Modulatic Flux Bioanalyzer를 사용하여 만성 에탄올에 노출된 폐포 대식세포의 연료 공급원으로서의 글루타민 평가

요약

알코올 남용은 미토콘드리아 호흡 및 생체 에너지학의 억제로 인해 폐포 대식세포(AM) 면역을 손상시킵니다. 우리는 최근에 에탄올(EtOH) 노출이 AM에서 미토콘드리아 호흡에 대한 글루타민 의존성을 증가시킨다는 것을 입증했습니다. 본 명세서에서는 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 EtOH 처리된 AM에서 미토콘드리아 호흡을 위한 글루타민의 사용을 결정하기 위한 방법을 제공합니다.

초록

폐포 대식세포(AM)는 병원균에 대항하는 하부 기도의 세포 방어선입니다. 그러나 만성적이고 과도한 알코올 사용은 부분적으로 조절 장애 연료 대사 및 생체 에너지학을 통해 폐포 공간에서 병원체를 식세포화하고 제거하는 AM의 능력을 손상시킵니다. 당사의 이전 연구에 따르면 만성 에탄올(EtOH) 섭취는 미토콘드리아 생체 에너지를 손상시키고 AM의 젖산 수치를 증가시킵니다. 또한, EtOH는 최근 글루타민 의존성과 글루타민 의존성 최대 호흡을 증가시키는 동시에 유연성을 감소시켜 피루브산 의존성 호흡에서 글루타민 의존성 호흡으로 전환한다는 것을 입증했습니다. 글루타미누라이시스(Glutaminolysis)는 피루브산이 젖산 생성에 사용되거나 다른 연료원이 불충분할 때 미토콘드리아 호흡에 대한 중요한 보상 경로입니다. 72시간 동안 EtOH가 없거나 EtOH(0.08%)에 노출된 마우스 AM 세포주, MH-S 세포를 사용하여 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 연료 공급원으로 글루타민에 대한 미토콘드리아 호흡 및 생체 에너지학의 의존성을 측정했습니다. 글루타민이 글루타메이트로 효소로 전환되는 것을 방지하는 글루타미나제 1의 억제제인 비스-2-(5-페닐아타미도-1,3,4-티아디아졸-2-일) 에틸 설파이드(BPTES)에 대응하여 매체 차량 또는 차량 단독에 대한 반응으로 실시간 측정을 수행한 후 미토콘드리아 스트레스를 테스트했습니다. 여기에 제공된 단계별 프로토콜은 여러 생물학적 및 실험적 복제에 걸쳐 글루타민 의존성 기저 미토콘드리아 호흡, 미토콘드리아 ATP 연관 호흡, 최대 미토콘드리아 호흡 및 미토콘드리아 예비 호흡 용량의 평균 수준을 분석하기 위한 당사의 방법 및 계산을 설명합니다.

서문

알코올 사용 장애(AUD)는 미국에서 2,800만 명 이상의 사람들에게 영향을 미칩니다¹. AUD 환자는 호흡기 감염이 발생할 가능성이 2-4배 더 높으며 ^2,3 조기 이환율 및 사망률 ^3,4,5 위험을 증가시킵니다. 알코올 남용은 호흡기 감염에 대한 감수성을 증가시키는데, 그 이유 중 하나는 폐 면역 기능을 억제하기 때문입니다. 폐포 대식세포(AM)는 폐 하부에 있는 병원체에 대한 세포 방어의 첫 번째 방어선으로, 병원균을 식세포화하고 흡입한 미생물을 제거합니다. 그러나 만성적인 알코올 섭취는 병원체를 집어삼키고 죽이는 AM의 능력을 손상시킵니다 ^6,7.

식세포작용(phagocytosis)과 같은 AM의 면역 기능은 높은 아데노신 삼인산(ATP) 생성에 필요한 대사 ....

프로토콜

1. 시험관 내 만성 EtOH 노출

1. 가습 인큐베이터에서 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린/스트렙토마이신, 11.9mM 중탄산 나트륨, 40mg/mL 겐타마이신 및 50μM 2-메르캅토에탄올이 포함된 RPMI-1640을 포함하는 완전한_{배지에서 생} 쥐 폐포 대식세포 세포주를 배양합니다.
2. 배양된 MH-S 세포를 EtOH(0.8mg/mL 또는 0.08%)와 함께 또는 없이 72시간 동안 처리하며, 여기서 EtOH는 24시간마다 교체해야 합니다. 인큐베이터 물에 0.08% EtOH가 포함된 별도의 가습 인큐베이터에서 37°C에서 5% CO₂ 로 EtOH 처리된 MH-S 세포를 배양합니다.

