratories	500	Used for culturing MH-S cells.
Gentamicin	Sigma Aldrich Co.	G1397	Used for culturing MH-S cells.
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Used for the extracellular flux base medium.
GraphPad Prism 10.2.3	GraphPad Software	N/A	Software for statistical analysis. Downloadable after purchase at https://www.graphpad.com/features.
MH-S cells	American Type Culture Collection	CRL-2019	Mouse alveolar macrophage cell line.
Microcentrifuge tube	USA Scientific, Inc.	4036-3212	Used for preparing working concentrations of mitochondria-related reagents.
Microsoft 365 Excel: computer spreadsheet program	Microsoft	N/A	Software for data organization and mitochondrial bioenergetics calculations. Downloadable after purchase at https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Penicillin/streptomycin	Fisher Scientific Company	15140122	Used for culturing MH-S cells.
Phosphate buffered saline	VWR International, Inc.	45000-446	Used for washing MH-S cells.
RPMI-1640	VWR International, Inc.	45000-396	Used for culturing MH-S cells.
Seahorse Wave Pro Software: computer software program for assay design and analysis	Agilent Technologies, Inc.	N/A	The computer is attached to the Seahorse XF Pro Analyzer instrument. Downloadable from  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: extracellular flux base medium, pH 7.4	Agilent Technologies, Inc.	103334-100	Used for preparing stock and working concentrations of mitochondria-related reagents and culturing MH-S cells prior to experimental runs.
Seahorse XF Glutamine Oxidation Stress Test Kit	Agilent Technologies, Inc.	103674-100	Contains stock BPTES, oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A.
Seahorse XF Pro Analyzer: extracellular flux bioanalyzer	Agilent Technologies, Inc.	N/A	Extracellular flux bioanalyzer.
Seahorse XFe96 FluxPak: 96-well extracellular flux pak cartridges, 96-well extracellular flux microculture plates, and calibrant solution	Agilent Technologies, Inc.	102416-100	Used to prepare MH-S cells for assays using an extracellular flux bioanalyzer.
Serological pipet	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-550678	Used for removing media from MH-S cells.
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich Co.	S6014	Used for culturing MH-S cells.
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich Co.	P4562	Used for the extracellular flux base medium.
T-75 flasks	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-200263	Used for culturing MH-S cells.