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  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

L’abus d’alcool altère l’immunité des macrophages alvéolaires (MA) en raison de la suppression de la respiration mitochondriale et de la bioénergétique. Nous avons récemment démontré que l’exposition à l’éthanol (EtOH) augmente la dépendance à la glutamine pour la respiration mitochondriale dans les MA. Dans le présent document, des méthodes sont fournies pour déterminer l’utilisation de la glutamine pour la respiration mitochondriale dans les MA traités à l’EtOH à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire.

Résumé

Les macrophages alvéolaires (MA) sont la première ligne de défense cellulaire dans les voies respiratoires inférieures contre les agents pathogènes. Cependant, la consommation chronique et excessive d’alcool altère la capacité des MA à phagocyter et à éliminer les agents pathogènes de l’espace alvéolaire, en partie à cause d’un métabolisme de carburant dérégulé et de la bioénergétique. Nos travaux antérieurs ont montré que la consommation chronique d’éthanol (EtOH) altère la bioénergétique mitochondriale et augmente les niveaux de lactate dans les MA. De plus, nous avons récemment démontré que l’EtOH augmente la dépendance à la glutamine et la respiration maximale dépendante de la glutamine tout en diminuant la flexibilité, s’éloignant de la respiration dépendante du pyruvate et se rapprochant de la respiration dépendante de la glutamine. La glutaminolyse est une voie compensatoire importante pour la respiration mitochondriale lorsque le pyruvate est utilisé pour la production d’acide lactique ou lorsque les autres sources de carburant sont insuffisantes. À l’aide d’une lignée cellulaire de souris AM, des cellules MH-S, exposées à l’absence d’EtOH ou d’EtOH (0,08 %) pendant 72 h, nous avons déterminé la dépendance de la respiration mitochondriale et de la bioénergétique à la glutamine comme source de carburant à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire. Des mesures en temps réel ont été effectuées en réponse au sulfure d’éthyle de bis-2-(5-phénylacétamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES), un inhibiteur de la glutaminase 1, qui empêche la conversion enzymatique de la glutamine en glutamate, dans le véhicule média ou en réponse au véhicule seul, suivies d’un test du stress mitochondrial. Le protocole étape par étape fourni ici décrit nos méthodes et calculs pour analyser les niveaux moyens de respiration mitochondriale basale dépendante de la glutamine, de respiration mitochondriale liée à l’ATP, de respiration mitochondriale maximale et de capacité respiratoire de réserve mitochondriale dans plusieurs répétitions biologiques et expérimentales.

Introduction

Le trouble lié à la consommation d’alcool (AUD) touche plus de 28 millions de personnes aux États-Unis1. Les personnes atteintes de TCA sont 2 à 4 fois plus susceptibles de développer des infections respiratoires 2,3, ce qui augmente le risque de morbidité et de mortalité prématurées 3,4,5. L’abus d’alcool augmente la susceptibilité aux infections respiratoires, en partie en supprimant la fonction immunitaire pulmonaire. Les macrophages alvéolaires (MA) sont la première ligne de défense cellulaire contre les agents pathogènes dans les poumons inférieurs, où ils phagocytent et éliminent les microbes inhalés. Cependant, la consommation chronique d’alcool altère la capacité des MA à engloutir et à tuer les agents pathogènes 6,7.

Les fonctions immunitaires des MA, telles que la phagocytose, sont des processus exigeants en énergie qui nécessitent des voies métaboliquement actives nécessaires à la génération d’une forte production d’adénosine triphosphate (ATP). La phosphorylation oxydative mitochondriale est le processus cellulaire le plus efficace pour produire de l’ATP, mais l’exposition chronique à l’éthanol (EtOH) augmente le stress oxydatif dérivé des mitochondries, ce qui peut entraîner un dysfonctionnement mitochondrial dans les MA 8,9,10. La respiration mitochondriale mesurée à l’aide du taux de consommation d’oxygène cellulaire (OCR) peut être quantifiée à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire en temps réel. Les profils respiratoires mitochondriaux évalués en réponse à l’oligomycine (inhibiteur de l’ATP synthase), au cyanure de carbonyle-p-trifluorométhoxyphénylhydrazone (FCCP, découpleur de protons) et à la roténone/antimycine A (R/A, inhibiteurs des complexes mitochondriaux I et III, respectivement) sont utilisés pour déterminer la bioénergétique mitochondriale. L’EtOH chronique diminue la bioénergie mitochondriale dans les MA, comme en témoigne la diminution de la respiration basale mitochondriale, de la respiration liée à l’ATP, de la respiration maximale et de la capacité respiratoire de réserve10.

