تحسين توصيل الحويصلة خارج الخلية باستخدام سقالة مطبوعة حيوية ثلاثية الأبعاد بغمد أساسي لإدارة الجروح المزمنة

Summary

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا لتصنيع سقالات مطبوعة حيوية ثلاثية الأبعاد ذات غمد أساسي لالتئام الجروح المزمنة. يتم عزل الحويصلات خارج الخلية من الخلايا الجذعية الوسيطة ، ويتم تحميلها في القلب (الجينات) مع الغمد المصنوع من كربوكسي ميثيل السليلوز والألجينات لياز. يسمح هذا التصميم بتدهور السقالة المتحكم فيه وإطلاق المركبات الكهربائية بكفاءة.

Abstract

تحدد هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتصنيع السقالات المطبوعة حيويا ثلاثية الأبعاد ذات الغمد الأساسي والمصممة لتعزيز التئام الجروح المزمنة. يتضمن البروتوكول عزل الحويصلات خارج الخلية (EVs) عن الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، والمعروفة بخصائصها التجديدية والمناعية. ثم يتم دمج هذه المركبات الكهربائية في هيكل سقالة فريد. تتميز السقالة بنواة مكونة من الجينات المحملة بالمركبات الكهربائية ، وتحيط بها غمد مصنوع من كربوكسي ميثيل السليلوز والألجينات ليز. يضمن هذا التصميم المبتكر تدهورا خاضعا للسقالة مع تعزيز الإطلاق الفعال والخاضع للرقابة للمركبات الكهربائية في موقع الجرح. يغطي البروتوكول الخطوات الرئيسية ، بما في ذلك إعداد وتوصيف المركبات الكهربائية ، وصياغة الأحبار الحيوية للطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ، وتحسين معلمات الطباعة لتحقيق بنية الغلاف الأساسية المطلوبة. من خلال الجمع بين السلامة الهيكلية والنشاط الحيوي ، تهدف السقالة إلى معالجة قيود ضمادات الجروح التقليدية ، وتقديم نهج مستهدف لتسريع تجديد الأنسجة وتقليل الالتهاب في الجروح المزمنة. توفر هذه الطريقة استراتيجية قابلة للتكرار وقابلة للتطوير لتطوير مواد حيوية متقدمة مع تطبيقات سريرية محتملة في إدارة الجروح المزمنة. يسلط البروتوكول الضوء أيضا على الاعتبارات الحاسمة لتحقيق نتائج متسقة ، مما يضمن القدرة على التكيف مع التطبيقات العلاجية المستقبلية.

Introduction

تتطلب الجروح المزمنة ، التي غالبا ما ترتبط بالالتهاب المفرط ، إدارة في الوقت المناسب لمنع المضاعفات الخطيرة مثل الالتهابات ونخر الأنسجة ، والتي يمكن أن تؤدي إلى بتر الأطراف. على الرغم من التقدم ، لا تزال العلاجات الحالية مكلفة وغير مريحة ولها آثار جانبية ولها فعالية محدودة ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى ضمادات أكثر علاجا^1،2،3. يعد تطوير جيل جديد من ضمادات الجروح المصممة خصيصا للجروح المزمنة أمرا ضروريا لمواجهة هذه التحديات. علاوة على ذلك ، تتطلب الطبيعة المعقدة لالتئام الجروح مواد تضميد مع مجموعة من الخصائص ، بما في ذلك الترطيب والمرونة والالتصاق والنشاط الحيوي والتحلل^{البيولوجي 4}. تهدف هذه الدراسة إلى تطوير ضمادة جروح معدلة بيولوجيا تدمج الحويصلات خارج الخلية (EVs) مع سقالة مطبوعة حيوية ثلاثية الأبعاد ذات غمد أساسي لتوفير بيئة علاجية خاضعة للرقابة وتسريع التئام الجروح المزمنة.