2. 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 글루타민을 연료원으로 평가하기 위한 MH-S 세포 도금

1. 처리되지 않은 대조군(Con) 및 만성 EtOH 처리된 MH-S 세포가 T-75 플라스크에서 최소 50% 밀도(70%-90% 밀도가 이상적)로 성장하여 96웰 세포외 플럭스 미세배양 플레이....

결과

만성 EtOH 노출은 MH-S 세포의 글루타민 의존성을 감소시킵니다.
글루타민 용해는 미토콘드리아 호흡을 위한 중요한 경로로, 세포 생체 에너지학의 중요한 연료 공급원으로서 글루타민을 지원합니다. EtOH에 대한 만성 노출이 미토콘드리아 호흡을 위한 연료 공급원인 글루타민에 대한 MH-S 세포의 의존성을 변화시키는지 확인하기 위해 MH-S 세포를 EtOH 대조군(Co.......

토론

본 명세서에 제시된 데이터는 배지 제어 또는 BPTES로 처리된 치료되지 않은 만성 EtOH 노출 MH-S 세포에 대한 추가적인 생물학적 복제물이며, 이는 Crotty et ^al.11에 발표되어 있다. 설명된 프로토콜은 세포외 플럭스 바이오분석기를 사용하여 미토콘드리아 호흡 및 생체 에너지학을 위한 연료 공급원인 글루타민에 대한 EtOH 노출 MH-S 세포의 의존성을 평가하는 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical tube	VWR International, Inc.	21008-670	Used for preparing stock concentrations of mitochondria-related reagents.
2-mercaptoethanol	Sigma Aldrich Co.	M6250	Used for culturing MH-S cells.
Cell scraper	Dot Scientific, Inc.	70-1180	Used for scraping MH-S cells from T-75 flasks.
Countess 3 FL Instrument: cell counter	Fisher Scientific Company	AMQAF2000	Used for counting the number of MH-S cells to plate for experiments.
D-glucose	Sigma Aldrich Co.	G8270	Used for the extracellular flux base medium.
Ethanol	Fisher Scientific Company	4355720	Experimental treatment for MH-S cells.
Fetal bovine serum	Sciencell Research Laboratories	500	Used for culturing MH-S cells.
Gentamicin	Sigma Aldrich Co.	G1397	Used for culturing MH-S cells.
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Used for the extracellular flux base medium.
GraphPad Prism 10.2.3	GraphPad Software	N/A	Software for statistical analysis. Downloadable after purchase at https://www.graphpad.com/features.
MH-S cells	American Type Culture Collection	CRL-2019	Mouse alveolar macrophage cell line.
Microcentrifuge tube	USA Scientific, Inc.	4036-3212	Used for preparing working concentrations of mitochondria-related reagents.
Microsoft 365 Excel: computer spreadsheet program	Microsoft	N/A	Software for data organization and mitochondrial bioenergetics calculations. Downloadable after purchase at https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Penicillin/streptomycin	Fisher Scientific Company	15140122	Used for culturing MH-S cells.
Phosphate buffered saline	VWR International, Inc.	45000-446	Used for washing MH-S cells.
RPMI-1640	VWR International, Inc.	45000-396	Used for culturing MH-S cells.
Seahorse Wave Pro Software: computer software program for assay design and analysis	Agilent Technologies, Inc.	N/A	The computer is attached to the Seahorse XF Pro Analyzer instrument. Downloadable from  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: extracellular flux base medium, pH 7.4	Agilent Technologies, Inc.	103334-100	Used for preparing stock and working concentrations of mitochondria-related reagents and culturing MH-S cells prior to experimental runs.
Seahorse XF Glutamine Oxidation Stress Test Kit	Agilent Technologies, Inc.	103674-100	Contains stock BPTES, oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A.
Seahorse XF Pro Analyzer: extracellular flux bioanalyzer	Agilent Technologies, Inc.	N/A	Extracellular flux bioanalyzer.
Seahorse XFe96 FluxPak: 96-well extracellular flux pak cartridges, 96-well extracellular flux microculture plates, and calibrant solution	Agilent Technologies, Inc.	102416-100	Used to prepare MH-S cells for assays using an extracellular flux bioanalyzer.
Serological pipet	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-550678	Used for removing media from MH-S cells.
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich Co.	S6014	Used for culturing MH-S cells.
Sodium pyruvate	Sigma Aldrich Co.	P4562	Used for the extracellular flux base medium.
T-75 flasks	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-200263	Used for culturing MH-S cells.