Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.
Method Article
Bu çalışma, kronik yara iyileşmesi için çekirdek kılıflı 3D-biyo-baskılı iskelelerin imalatı için bir protokol sunmaktadır. Hücre dışı veziküller mezenkimal kök hücrelerden izole edilir ve karboksimetil selüloz ve aljinat liyazdan yapılan kılıf ile çekirdeğe (aljinat) yüklenir. Bu tasarım, kontrollü iskele bozulmasına ve verimli EV'lerin serbest bırakılmasına izin verir.
Bu çalışma, kronik yara iyileşmesini arttırmak için tasarlanmış çekirdek kılıflı 3D biyobaskılı iskelelerin üretimi için ayrıntılı bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Protokol, rejeneratif ve immünomodülatör özellikleri ile bilinen mezenkimal kök hücrelerden (MSC'ler) hücre dışı veziküllerin (EV'ler) izole edilmesini içerir. Bu EV'ler daha sonra benzersiz bir iskele yapısına dahil edilir. İskele, karboksimetil selüloz ve aljinat liyazdan yapılmış bir kılıfla çevrili, EV'lerle yüklü aljinattan oluşan bir çekirdeğe sahiptir. Bu yenilikçi tasarım, yara bölgesinde EV'lerin verimli ve kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasını teşvik ederken kontrollü iskele bozulmasını sağlar. Protokol, EV'lerin hazırlanması ve karakterizasyonu, 3D biyo-baskı için biyo-mürekkeplerin formülasyonu ve istenen çekirdek-kılıf mimarisini elde etmek için baskı parametrelerinin optimizasyonu dahil olmak üzere temel adımları kapsar. İskele, yapısal bütünlüğü ve biyoaktiviteyi birleştirerek, geleneksel yara örtülerinin sınırlamalarını ele almayı, doku yenilenmesini hızlandırmak ve kronik yaralarda iltihabı azaltmak için hedefli bir yaklaşım sunmayı amaçlamaktadır. Bu yöntem, kronik yara yönetiminde potansiyel klinik uygulamalara sahip gelişmiş biyomateryaller geliştirmek için tekrarlanabilir ve ölçeklenebilir bir strateji sağlar. Protokol ayrıca, gelecekteki terapötik uygulamalar için uyarlanabilirliği sağlayarak tutarlı sonuçlar elde etmek için kritik hususları vurgulamaktadır.
Genellikle aşırı iltihaplanma ile bağlantılı kronik yaralar, amputasyonlara yol açabilecek enfeksiyonlar ve doku nekrozu gibi ciddi komplikasyonları önlemek için zamanında tedavi gerektirir. İlerlemelere rağmen, mevcut tedaviler maliyetli, elverişsiz, yan etkilere sahip ve sınırlı etkinliğe sahip olmaya devam ediyor, bu da daha iyileştirici pansumanlara olan ihtiyacı vurgulamaktadır 1,2,3. Kronik yaralar için özel olarak tasarlanmış yeni nesil yara örtülerinin geliştirilmesi, bu zorlukların üstesinden gelmek için çok önemlidir. Ayrıca, yara iyileşmesinin karmaşık doğası, nemlendirme, esneklik, yapışma, biyoaktivite ve biyolojik olarak parçalanabilirlik dahil olmak üzere bir dizi özelliğe sahip pansuman malzemeleri gerektirir4. Bu çalışma, kontrollü bir terapötik ortam sağlamak ve kronik yara iyileşmesini hızlandırmak için hücre dışı vezikülleri (EV'ler) çekirdek kılıflı 3D biyobaskılı bir iskele ile entegre eden biyomühendislik ürünü bir yara örtüsü geliştirmeyi amaçlamaktadır.
Kök hücrelerden elde edilen EV'ler, anti-inflamatuar yanıtları, hücre büyümesini, göçü ve kan damarı oluşumunu teşvik ederek kronik yara iyileşmesine yardımcı olur5. Ek olarak, EV'ler, kronik yara yönetimi için küçük moleküllü ilaçlar, gen ve protein yapıları dahil olmak üzere biyoaktif moleküller sağlayabilir6. Ayrıca, kargoyu enzimatik bozunmadan koruma yetenekleri, terapötik ajanların stabilitesini ve biyoyararlanımını geliştirerek, genellikle in vivo olarak hızla bozunan geleneksel büyüme faktörlerine ve küçük moleküllü ilaçlara göre belirgin avantajlar sunar 7. Bu avantajlara rağmen, EV'lerin hedef dokulara verimli ve sürekli olarak verilmesi önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir.