Les cellules ont différents niveaux de dépendance vis-à-vis des sources de carburants, telles que le pyruvate, la glutamine ou les acides gras, pour la production d’ATP. Ils ont également un niveau de flexibilité qui leur permet de changer l’utilisation du carburant pour réguler la bioénergie cellulaire. La glutaminolyse est une voie clé pour la respiration mitochondriale, en particulier lorsque le pyruvate est dérivé vers la production d’acide lactique ou lorsque les acides gras sont insuffisants. Notre étude récente a montré que l’exposition chronique à l’EtOH augmente la dépendance du matin à la glutamine et diminue la flexibilité du matin à utiliser la glutamine et d’autres sources de carburant pour la respiration mitochondriale11. Ces résultats, ainsi que les données démontrant que le traitement des cellules MH-S exposées à l’EtOH avec l’inhibiteur de l’oxydation du pyruvate UK5099 n’a pas altéré la bioénergétique mitochondriale par rapport aux cellules MH-S exposées au contrôle des milieux traitées avec UK5099, suggèrent un changement de la respiration dépendante du pyruvate vers une respiration dépendante de la glutamine dans les cellules MH-S EtOH. Cependant, ce changement est insuffisant pour répondre aux demandes bioénergétiques de la FA11. Dans cet article, nous décrivons les méthodes d’évaluation de la glutamine en tant que source de carburant pour la respiration mitochondriale dans les MA chroniques exposées à l’EtOH à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire. Ce protocole a été créé et optimisé pour un format de 96 puits (11,04 mm2 surface) et doit être ajusté pour des puits de culture cellulaire de plus grande taille. La dépendance à la glutamine pour la bioénergétique mitochondriale est déterminée à l’aide du sulfure d’éthyle bis-2-(5-phénylacétamido-1,3,4-thiadiazol-2-yl) (BPTES, inhibiteur de la glutaminase 1) pour inhiber sélectivement la conversion enzymatique de la glutamine en glutamate. Les données présentées dans cette étude sont des réplicats biologiques supplémentaires pour les groupes expérimentaux traités par des témoins et des BPTES dans des milieux de lignée cellulaire de souris non traitées et exposées à l’EtOH, les cellules MH-S, qui sont publiées dans Crotty et al.11.

Protocole

1. Exposition chronique à l’EtOH in vitro

  1. Cultiver des cellules MH-S, une lignée cellulaire de macrophage alvéolaire de souris, dans un milieu complet contenant du RPMI-1640 avec 10 % de sérum de veau fœtal, 1 % de pénicilline/streptomycine, 11,9 mM de bicarbonate de sodium, 40 mg/mL de gentamicine et 50 μM de 2-mercaptoéthanol à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
  2. Traiter les cellules MH-S en culture avec ou sans EtOH (0,8 mg/mL ou 0,08 %) pendant 72 h, où l’EtOH doit être changé toutes les 24 h. Incuber les cellules MH-S traitées à l’EtOH à 37 °C avec 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié séparé contenant 0,08 % d’EtOH dans l’eau de l’incubateur.

2. Placage de cellules MH-S pour évaluer la glutamine comme source de carburant à l’aide d’un bioanalyseur de flux extracellulaire

  1. S’assurer que les cellules MH-S témoins non traitées (Con) et chroniques traitées à l’EtOH sont cultivées jusqu’à une confluence d’au moins 50 % (une confluence de 70 % à 90 % est idéale) dans des flacons T-75 pour passer dans une plaque de microculture de flux extracellulaire à 96 puits. Préparez une carte de plaque pour 5 à 6 répétitions techniques par répétitions biologiques des conditions expérimentales de Con et d’EtOH et des témoins de milieux pour chacune d’entre elles afin de les comparer aux injections de BPTES (quatre groupes au total pour le biologique n = 1).
  2. Rincez les cellules avec un média ou une solution saline tamponnée au phosphate.
  3. Ajouter 6 ml de milieu contenant du sérum dans la fiole.
  4. Grattez les cellules jusqu’à ce qu’elles se détachent et que le bas de la plaque soit dégagé. La trypsine n’est pas nécessaire pour le détachement des cellules MH-S, mais peut être utile dans d’autres types de cellules.
  5. Séparez les cellules à l’aide d’une pipette sérologique ou d’une pipette de 1 ml.
  6. Transférez les cellules suspendues dans un tube conique de 15 mL et centrifugez-les à 200 x g pendant 6 min.
  7. Aspirez le surnageant.
  8. Ajouter 1 mL de milieu et remettre les cellules en suspension à fond.
  9. Transférez 10 μL dans un tube de microcentrifugation et ajoutez 10 μL de bleu de trypan. Bien mélanger.
  10. Transférez 10 μL du mélange cellule/bleu trypan d’un côté d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules.
  11. Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un microscope optique ou d’un compteur de cellules.
  12. Calculez la densité cellulaire en nombre moyen de cellules vivantes par millilitre.
  13. Faites des calculs pour les dilutions nécessaires :
    Nombre de puits nécessaires x 10000-15000 cellules = nombre total de cellules nécessaires.
    Nombre de puits nécessaires x 80 μL = volume total de cellules remises en suspension nécessaires.
  14. Appliquez 80 μL de cellules dans les puits nécessaires de la plaque de microculture de flux extracellulaire à 96 puits.
  15. Laissez les puits d’angle complètement dépourvus de cellules ou de supports. Ces puits seront utilisés pour les mesures de fond.
  16. Incuber les cellules dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant la nuit pour permettre aux cellules d’adhérer et de s’équilibrer dans la plaque de microculture à flux extracellulaire.
  17. Traitez les cellules MH-S dans la plaque de microculture à flux extracellulaire à 96 puits pendant 72 h à l’aide de l’étape 1.
  18. Au moins 4 h et jusqu’à 24 h avant d’exécuter l’expérience du bioanalyseur de flux extracellulaire, hydratez une cartouche de flux extracellulaire à 96 puits.
    1. Retirez la partie supérieure du flux pak extracellulaire et placez la partie sondée du flux pak face vers le haut sur le banc. Appliquez 200 μL de solution d’étalonnage de flux extracellulaire dans chaque puits de la partie inférieure de la cartouche de flux extracellulaire.
    2. Assemblez les sections et enveloppez la cartouche de flux extracellulaire dans du parafilm. Placez-le dans un incubateur humidifié à 37 °C sans CO2 ou un bain de billes à 37 °C.
  19. Allumez l’ordinateur contenant le modèle de test et ouvrez le logiciel de fonctionnement/d’analyse attaché à l’instrument de bioanalyseur de flux extracellulaire pour lui permettre de se réchauffer au moins 4 h avant d’effectuer l’expérience.

3. Utilisation d’un bioanalyseur de flux extracellulaire pour évaluer la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale dans les cellules MH-S

REMARQUE : La figure 1 donne un aperçu général de cette procédure.

  1. Vérifiez les cellules MH-S cultivées traitées au Con- et EtOH au microscope optique et assurez-vous que les cellules sont saines et adhèrent aux puits en monocouche. Assurez-vous que les cellules sont confluentes à au moins 70 % (90 % de confluence est idéal) pour effectuer le test de manière fiable.
  2. Préparez le milieu de base de flux extracellulaire avec les suppléments suivants :
    1. Aliquote 35 mL de milieu de base de flux extracellulaire dans un tube de 50 mL.
    2. Ajoutez 350 μL de 100 mM de pyruvate de sodium (concentration finale de 1 mM), 350 μL de D-glucose (concentration finale de 10 mM) et 350 μL de GlutaMAX, qui est plus stable à la conservation que la L-glutamine (concentration finale de 2 mM).
      REMARQUE : La L-glutamine fraîche peut également être utilisée à la même concentration.
    3. Réchauffez la solution à 37 °C et assurez-vous que le pH est de 7,4 ± 0,05 à 37 °C.
  3. Aspirez doucement le milieu de croissance de la plaque de microculture extracellulaire. Laissez le moins de fluide possible sans aspirer les cellules par le bas. Laver une fois avec un maximum de 50 μL de milieu de base complété par le flux extracellulaire.
  4. Ajouter 180 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire dans chaque puits et incuber la plaque de microculture extracellulaire dans un incubateur humidifié à 37 °C sans CO2 pendant 30 min à 1 h pour permettre l’équilibre.
  5. Dissoudre les réactifs d’oxydation de la glutamine :
    1. Dans le tube BPTES, ajoutez 700 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire pour obtenir une solution mère de 120 mM. Pipetez de haut en bas 10 fois pour bien solubiliser le composé.
      ATTENTION : Le BPTES provoque une irritation de la peau et des yeux et peut provoquer une irritation respiratoire. Portez des gants de protection, des lunettes de protection et une protection faciale lors de la manipulation. Jetez le contenu et les contenants dans une installation d’élimination des déchets approuvée.
    2. Dans le tube d’oligomycine, ajouter 630 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire pour obtenir une solution mère de 100 mM. Pipetez de haut en bas 10 fois pour bien solubiliser le composé.
    3. Dans le tube FCCP, ajoutez 720 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire pour obtenir une solution mère de 100 mM. Pipetez de haut en bas 10 fois pour bien solubiliser le composé.
      ATTENTION : Le FCCP est nocif en cas d’ingestion, provoque de graves brûlures cutanées et des lésions oculaires, peut provoquer une réaction allergique cutanée et peut avoir des effets nocifs à long terme sur la vie aquatique. Portez des gants de protection, des vêtements de protection, des lunettes de protection et une protection faciale lors de la manipulation. Jetez le contenu et les contenants dans une installation d’élimination des déchets approuvée.
    4. Dans le tube R/A, ajoutez 540 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire pour obtenir une solution mère de 50 mM. Pipetez de haut en bas 10 fois pour bien solubiliser le composé.
      ATTENTION : La roténone est mortelle en cas d’ingestion ou d’inhalation, provoque une irritation cutanée, une irritation oculaire grave, une irritation respiratoire et est très toxique pour la vie aquatique avec des effets à long terme. Portez des gants de protection, des lunettes de protection, une protection faciale et une protection respiratoire. Jetez le contenu et les contenants dans une installation d’élimination des déchets approuvée. L’antimycine A est mortelle en cas d’ingestion et est très toxique pour la vie aquatique, avec des effets à long terme. Jetez le contenu et les contenants dans une installation d’élimination des déchets approuvée.
  6. Préparer les concentrations de travail des réactifs d’oxydation du substrat et d’essai de stress mitochondrial :
    1. Pour le BPTES, mélanger 1 500 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire avec 500 μL de solution mère de 120 mM de BPTES pour obtenir une solution de travail de 30 μM de BPTES.
    2. Pour l’oligomycine, mélangez 2 520 μL de milieu de base supplémenté en flux extracellulaire avec 480 μL d’oligomycine 100 mM pour obtenir une solution de travail d’oligomycine de 16 mM.
    3. Pour le FCCP, mélanger 2 865 μL de milieu de base complété par flux extracellulaire avec 135 μL de FCCP 100 mM pour obtenir une solution de travail FCCP de 4,5 mM.
    4. Pour la R/A, mélanger 2 700 μL de milieu de base complété par un flux extracellulaire avec 300 μL de 50 mM R/A pour obtenir une solution de travail de 5 mM R/A.
  7. Chargez les ports de la partie supérieure de la cartouche de flux pak extracellulaire avec les éléments suivants :
    1. Chargez les puits de contrôle de l’arrière-plan et du milieu avec 20 μL de milieu de base complété par le flux extracellulaire dans le port A, 22 μL d’oligomycine dans le port B, 25 μL de FCCP dans le port C et 27 μL de R/A dans le port D.
    2. Chargez les puits contenant des cellules avec 20 μL de contrôle de milieu ou BPTES dans l’orifice A (concentration finale de 3 μM pour le BPTES), 22 μL d’oligomycine dans l’orifice B (concentration finale de 2 μM pour l’oligomycine), 25 μL de FCCP dans l’orifice C (concentration finale de 0,5 μM pour le FCCP) et 27 μL de R/A (concentration finale de 0,5 μM pour R/A) dans l’orifice D.
  8. Réaliser l’expérience du bioanalyseur de flux extracellulaire à l’aide du logiciel informatique de conception et d’analyse du dosage qui est attaché à l’instrument en utilisant la stratégie de synchronisation et d’injection suivante :
    1. Pour l’injection avec l’orifice A pour BPTES, réglez le nombre de mesures à 6. Réglez le temps de mixage sur 3 min, avec un temps d’attente de 0 min et un temps de mesure de 3 min.
    2. Pour l’injection avec l’orifice B pour l’oligomycine, réglez le nombre de mesures sur 3. Réglez le temps de mixage sur 3 min, avec un temps d’attente de 0 min et un temps de mesure de 3 min.
    3. Pour l’injection avec l’orifice C pour FCCP, réglez le nombre de mesures sur 3. Réglez le temps de mélange sur 3 min, avec un temps d’attente de 6 min et un temps de mesure de 3 min.
    4. Pour l’injection avec l’orifice D pour R/A, réglez le nombre de mesures sur 3. Réglez le temps de mixage sur 3 min, avec un temps d’attente de 0 min et un temps de mesure de 3 min.
    5. Examinez tous les décors d’arrière-plan, de contrôle des médias et de puits de groupe expérimentaux. Enregistrez et exécutez le test. Tout d’abord, chargez le flux extracellulaire avec des injections A-D. L’étalonnage aura lieu jusqu’à ce que la plaque de cellule soit prête à être chargée.
    6. Retirez la plaque cellulaire immédiatement à la fin du test. Enregistrez les résultats pour les analyser ultérieurement sur un autre appareil.
    7. Vérifiez si les cellules sont toujours respectées à l’aide d’un microscope optique. Laver 1x avec une solution saline tamponnée au phosphate et lyser les cellules avec un tampon de lyse cellulaire préféré. Conserver à -80 °C ou doser immédiatement la concentration en protéines.

4. Analyse des résultats pour évaluer la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale dans les cellules MH-S

  1. Extraire les protéines des cellules de chaque puits pour normaliser les données de taux de consommation d’oxygène (OCR) en protéines :
    1. Calculer la concentration (nanogrammes/microlitre [ng/μL]) de protéines par puits.
    2. Calculer la concentration moyenne en protéines (ng/μL) pour l’ensemble de la plaque de microculture de flux extracellulaire.
    3. Divisez la concentration en protéines de chaque puits par la concentration moyenne en protéines de la plaque pour obtenir un facteur de normalisation.
    4. Appliquer le facteur de normalisation au fichier de données d’intérêt à l’aide du logiciel de conception et d’analyse des essais.
  2. Assurez-vous que les valeurs OCR de tous les puits d’arrière-plan sont proches de 0.
  3. Désélectionnez tous les puits de cellule où l’OCR est < 10 au départ. Les données ne seront pas supprimées, mais les puits en surbrillance apparaîtront dans le fichier de données exporté.
  4. Exporter les données du logiciel pour la conception et l’analyse des tests dans un tableur informatique.
  5. Ouvrez le fichier dans le tableur de l’ordinateur et triez toutes les données en diminuant les valeurs de l’OCR. Supprimez les puits d’arrière-plan, les puits qui ont déjà été désélectionnés (et qui n’ont pas été supprimés), les puits dont la viabilité cellulaire est faible, les puits dont la confluence cellulaire est faible, les puits dont la stratégie d’injection n’est pas complète, les puits dont la concentration en protéines est inexacte, les puits dont la RCO de base est < 10 et tout autre critère prédéterminé.
  6. Triez toutes les données restantes par mesure, puis par groupe, puis par OCR.
  7. Faites la moyenne des réplications techniques de chaque azote biologique indépendamment par mesure. S’assurer qu’il y a un minimum de 18 valeurs différentes (3 valeurs initiales, 3 après milieu/BPTES, 3 après oligomycine, 3 après FCCP et 6 après roténone/antimycine A) par groupe expérimental par N biologique après avoir fait la moyenne des répétitions techniques. Faites-le pour chaque azote biologique séparément afin que l’écart-type ou l’erreur-type de la moyenne puisse être calculé ultérieurement pour les données analysées.
  8. Copiez toutes les valeurs moyennes dans une nouvelle feuille de calcul, séparées par groupe expérimental.
  9. Faites la moyenne des valeurs OCR par stratégie d’injection dans chaque groupe expérimental.
  10. Calculer les paramètres de la bioénergétique mitochondriale en fonction de la consommation d’oxygène :
    1. Calculer Respiration basale :
      1. Calculez la respiration mitochondriale basale comme suit :
        Respiration mitochondriale basale (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #1, 2, 3 - Mesures OCR AVG #16, 17, 18] x [Temps #3 - Temps #1])
        REMARQUE : La respiration basale doit être similaire entre les groupes de contrôle des milieux et de BPTES, car c’est avant l’injection de l’inhibiteur.
      2. Calculez la respiration mitochondriale basale non dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale basale non dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #4, 5, 6, 7, 8, 9 - Mesures OCR AVG #16, 17, 18] x [Temps #9 - Temps #4])
        REMARQUE : La respiration mitochondriale basale non dépendante de la glutamine doit être inférieure à la respiration mitochondriale basale à moins que les cellules ne soient pas fortement dépendantes de la glutamine.
      3. Calculez la respiration mitochondriale basale dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale basale dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #1, 2, 3 - Mesures OCR AVG #4, 5, 6, 7, 8, 9] x [Temps #9 - Temps #4])
        REMARQUE : La respiration mitochondriale basale totale ne doit pas être soustraite de la respiration mitochondriale basale, et elle ne doit pas dépendre de la glutamine puisque celles-ci sont calculées à des points temporels différents.
    2. Calculez la respiration liée à l’ATP comme suit :
      1. Calculez la respiration mitochondriale totale liée à l’ATP de tous les combustibles comme suit :
        Respiration mitochondriale totale liée à l’ATP de tous les carburants (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #1, 2, 3 - Mesures OCR AVG #10, 11, 12] x [Temps #12 - Temps #10])
        REMARQUE : L’OCR moyen pour les mesures #10, 11 et 12 devrait être similaire entre le groupe témoin du milieu et le groupe BPTES, car l’oligomycine devrait inhiber fortement l’ATP synthase, et l’inhibition d’une voie de carburant ne devrait pas modifier la respiration totale liée à l’ATP.
      2. Calculez la respiration mitochondriale liée à l’ATP non dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale liée à l’ATP non dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #4, 5, 6, 7, 8, 9 - Mesures OCR AVG #10, 11, 12] x [Temps #12 - Temps #10])
        REMARQUE : La respiration mitochondriale liée à l’ATP qui ne dépend pas de la glutamine doit être inférieure à la respiration mitochondriale liée à l’ATP, à moins que les cellules ne soient pas fortement dépendantes de la glutamine.
      3. Calculez la respiration mitochondriale liée à l’ATP dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale liée à l’ATP dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = Respiration mitochondriale totale liée à l’ATP de tous les combustibles - Respiration mitochondriale liée à l’ATP non dépendante de la glutamine
    3. Calculez la respiration maximale comme suit :
      1. Calculez la respiration mitochondriale maximale totale comme suit :
        Respiration mitochondriale maximale totale (pmol O2 consommée) = ([Mesures OCR AVG #13, 14, 15 - Mesures OCR AVG #16, 17, 18] x [Temps #15 - Temps #13])
      2. Calculez la respiration mitochondriale maximale non dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale maximale non dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #13, 14, 15 des groupes BPTES - Mesures OCR AVG #16, 17, 18 des groupes BPTES] x [Temps #15 - #Time 13])
      3. Calculez la respiration mitochondriale maximale dépendante de la glutamine comme suit :
        Respiration mitochondriale maximale dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = Respiration mitochondriale maximale totale de tous les combustibles - Respiration mitochondriale maximale non dépendante de la glutamine
        REMARQUE : Ce calcul peut être utilisé pour déterminer la dépendance cellulaire de la capacité de réserve de glutamine par rapport à d’autres combustibles. Plus la respiration mitochondriale maximale est grande, plus la dépendance à la glutamine est grande, ce qui peut être exprimé en groupes BPTES - groupes témoins pour montrer une perte de la respiration mitochondriale maximale ou en pourcentage de la respiration totale.
    4. Calculez la capacité respiratoire de réserve comme suit :
      1. Calculez la capacité respiratoire totale de réserve comme suit :
        Capacité respiratoire de réserve totale (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #13, 14, 15 - Mesures OCR AVG #1, 2, 3] x [Temps #15 - Temps #13])
      2. Calculez la capacité respiratoire de réserve non dépendante de la glutamine comme suit :
        Capacité respiratoire de réserve non dépendante de la glutamine (pmol O2 consommé) = ([Mesures OCR AVG #13, 14, 15 des groupes BPTES - Mesures OCR AVG #1, 2, 3 des groupes BPTES] x [Temps #15 - Temps #13])
      3. Calculez la capacité respiratoire de réserve dépendante de la glutamine comme suit :
        Capacité respiratoire de réserve dépendante de la glutamine (pmol O2 consommée) = Capacité respiratoire de réserve totale de tous les combustibles - Capacité respiratoire de réserve non dépendante de la glutamine
        REMARQUE : Ce calcul représente la flexibilité des cellules dépendantes de la glutamine et si elles peuvent obtenir une plus grande respiration sans glutamine en cas de besoin.
  11. Soustraire les témoins de milieux par groupes d’inhibiteurs et normaliser la consommation de pmol O2 par rapport au groupe témoin si vous le souhaitez.
  12. Créez des graphiques des profils bioénergétiques OCR (pmol O2/min), de la respiration basale (pmol O2), de la respiration liée à l’ATP (pmol O2), de la respiration maximale (pmol O2) et de la capacité respiratoire de réserve (pmol O2) dépendante de la glutamine.
  13. Représenter les valeurs des paramètres bioénergétiques mitochondriaux dans des graphiques à barres ou les exprimer comme moyennes des groupes inhibiteurs par rapport aux groupes témoins dans les milieux. Si chaque N biologique est calculé séparément, calculez l’écart-type ou l’erreur-type de la moyenne des données analysées pour tous les N biologiques.

5. Analyse statistique

  1. Effectuer toutes les analyses statistiques à l’aide d’un logiciel d’analyse de données approprié.
  2. Pour les points linéaires des profils bioénergétiques OCR, effectuez une ANOVA à deux facteurs suivie des analyses post hoc de Tukey pour comparer les données de ces quatre groupes expérimentaux avec deux facteurs (stratégie de traitement et d’injection) : Con + milieux, Con + BPTES, EtOH + milieu et EtOH + BPTES.
  3. Pour les graphiques à barres de la respiration basale, de la respiration liée à l’ATP, de la respiration maximale et de la capacité respiratoire de réserve dépendante de la glutamine, effectuez des analyses du test t de Student pour comparer les données de deux groupes expérimentaux, Con + BPTES et EtOH + BPTES.
  4. Présentez les données sous forme de moyennes ±erreur type de la moyenne (MEB). Considérons p < 0,05 comme statistiquement significatif.

Résultats

L’exposition chronique à l’EtOH diminue la dépendance à la glutamine dans les cellules MH-S.
La glutaminolyse est une voie critique pour la respiration mitochondriale, soutenant la glutamine en tant que source de carburant importante pour la bioénergétique cellulaire. Pour déterminer si l’exposition chronique à l’EtOH modifie la dépendance des cellules MH-S à la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale, les cellules MH-S ...

Discussion

Les données présentées dans le présent document sont des réplicats biologiques supplémentaires pour les cellules MH-S exposées à l’EtOH non traitées et chroniques traitées avec un contrôle en milieu ou BPTES, qui sont publiées dans Crotty et al.11. Le protocole décrit est utilisé pour évaluer la dépendance des cellules MH-S exposées à l’EtOH à la glutamine comme source de carburant pour la respiration mitochondriale et la bioénergétique à...

Déclarations de divulgation

Tous les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts financier pertinent à signaler.

Remerciements

Nous reconnaissons les contributions de Sarah S. Chang, BS, pour la culture cellulaire initiale et la préparation des cellules MH-S pour l’expérimentation. Ce travail a été soutenu par NIAAA R01-AA026086 à SMY (ORCID : 0000-0001-9309-0233), NIAAA F31-F31AA029938 à KMC et NIGMS T32-GM008602 à Randy Hall, Département de pharmacologie et de biologie chimique, Université Emory. Le contenu de ce rapport ne représente pas les opinions du ministère des Anciens combattants ou du gouvernement américain.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
15 mL conical tube VWR International, Inc.21008-670Used for preparing stock concentrations of mitochondria-related reagents.
2-mercaptoethanol Sigma Aldrich Co.M6250Used for culturing MH-S cells.
Cell scraperDot Scientific, Inc.70-1180Used for scraping MH-S cells from T-75 flasks.
Countess 3 FL Instrument: cell counterFisher Scientific CompanyAMQAF2000Used for counting the number of MH-S cells to plate for experiments.
D-glucose Sigma Aldrich Co.G8270Used for the extracellular flux base medium.
EthanolFisher Scientific Company4355720Experimental treatment for MH-S cells.
Fetal bovine serumSciencell Research Laboratories500Used for culturing MH-S cells.
GentamicinSigma Aldrich Co.G1397Used for culturing MH-S cells.
GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061Used for the extracellular flux base medium.
GraphPad Prism 10.2.3GraphPad SoftwareN/ASoftware for statistical analysis. Downloadable after purchase at https://www.graphpad.com/features.
MH-S cellsAmerican Type Culture CollectionCRL-2019Mouse alveolar macrophage cell line.
Microcentrifuge tube USA Scientific, Inc.4036-3212Used for preparing working concentrations of mitochondria-related reagents.
Microsoft 365 Excel: computer spreadsheet programMicrosoftN/ASoftware for data organization and mitochondrial bioenergetics calculations. Downloadable after purchase at https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel.
Penicillin/streptomycinFisher Scientific Company15140122Used for culturing MH-S cells.
Phosphate buffered salineVWR International, Inc.45000-446Used for washing MH-S cells.
RPMI-1640VWR International, Inc.45000-396Used for culturing MH-S cells.
Seahorse Wave Pro Software: computer software program for assay design and analysisAgilent Technologies, Inc.N/AThe computer is attached to the Seahorse XF Pro Analyzer instrument. Downloadable from  https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523.
Seahorse XF Base Medium: extracellular flux base medium, pH 7.4Agilent Technologies, Inc.103334-100Used for preparing stock and working concentrations of mitochondria-related reagents and culturing MH-S cells prior to experimental runs.
Seahorse XF Glutamine Oxidation Stress Test KitAgilent Technologies, Inc.103674-100Contains stock BPTES, oligomycin, FCCP, and rotenone/antimycin A.
Seahorse XF Pro Analyzer: extracellular flux bioanalyzerAgilent Technologies, Inc.N/AExtracellular flux bioanalyzer.
Seahorse XFe96 FluxPak: 96-well extracellular flux pak cartridges, 96-well extracellular flux microculture plates, and calibrant solutionAgilent Technologies, Inc.102416-100Used to prepare MH-S cells for assays using an extracellular flux bioanalyzer.
Serological pipet Santa Cruz Biotechnology, Inc.sc-550678Used for removing media from MH-S cells.
Sodium bicarbonateSigma Aldrich Co.S6014Used for culturing MH-S cells.
Sodium pyruvate Sigma Aldrich Co.P4562Used for the extracellular flux base medium.
T-75 flasksSanta Cruz Biotechnology, Inc.sc-200263Used for culturing MH-S cells.

Références

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