تساعد المركبات الكهربائية المشتقة من الخلايا الجذعية في التئام الجروح المزمنة من خلال تعزيز الاستجابات المضادة للالتهابات ونمو الخلايا والهجرة وتكوين الأوعية^{الدموية 5}. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للمركبات الكهربائية توفير جزيئات نشطة بيولوجيا ، بما في ذلك أدوية الجزيئات الصغيرة ، وتركيبات الجينات والبروتينات لإدارة الجروح المزمنة⁶. علاوة على ذلك ، فإن قدرتها على حماية البضائع من التدهور الأنزيمي تحسن الاستقرار والتوافر البيولوجي للعوامل العلاجية ، مما يوفر مزايا مميزة على عوامل النمو التقليدية والأدوية الجزيئية الصغيرة ، والتي غالبا ما تتحلل بسرعة في الجسم الحي⁷. على الرغم من هذه المزايا ، لا يزال التسليم الفعال والمستدام للمركبات الكهربائية للأنسجة المستهدفة يمثل تحديا كبيرا.

يمكن أن تكون سقالات الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد بمثابة منصة توصيل للمركبات الكهربائية لتعزيز آثارها العلاجية⁸. تحاكي هذه السقالات البيئات الخلوية الطبيعية وتسمح بالتحكم في إطلاق المركبات الكهربائية ^9,10. كما أنها تحمي المركبات الكهربائية من التدهور ، مما يعزز استقرار الحمض النووي الريبي الصغير^{والبروتينات 11}. أظهر Han et al. أنه يمكن إطلاق المركبات الكهربائية بشكل فعال من سقالات GelMA المطبوعة حيويا ثلاثية الأبعاد. أدى هذا الإصدار إلى تحسين ارتباط الخلايا وتعزيز التعبير الجيني المتعلق بمسارات النقل الميكانيكي في الخلايا الجذعية الوسيطة للوسادة الشدقية البشرية (hBFP-MSCs) المزروعة على السقالات¹². Born et al. ، من خلال تحسين تركيز الرابط المتقاطع ، حقق إطلاقا محكما للمركبات الكهربائية. أظهر هذا النهج فعاليته في تعزيز تكوين الأوعية ويقدم طريقة واعدة للتسليم المنظم للمركبات^{الكهربائية 13}.

تتيح الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ذات الغمد الأساسي إنشاء هياكل معقدة ومتعددة المواد عن طريق طباعة مادة أساسية مغلفة بغمد. يمكن أن يشمل اللب الخلايا أو عوامل النمو أو الأدوية ، بينما يوفر الغمد الدعم الميكانيكي والحماية أو يعمل كحاجز. هذه الطريقة لها تطبيقات في هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، مثل تطوير شبكات الأوعية الدموية ، ومحاكاة هياكل الأنسجة الطبيعية ، وإنشاء أنظمة توصيل الأدوية. يسمح بالتحكم الدقيق في توزيع المواد وتكوينها ، مما يعزز الوظائف والأهمية البيولوجية للتركيبات. بالمقارنة مع التقنيات البديلة ، توفر الطباعة الحيوية ثلاثية الأبعاد ذات الغلاف الأساسي تحكما دقيقا في توزيع المواد وتكوينها ، مما يحسن الوظائف والأهمية البيولوجية للتركيبات^14،15.

يوفر التدهور المصمم هندسيا في ضمادات الجروح فوائد مثل تقليل الانزعاج أثناء التغييرات ، وبيئة رطبة للشفاء والسيطرة على العدوى ، والتسليم العلاجي في الوقت المناسب ، والتجديد الأمثل للأنسجة^16،17،18. الهلاميات المائية Alginate (Alg) وكربوكسي ميثيل السليلوز (CMCh) متوافقة حيويا وفعالة لتوصيل الحويصلات خارج الخلية (EVs) إلى الجروح ، وتعزيز الشفاء من خلال الاتصال الخلوي وتقليل الالتهاب¹⁸. في هذه الدراسة ، تم دمج المركبات الكهربائية في قلب Alg ، بينما تم استخدام غمد CMCh و AlgLyase (AlgLyase) لتمكين تدهور الضمادات السريع وتسليم المركبات الكهربائية. يسهل تصميم الغلاف الأساسي هذا الإطلاق السريع للمركبات الكهربائية استجابة لتدهور السقالات ، مما يعزز فعاليتها العلاجية ويعالج قيود علاجات الجروح المزمنة الحالية. الهدف الأساسي من هذه الدراسة هو تطوير ضمادة معدلة بيولوجيا تعزز التئام الجروح من خلال دمج إطلاق المركبات الكهربائية الخاضعة للرقابة مع سقالة قابلة للتحلل بشكل سريع الاستجابة ، مما يؤدي في النهاية إلى تحسين نتائج علاج الجروح المزمنة.

Protocol

أجريت الأبحاث على بما يتفق تماما مع المعايير الأخلاقية التي وضعتها اللجنة الوطنية لأخلاقيات علم الأحياء ولجنة أخلاقيات بجامعة نزوى. تم منح الموافقة الأخلاقية لهذه الدراسة بموجب معرف التخليص: VCGSR ، AREC / 01/2023. تم إيواء جميع في ظروف معملية قياسية ، مما يضمن الضوابط البيئية المثلى والتغذية السليمة والرعاية الشاملة لحماية رفاهيتها طوال فترة الدراسة. تلتزم جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات بشكل صارم بالسياسات المؤسسية والمعايير الدولية لرعاية وإرشادات ARRIVE.

1. زراعة الخلايا

1. استرجع قارورة من الخلايا الجذعية الجذعية (الممر # 2) من تخزين النيتروجين السائل وتعامل معها بتقنيات معقمة لمنع التلوث. قم بإذابة الخلايا بسرعة في حمام مائي 37 درجة مئوية ، مع التأكد من إزالتها بمجرد بقاء جزء جليدي صغير.
2. قم بإعداد وسيط كامل بما في ذلك MSC SFM Basal Medium ، مكملا ب 1٪ (حجم / حجم) MSC SFM XenoFree ، و 1٪ (حجم / حجم) GlutaMAX ، و 0.01٪ (حجم / حجم) جنتاميسين. أضف 1 مل من الوسط الكامل المسخن مسبقا (37 درجة مئوية) بمعدل 3 إلى 5 قطرات كل 5 ثوان إلى القارورة ثم اخلطها برفق. انقل محتويات قارورة الخلايا الجذعية الجذعية بالكامل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 4 مل وسط كامل مسخن مسبقا ، في ظل ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية من الفئة الثانية.
3. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تأكد من توازن جهاز الطرد المركزي بشكل صحيح.
4. شفط المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من الوسائط الكاملة الدافئة مسبقا. ثم انقل الخلايا إلى قارورة T25 تحتوي على 4 مل من الوسط الكامل.
5. قم بإمالة القارورة برفق لضمان توزيع الخلايا بالتساوي. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
6. قم بتغيير الوسط كل يومين ، واستبدله بوسط طازج ، دافئ مسبقا ، كامل. استخدم ماصة لطيفة لتجنب اضطراب الخلايا. عند الوصول إلى التقاء 70٪ -80٪ ، قم بسحب الوسط المستهلك من قارورة T25.
7. اغسل الخلايا ب 3 مل من PBS الطازج لإزالة البقايا. تأكد من التغطية الكاملة للقارورة أثناء الغسيل.
8. أضف 1 مل من محلول التربسين 0.25٪ إلى قارورة T25 ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 3-7 دقائق ، وراقب بعناية الانفصال تحت المجهر بتكبير 4x.
9. اضغط على القارورة برفق إذا لزم الأمر لضمان انفصال الخلية بالكامل. أضف وسطا كاملا مدفأة مسبقا إلى القارورة والماصة لأعلى ولأسفل فوق السطح للمساعدة في فصل الخلايا. ثم انقل معلق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
10. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتعليق حبيبات الخلية في وسط جديد كامل وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم Neubauer. انقل الخلايا إلى قارورة T75. تأكد من كثافة بذر تبلغ 5,000 خلية / سم² لتحقيق النمو الأمثل.
11. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. بعد 72 ساعة من حضانة الخلية ، اجمع الوسائط المكيفة من الخلايا لعزل المركبات الكهربائية. استخدميه مباشرة بعد الاستلام.

2. عزل المركبات الكهربائية

1. جهاز الطرد المركزي 13 مل من الوسائط المكيفة المجمعة عند 800 × جم لمدة 15 دقيقة لإزالة الحطام الخلوي. قم بتصفية المادة الطافية برفق باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر لإزالة الجسيمات الكبيرة.
2. أضف 5 مل من المخزن المؤقت لهطول الأمطار إلى الوسائط المكيفة المفلترة والدوامة جيدا للخلط. تأكد من أن المحلول متجانس.
3. احتضن الخليط طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح للمركبات الكهربائية بالترسيب. الطرد المركزي الخليط عند 3,220 × جم لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية. تحقق من توازن الأنابيب.
4. تخلص من المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات. الطرد المركزي الحبيبات مرة أخرى عند 3,220 × جم لمدة 5 ثوان لإزالة السائل المتبقي.
5. قم بسحب حبيبات EV برفق في 200 ميكرولتر من PBS لتجنب تلف المركبات الكهربائية. قم بقياس تركيز بروتين EVs باتباع تعليمات الشركة المصنعة (مجموعة فحص البروتين BCA).
6. قم بإجراء النشاف الغربي للكشف عن العلامات الخاصة بالمركبات الكهربائية (CD63 و CD81 و CD9) ، للتحقق من النمط الظاهري^{EV 18}. أكد التحليل وجود هذه العلامات ، مما يتحقق من صحة هوية المركبات^{الكهربائية 19}.
7. لتقليل مخاطر تلوث RNase ، يوصى باستخدامه مباشرة دون تخزين إضافي. في حالة الحاجة ، قم بتخزين المركبات الكهربائية عند -80 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام. قم بتقسيم تعليق المركبات الكهربائية إلى أحجام 40 ميكرولتر لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة.

3. وضع العلامات على المركبات الكهربائية مع PKH-26

1. تحضير العازلة
   1. قم بإذابة 0.238 جم من HEPES في حوالي 90 مل من الماء المعقم فائق النقاء في وعاء معقم. استخدم محلول HEPES المحضر حديثا. أضف 0.85 جم من كلوريد الصوديوم إلى محلول HEPES.
   2. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك ، كما هو مطلوب ، باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني المعاير. أضف الماء منزوع الأيونات ليصل الحجم الإجمالي إلى 100 مل. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر لتعقيمه.
2. تمييع 4 ميكرولتر من صبغة PKH-26 في 1 مل من المخزن المؤقت المحضر. تخلط جيدا بواسطة الماصة لضمان التجانس.
3. أعد تعليق المركبات الكهربائية المنقاة في 1 مل من PBS بتركيز 700 ميكروغرام / مل. أضف 1 مل من تعليق المركبات الكهربائية إلى 1 مل من محلول PKH-26 المحضر. بالنسبة لمجموعة التحكم في الصبغة فقط ، أضف 1 مل من الوسط الكامل بدون EVs إلى 1 مل من محلول PKH-26. يتم تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة للمجموعة الضابطة أيضا لحساب التراكم غير المحدد المحتمل أو تكوين المذيلة.
4. امزج المركبات الكهربائية جيدا عن طريق قلب الأنبوب برفق 10x-15x. احتضن الخليط لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، مما يضمن التعرض المتساوي للمركبات الكهربائية للصبغة.
5. قم بإعداد محلول BSA طازج بنسبة 2 مل بنسبة 1٪ باستخدام ماء معقم فائق النقاء وأضفه إلى 2 مل من الخليط الناتج لإخماد تفاعل وضع العلامات. تخلط بلطف لمنع التجميع.
6. قم بتركيز المركبات الكهربائية المسماة PKH-26 وفقا للبروتوكول المذكور أعلاه (الخطوات 2.2-2.7). أعد تعليق المركبات الكهربائية المصنفة في 300 ميكرولتر من PBS. ماصة عينة المركبات الكهربائية المسمى PKH-26 في أنبوب مرشح 30 كيلو دالتون.
7. جهاز الطرد المركزي العينة عند 3,220 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. خلال هذه الخطوة ، ستمر صبغة PKH-26 الحرة والجزيئات الصغيرة عبر الغشاء إلى المرشح ، بينما سيتم الاحتفاظ بالمركبات الكهربائية المسماة PKH-26 في المحتجز.
8. بعد الطرد المركزي الأولي ، تخلص من المرشح وأضف 300 ميكرولتر من PBS إلى الاحتفاظ. أعد تعليق المركبات الكهربائية برفق في PBS عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل.
9. قم بالطرد المركزي للعينة مرة أخرى عند 3,220 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لغسل أي صبغة حرة متبقية أو جزيئات صغيرة.
10. تأكد من عدم وجود PKH-26 في محلول الترشيح بواسطة المجهر الفلوري. إذا تم الكشف عن أي صبغة ، كرر خطوات الغسيل.
11. اجمع المحلول العلوي بواسطة ماصة دقيقة وقم بإزالة الفلتر من أنبوب التجميع. اقلب الفلتر بعناية (اقلبه رأسا على عقب).
12. جهاز الطرد المركزي للمرشح المقلوب عند 800 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. سيساعد ذلك في جمع PKH-26-EVs المحتجزة من غشاء المرشح إلى أنبوب التجميع الجديد. استخدم PKH-26-EVs مباشرة للخطوة التالية.

4. 3D الطباعة الحيوية

1. تحضير Bioinks
   1. قم بإعداد محلول ألجي الصوديوم الطازج بنسبة 4.5٪ (وزن / حجم) باستخدام ماء معقم فائق النقاء. يقلب طوال الليل عند 60 درجة مئوية للسماح للمحلول بالذوبان تماما.
   2. قم بإذابة CMCh في ماء معقم فائق النقاء لتحقيق محلول 3.8٪ (وزن / حجم). تحضير طازجة. يقلب طوال الليل عند 60 درجة مئوية حتى يذوب تماما.
   3. قم بالطرد المركزي للأحبار الحيوية المحضرة عند 3,220 × جم لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية لإزالة أي فقاعات قد تتداخل مع عملية الطباعة.
   4. امزج 3 مل من محلول Alg المحضر مع المركبات الكهربائية المصنفة أو التحكم في الصبغة فقط باستخدام خلاط الحقنة لتحقيق تركيز 0.01٪ (وزن / حجم) من المركبات الكهربائية. تأكد من التوزيع المتساوي عن طريق الخلط اللطيف.
   5. باستخدام خلاط الحقنة ، امزج 1 مل من CMCh مع محلول AlgLyase المحضر حديثا في ماء معقم فائق النقاء لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 0.5 mU / mL.
2. كما هو موضح في الشكل 1 أ ، قم بتحميل الحبر الحيوي Alg / Exo في نفس الوقت في الجزء الأساسي والحبر الحيوي CMCh / AlgLyase في الجزء الغمد من إعداد الحقنة الأساسية / الغمد.
3. اترك الأحبار الحيوية ترتاح لمدة 15 دقيقة قبل الطباعة.
4. إعداد طابعة ثلاثية الأبعاد حيوية
   1. باستخدام برنامج 3D-bioprinter ، قم بإنشاء هيكل السقالة عن طريق تحديد شكل أسطواني بنمط حشو قطري. لهذا الغرض ، اضبط قطر الأسطوانة وارتفاعها على 20 مم و 1.1 مم على التوالي. قم بتكوين حجم المسام إلى 1 مم.
   2. اضبط سرعات ضخ فوهة اللب والغمد على 1 مم / ثانية بسمك 0.25 مم لكل طبقة واضبط سرعة الحركة على 6 مم / ثانية. اطبع أربع طبقات بسمك 0.25 مم لكل طبقة في درجة حرارة الغرفة.
5. ابدأ في الطباعة على فيلم البوليستر.
6. استخدم المرطب مع كلوريد الكالسيوم الهباء الجوي (2.2٪) لربط السقالة أثناء عملية البثق. ضع فوهة جهاز الترطيب على بعد 20 سم تقريبا من رأس البثق لضمان الربط المتقاطع الفعال دون المساس بهيكل السقالة. لمزيد من التشابك ، اغمر السقالة في محلول كلوريد الكالسيوم (2.2٪) لمدة 10 دقائق.
7. اشطف السقالة 3x بماء معقم فائق النقاء لإزالة أي كلوريد كالسيوم زائد وحبر حيوي غير مرتبط.
8. تأكد من تخزين السقالة في بيئة معقمة عند 4 درجات مئوية للحفاظ على سلامة السقالة ووظائفها لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.

5. تتبع إطلاق المركبات الكهربائية

1. إنشاء نموذج الجرح الجلدي الدائري
   1. تخدير ذكور أكيتا المصابة بالسكري متغاير الزيجوت (8 أسابيع) عن طريق إعطاء حقن داخل الصفاق من الكيتامين (70 ملغ/كغ) والزيلازين (10 ملغ/كغ). تأكد من التخدير المناسب من خلال تقييم عدم وجود استجابات انعكاسية (على سبيل المثال ، قرصة إصبع القدم) ومراقبة معدل التنفس. لمنع جفاف القرنية أثناء التخدير ، ضع مرهم عيون بيطري معقم على العينين.
   2. جهز منطقة الجلد الظهرية عن طريق حلقها أولا باستخدام مقص كهربائي. تجنب تهيج الجلد أو إصابته. تعقيم المنطقة المحلوقة باستخدام محلول بوفيدون اليود.
   3. باستخدام جهاز معقم ، قم بإنشاء جرح جلدي دائري كامل السماكة مقاس 6 مم على السطح الظهري لكل فأر.
   4. ضع السقالة المطبوعة حيويا ثلاثية الأبعاد برفق والتي تحتوي على مركبات كهربائية تحمل علامة PKH مباشرة على فراش الجرح. تأكد من أن السقالة تغطي سطح الجرح بالكامل بأقل قدر من الجيوب الهوائية عن طريق الضغط برفق باستخدام ملقط معقم. تأكد من مراقبة عن كثب بعد العملية والبقاء تحت المراقبة حتى يستعيد وعيه تماما ويمكنه الحفاظ على الاستلقاء القصي.
2. التصوير الفلوري
   1. في 2 ساعة ، 4 ساعات ، 8 ساعات ، 24 ساعة بعد الزرع ، قم بتخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران. لتحريض التخدير ، ضع الفئران في حجرة نظام التصوير في الجسم الحي (IVIS) وعرضها ل 2٪ -3٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين. ضع مرهم العين على عيون الفئران لمنع الجفاف. بمجرد التخدير ، انقل الفئران إلى نظام IVIS وحافظ عليها بنسبة 1٪ -2٪ من الأيزوفلوران في الأكسجين الذي يتم توصيله عبر قنوات الأنف. تحقق من أن مخدرة تماما ومستقرة قبل الشروع في التصوير.
   2. استخدم نظام IVIS لالتقاط إشارات الفلورسنت من المركبات الكهربائية التي تحمل علامة PKH والتي تم إطلاقها من السقالة. في معالج التصوير، حدد خيار التصوير الفلوري وقم بتنشيط مرشحات الإثارة والانبعاث لصبغة PKH. اضبط إعدادات الكاميرا، بما في ذلك مجال الرؤية وارتفاع الهدف، لتحسين اكتشاف الإشارة. تأكد من تحديد المواقع المتسقة عبر جميع النقاط الزمنية للتصوير لتمكين المقارنات الدقيقة. ابدأ في الحصول على الصور وحفظ البيانات الناتجة.
   3. حدد كثافة إشارة الفلورسنت باستخدام برنامج IVIS. سيسمح ذلك بتتبع إطلاق المركبات الكهربائية بمرور الوقت.

النتائج

تم تصوير الإصدار في الجسم الحي للمركبات الكهربائية من كل من سقالات Alg-EVs / CMCh و Alg-EVs / CMCh-AlgLyase في الشكل 1 ب ، ج. كما هو متوقع ، أظهرت سقالة Alg-EVs / CMCh-AlgLyase ملف تعريف إطلاق أسرع مقارنة ب Alg-EVs / CMCh ، لا سيما في النقاط الزمنية 2 ساعة و 4 ساعات. يخضع إطلاق ال?...

Discussion

يتمثل أحد الجوانب المحورية للبروتوكول في تصميم السقالة ذات الغلاف الأساسي ، وهو أمر ضروري لتحقيق تسليم المركبات الكهربائية بكفاءة. يشتمل التصميم على Alg كمادة أساسية ومزيج من CMCh مع Alglyase كغمد. يسهل هذا الإعداد الإطلاق الخاضع للرقابة والسرعة للمركبات الكهربائية. المادة ال...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23 G Purple precision conical Nozzle	Cellink	KT0000002000	To provide precise extrusion of bioinks with minimal clogging
Alginate lyase (AlgLyase)	Sigma Aldrich	A1603-100MG	Algyase is an enzyme that degrades alginate.
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCO	Merck	UFC9030	Used to wash PKH-26 labeled-EVs
BCA assay Kit	Thermo Scientific	10678484	To determine the protein/EVs concentration
Bioprinting System	Regemat	V1	To fabricate core-sheath scaffold
Bovine serum albumin (BSA)	sigma-aldrich	05470-5G	To stop PKH 26 reaction
Calcium chloride	Sigma Aldrich	C3306-100G	To crosslink and stabilize bioinks in tissue engineering
Centrifuge	Sigma	2-16P	Used for EVs isolation
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	22625101	Used for cell culture
Class II Biological Safety Cabinet	Telstar	Bio II Advance	Cell culture
CryoCube F570 Series - ULT Freezer	Eppendorf	F571240035	To store EVs
fluorescent microscope	OLYMPUS	IX73P1F	Used to check the residual PKH-26 in the filtrate
Gentamicin (50 mg/mL)	Thermofisher	15750	Antibiotic for cell culture media
GlutaMAX-I CTS, (100X), liquid	Thermofisher	A12860	Cell culture media supplement
HCl	Sigma Aldrich	7647-01-0	Buffer preparation
HEPES	Carl Roth	Art. No. 6763.3	Buffer preparation
High viscous carboxymethyl cellulose (CMCh)	BDH	27929 4T	CMCh is a water-soluble cellulose derivative.
Incubator	New Brunswick	NB-170R	Cell culture
Invivo imaging	PerkinElmer	IVIS Lumina XRMS Series III	To track EVs release, in vivo
Magnet stirer	SalvisLAB	MC35	For Bioinks preparation
miRCURY Exosome Kits for Exosome Isolation	Qiagen	76743	Evs isolation
NaOh	Daejung	1310-73-2	Buffer preparation
phosphate buffered saline(PBS)	Thermo Scientific	J61196.AP	Cell culture
PKH 26	MCE	154214-55-8	Red fluorescent dye for labeling theEVs
Sodium alginate (Alg)	Sigma Aldrich	A0682-100G	Natural polysaccharide derived from brown seaweed.
Sodium chloride (NaCl)	Carl Roth	Art-Nr-P029.1	Buffer preparation
StemPro BM Mesenchymal Stem Cells	Thermofisher	A1382901	Mesenchymal stem cells
StemPro MSC SFM XenoFree	Thermofisher	A1067501	Cell culture media
Trypsin 0.25%	Thermofisher	25050014	Cell dissociation
Vortex-Mixer	Daihan Scientific	VM-10	Used to mix precipitation buffer with the conditioned media