3D biyo-baskı iskeleleri, EV'lerin terapötik etkilerini artırmaları için bir dağıtım platformu olarak hizmet edebilir8. Bu iskeleler doğal hücresel ortamları taklit eder ve EV'lerin kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasına izinverir 9,10. Ayrıca EV'leri bozulmaya karşı koruyarak mikroRNA'larının ve proteinlerininstabilitesini arttırırlar 11. Han ve ark. EV'lerin 3D biyobaskılı GelMA iskelelerinden etkili bir şekilde serbest bırakılabileceğini gösterdi. Bu salınım, iskelelere12 ekilen insan bukkal yağ yastığı mezenkimal kök hücrelerinde (hBFP-MSC'ler) gelişmiş hücre bağlanmasına ve mekanotransdüksiyon yollarıyla ilgili gelişmiş gen ekspresyonuna yol açtı. Born ve diğerleri, çapraz bağlayıcının konsantrasyonunu optimize ederek, EV'lerin kontrollü bir şekilde serbest bırakılmasını sağladı. Bu yaklaşım, anjiyogenezi teşvik etmede etkinlik göstermiştir ve EV'lerin düzenlenmiş iletimi için umut verici bir yöntem sunmaktadır13.
Çekirdek kılıf 3D biyobaskı, bir kılıf içine yerleştirilmiş bir çekirdek malzemeyi yazdırarak karmaşık, çok malzemeli yapıların oluşturulmasını sağlar. Çekirdek, hücreleri, büyüme faktörlerini veya ilaçları içerebilirken, kılıf mekanik destek ve koruma sağlar veya bir bariyer görevi görür. Bu yöntemin doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta vasküler ağlar geliştirme, doğal doku yapılarını taklit etme ve ilaç dağıtım sistemleri oluşturma gibi uygulamaları vardır. Malzeme dağılımı ve bileşimi üzerinde hassas kontrol sağlayarak yapıların işlevselliğini ve biyolojik uygunluğunu artırır. Alternatif tekniklerle karşılaştırıldığında, çekirdek kılıf 3D biyobaskı, malzeme dağılımı ve bileşimi üzerinde hassas kontrol sağlayarak yapıların işlevselliğini ve biyolojik uygunluğunu geliştirir14,15.
Yara örtülerinde tasarlanmış bozulma, değişiklikler sırasında daha az rahatsızlık, iyileşme ve enfeksiyon kontrolü için nemli bir ortam, zamanında terapötik uygulama ve optimal doku rejenerasyonu gibi faydalar sunar 16,17,18. Aljinat (Alg) ve karboksimetil selüloz (CMCh) hidrojeller biyouyumludur ve yaralara hücre dışı veziküller (EV'ler) vermek, hücresel iletişim ve iltihabı azaltma yoluyla iyileşmeyi artırmak için etkilidir18. Bu çalışmada, EV'ler bir Alg çekirdeğine entegre edilirken, hızlı pansuman bozunmasını ve EV'lerin verilmesini sağlamak için bir CMCh ve AlgLiyaz (AlgLiyaz) kılıfı kullanıldı. Bu çekirdek kılıf tasarımı, iskele bozulmasına yanıt olarak EV'lerin hızlı bir şekilde salınmasını kolaylaştırır, terapötik etkinliklerini artırır ve mevcut kronik yara tedavilerinin sınırlamalarını ele alır. Bu çalışmanın birincil amacı, kontrollü EV salınımını duyarlı bir şekilde parçalanabilen bir iskele ile entegre ederek yara iyileşmesini artıran ve sonuçta kronik yaralar için tedavi sonuçlarını iyileştiren biyomühendislik ürünü bir yara örtüsü geliştirmektir.
Hayvan araştırması, Ulusal Biyoetik Komitesi ve Nizwa Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından belirlenen etik standartlara tam olarak uygun olarak yürütülmüştür. Bu çalışma için etik onay, izin kimliği: VCGSR, AREC/01/2023 kapsamında verilmiştir. Tüm hayvanlar standart laboratuvar koşulları altında barındırıldı ve çalışma boyunca refahlarını korumak için optimal çevresel kontroller, doğru beslenme ve kapsamlı bakım sağlandı. Hayvanları içeren tüm prosedürler, kurumsal politikalara, uluslararası hayvan bakım standartlarına ve ARRIVE yönergelerine sıkı sıkıya bağlı kalmıştır.
1. Hücre kültürü
2. EV izolasyonu
3. PKH-26 ile EV etiketleme
4. 3D Biyo-baskı
5. EV'lerin piyasaya sürülmesini izleme
EV'lerin hem Alg-EVs/CMCh hem de Alg-EVs/CMCh-AlgLyase iskelelerinden in vivo salınımı Şekil 1B,C'de gösterilmektedir. Beklendiği gibi, Alg-EV'ler/CMCh-AlgLyase iskelesi, özellikle 2 saat ve 4 saat zaman noktalarında Alg-EV'ler/CMCh'ye kıyasla daha hızlı bir salınım profili sergiledi. EV'lerin hidrojellerden salınması, difüzyon, şişme, erozyon ve bozunma dahil olmak üzere fizikokimyasal mekanizmaların bir kombina...
Protokolün en önemli yönlerinden biri, verimli EV teslimatı elde etmek için gerekli olan çekirdek kılıflı iskele tasarımıdır. Tasarım, çekirdek malzeme olarak Alg'yi ve kılıf olarak CMCh ile Alglyase kombinasyonunu içerir. Bu kurulum, EV'lerin kontrollü ve hızlı bir şekilde serbest bırakılmasını kolaylaştırır. Çekirdek malzeme olan Alg, EV'leri kapsayarak korunmalarını ve yerelleştirilmiş teslimatlarını sağlar. CMCh ve Alglyaz'dan oluşan kılıf, EV'l...
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Happy Production'dan Said Al-Hashmi ve Abdulrahman Almharbi'ye çekimlerdeki mükemmel çalışmaları için özel teşekkürler. Ayrıca Yüksek Öğrenim, Araştırma ve Yenilik Bakanlığı'na ve Nizwa Üniversitesi'ne mali destekleri ve gerekli kaynakları sağladıkları için şükranlarımızı sunarız.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
23 G Purple precision conical Nozzle | Cellink | KT0000002000 | To provide precise extrusion of bioinks with minimal clogging |
Alginate lyase (AlgLyase) | Sigma Aldrich | A1603-100MG | Algyase is an enzyme that degrades alginate. |
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCO | Merck | UFC9030 | Used to wash PKH-26 labeled-EVs |
BCA assay Kit | Thermo Scientific | 10678484 | To determine the protein/EVs concentration |
Bioprinting System | Regemat | V1 | To fabricate core-sheath scaffold |
Bovine serum albumin (BSA) | sigma-aldrich | 05470-5G | To stop PKH 26 reaction |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C3306-100G | To crosslink and stabilize bioinks in tissue engineering |
Centrifuge | Sigma | 2-16P | Used for EVs isolation |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Used for cell culture |
Class II Biological Safety Cabinet | Telstar | Bio II Advance | Cell culture |
CryoCube F570 Series - ULT Freezer | Eppendorf | F571240035 | To store EVs |
fluorescent microscope | OLYMPUS | IX73P1F | Used to check the residual PKH-26 in the filtrate |
Gentamicin (50 mg/mL) | Thermofisher | 15750 | Antibiotic for cell culture media |
GlutaMAX-I CTS, (100X), liquid | Thermofisher | A12860 | Cell culture media supplement |
HCl | Sigma Aldrich | 7647-01-0 | Buffer preparation |
HEPES | Carl Roth | Art. No. 6763.3 | Buffer preparation |
High viscous carboxymethyl cellulose (CMCh) | BDH | 27929 4T | CMCh is a water-soluble cellulose derivative. |
Incubator | New Brunswick | NB-170R | Cell culture |
Invivo imaging | PerkinElmer | IVIS Lumina XRMS Series III | To track EVs release, in vivo |
Magnet stirer | SalvisLAB | MC35 | For Bioinks preparation |
miRCURY Exosome Kits for Exosome Isolation | Qiagen | 76743 | Evs isolation |
NaOh | Daejung | 1310-73-2 | Buffer preparation |
phosphate buffered saline(PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | Cell culture |
PKH 26 | MCE | 154214-55-8 | Red fluorescent dye for labeling theEVs |
Sodium alginate (Alg) | Sigma Aldrich | A0682-100G | Natural polysaccharide derived from brown seaweed. |
Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | Art-Nr-P029.1 | Buffer preparation |
StemPro BM Mesenchymal Stem Cells | Thermofisher | A1382901 | Mesenchymal stem cells |
StemPro MSC SFM XenoFree | Thermofisher | A1067501 | Cell culture media |
Trypsin 0.25% | Thermofisher | 25050014 | Cell dissociation |
Vortex-Mixer | Daihan Scientific | VM-10 | Used to mix precipitation buffer with the conditioned media |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır