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Method Article
In dieser Studie wird ein Protokoll zur Herstellung von 3D-bio-gedruckten Gerüsten für die chronische Wundheilung vorgestellt. Extrazelluläre Vesikel werden aus mesenchymalen Stammzellen isoliert und mit der Hülle aus Carboxymethylcellulose und Alginat-Lyase in den Kern (Alginat) geladen. Dieses Design ermöglicht eine kontrollierte Degradation des Gerüsts und eine effiziente Freisetzung von Elektrofahrzeugen.
Diese Studie skizziert ein detailliertes Protokoll für die Herstellung von 3D-biogedruckten Gerüsten mit Kernhülle, die die Heilung chronischer Wunden verbessern sollen. Das Protokoll beinhaltet die Isolierung extrazellulärer Vesikel (EVs) aus mesenchymalen Stammzellen (MSCs), die für ihre regenerativen und immunmodulatorischen Eigenschaften bekannt sind. Diese Elektrofahrzeuge werden dann in eine einzigartige Gerüststruktur integriert. Das Gerüst besteht aus einem Kern aus Alginat, das mit EVs beladen ist, und ist von einem Mantel aus Carboxymethylcellulose und Alginatlyase umgeben. Dieses innovative Design gewährleistet einen kontrollierten Gerüstabbau und fördert gleichzeitig eine effiziente und kontrollierte Freisetzung von EVs an der Wundstelle. Das Protokoll umfasst wichtige Schritte, darunter die Vorbereitung und Charakterisierung der EVs, die Formulierung von Biotinten für das 3D-Bioprinting und die Optimierung der Druckparameter, um die gewünschte Kern-Hüllen-Architektur zu erreichen. Durch die Kombination von struktureller Integrität und Bioaktivität zielt das Gerüst darauf ab, die Einschränkungen herkömmlicher Wundauflagen zu überwinden und einen gezielten Ansatz zur Beschleunigung der Geweberegeneration und zur Reduzierung von Entzündungen bei chronischen Wunden zu bieten. Diese Methode bietet eine reproduzierbare und skalierbare Strategie für die Entwicklung fortschrittlicher Biomaterialien mit potenziellen klinischen Anwendungen in der chronischen Wundversorgung. Das Protokoll hebt auch kritische Überlegungen hervor, um konsistente Ergebnisse zu erzielen und die Anpassungsfähigkeit für zukünftige therapeutische Anwendungen zu gewährleisten.
Chronische Wunden, die oft mit übermäßigen Entzündungen verbunden sind, müssen rechtzeitig behandelt werden, um schwerwiegende Komplikationen wie Infektionen und Gewebenekrosen zu vermeiden, die zu Amputationen führen können. Trotz der Fortschritte sind die derzeitigen Behandlungen nach wie vor kostspielig, unbequem, haben Nebenwirkungen und sind nur begrenzt wirksam, was den Bedarf an mehr heilenden Verbänden unterstreicht 1,2,3. Die Entwicklung einer neuen Generation von Wundauflagen, die speziell für chronische Wunden entwickelt wurden, ist unerlässlich, um diese Herausforderungen zu bewältigen. Darüber hinaus erfordert die komplexe Natur der Wundheilung Verbandsmaterialien mit einer Reihe von Eigenschaften, darunter Befeuchtung, Flexibilität, Adhäsion, Bioaktivität und biologische Abbaubarkeit4. Diese Studie zielt darauf ab, einen biotechnologisch hergestellten Wundverband zu entwickeln, der extrazelluläre Vesikel (EVs) mit einem 3D-biogedruckten Gerüst aus der Kernhülle integriert, um eine kontrollierte therapeutische Umgebung zu schaffen und die chronische Wundheilung zu beschleunigen.
EVs, die aus Stammzellen gewonnen werden, unterstützen die chronische Wundheilung, indem sie entzündungshemmende Reaktionen, Zellwachstum, Migration und Blutgefäßbildung fördern5. Darüber hinaus können Elektrofahrzeuge bioaktive Moleküle liefern, darunter niedermolekulare Medikamente, Gen- und Proteinkonstrukte für die Behandlung chronischer Wunden6. Darüber hinaus verbessert ihre Fähigkeit, die Fracht vor enzymatischem Abbau zu schützen, die Stabilität und Bioverfügbarkeit von Therapeutika und bietet deutliche Vorteile gegenüber herkömmlichen Wachstumsfaktoren und niedermolekularen Medikamenten, die in vivo oft schnell abgebaut werden 7. Trotz dieser Vorteile bleibt die effiziente und nachhaltige Verabreichung von EVs an das Zielgewebe eine große Herausforderung.
3D-Bioprinting-Gerüste können als Verabreichungsplattform für Elektrofahrzeuge dienen, um deren therapeutische Wirkung zu verstärken8. Diese Gerüste ahmen die natürliche zelluläre Umgebung nach und ermöglichen die kontrollierte Freisetzung von EVs 9,10. Sie schützen EVs auch vor Degradation und erhöhen die Stabilität ihrer microRNAs und Proteine11. Han et al. zeigten, dass EVs effektiv aus 3D-biogedruckten GelMA-Gerüsten freigesetzt werden können. Diese Freisetzung führte zu einer verbesserten Zelladhäsion und einer erhöhten Genexpression im Zusammenhang mit Mechanotransduktionswegen in humanen mesenchymalen Stammzellen (hBFP-MSCs) des bukkalen Fettpolsters, die auf die Gerüste ausgesät wurden12. Born et al. erreichten durch die Optimierung der Konzentration des Vernetzers eine kontrollierte Freisetzung der EVs. Dieser Ansatz hat sich als wirksam bei der Förderung der Angiogenese erwiesen und bietet eine vielversprechende Methode für die regulierte Verabreichung von EVs13.
Der 3D-Biodruck von Kernhülle ermöglicht die Herstellung komplexer Strukturen aus mehreren Materialien, indem ein Kernmaterial gedruckt wird, das von einer Hülle umhüllt ist. Der Kern kann Zellen, Wachstumsfaktoren oder Medikamente enthalten, während die Hülle mechanischen Halt und Schutz bietet oder als Barriere fungiert. Diese Methode findet Anwendung im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin, z. B. bei der Entwicklung von Gefäßnetzwerken, der Nachahmung natürlicher Gewebestrukturen und der Entwicklung von Arzneimittelverabreichungssystemen. Es ermöglicht eine präzise Kontrolle über die Materialverteilung und -zusammensetzung und verbessert so die Funktionalität und biologische Relevanz der Konstrukte. Im Vergleich zu alternativen Techniken bietet der 3D-Biodruck der Kernhülle eine präzise Kontrolle über die Materialverteilung und -zusammensetzung, wodurch die Funktionalität und biologische Relevanz der Konstrukte verbessertwird 14,15.
Die technische Degradation in Wundauflagen bietet Vorteile wie reduzierte Beschwerden während des Wechsels, eine feuchte Umgebung für die Heilung und Infektionskontrolle, eine rechtzeitige therapeutische Verabreichung und eine optimale Geweberegeneration 16,17,18. Hydrogele aus Alginat (Alg) und Carboxymethylcellulose (CMCh) sind biokompatibel und wirksam für die Verabreichung extrazellulärer Vesikel (EVs) an Wunden, verbessern die Heilung durch zelluläre Kommunikation und reduzieren Entzündungen18. In dieser Studie wurden EVs in einen Kern aus Alg integriert, während eine Hülle aus CMCh und AlgLyase (AlgLyase) verwendet wurde, um einen schnellen Verbandsabbau und die Abgabe von EVs zu ermöglichen. Dieses Kern-Hüllen-Design erleichtert die schnelle Freisetzung von EVs als Reaktion auf den Gerüstabbau, verbessert ihre therapeutische Wirksamkeit und überwindet die Einschränkungen bestehender chronischer Wundbehandlungen. Das primäre Ziel dieser Studie ist es, einen biotechnologisch hergestellten Verband zu entwickeln, der die Wundheilung verbessert, indem er die kontrollierte Freisetzung von EVs mit einem reaktionsschnell abbaubaren Gerüst integriert und so letztendlich die Behandlungsergebnisse für chronische Wunden verbessert.
Die Tierversuche wurden in voller Übereinstimmung mit den ethischen Standards durchgeführt, die vom Nationalen Komitee für Bioethik und der Tierethikkommission der Universität Nizwa festgelegt wurden. Die ethische Zulassung für diese Studie wurde unter der Freigabe-ID: VCGSR, AREC/01/2023 erteilt. Alle Tiere wurden unter Standardlaborbedingungen untergebracht, um optimale Umweltkontrollen, die richtige Ernährung und eine umfassende Pflege zu gewährleisten, um ihr Wohlergehen während der gesamten Studie zu gewährleisten. Alle Verfahren mit Tieren hielten sich strikt an die institutionellen Richtlinien, die internationalen Tierhaltungsstandards und die ANARRIVE-Richtlinien.
1. Zellkultur
2. Isolierung von Elektrofahrzeugen
3. Kennzeichnung von Elektrofahrzeugen mit PKH-26
4. 3D Bio-Druck
5. Verfolgung der Veröffentlichung von Elektrofahrzeugen
Die In-vivo-Freisetzung von EVs sowohl aus den Alg-EVs/CMCh- als auch aus den Alg-EVs/CMCh-AlgLyase-Gerüsten ist in Abbildung 1B,C dargestellt. Wie erwartet zeigte das Alg-EVs/CMCh-AlgLyase-Gerüst im Vergleich zu Alg-EVs/CMCh ein schnelleres Freisetzungsprofil, insbesondere zu den Zeitpunkten 2 h und 4 h. Die Freisetzung von EVs aus Hydrogelen wird durch eine Kombination physikalisch-chemischer Mechanismen gesteuert, darunter Diff...
Ein zentraler Aspekt des Protokolls ist das Kern-Mantel-Gerüstdesign, das für eine effiziente Lieferung von Elektrofahrzeugen unerlässlich ist. Das Design besteht aus Alg als Kernmaterial und einer Kombination aus CMCh und Alglyase als Mantel. Dieser Aufbau ermöglicht eine kontrollierte und schnelle Freigabe von Elektrofahrzeugen. Das Kernmaterial, Alg, verkapselt die Elektrofahrzeuge und gewährleistet ihren Schutz und ihre lokale Abgabe. Die Hülle, bestehend aus CMCh und Alglyase,...
Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.
Besonderer Dank geht an Said Al-Hashmi und Abdulrahman Almharbi von Happy Production für ihre hervorragende Arbeit bei den Dreharbeiten. Wir danken auch dem Ministerium für Hochschulbildung, Forschung und Innovation und der Universität Nizwa für ihre finanzielle Unterstützung und die Bereitstellung der erforderlichen Ressourcen.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
23 G Purple precision conical Nozzle | Cellink | KT0000002000 | To provide precise extrusion of bioinks with minimal clogging |
Alginate lyase (AlgLyase) | Sigma Aldrich | A1603-100MG | Algyase is an enzyme that degrades alginate. |
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCO | Merck | UFC9030 | Used to wash PKH-26 labeled-EVs |
BCA assay Kit | Thermo Scientific | 10678484 | To determine the protein/EVs concentration |
Bioprinting System | Regemat | V1 | To fabricate core-sheath scaffold |
Bovine serum albumin (BSA) | sigma-aldrich | 05470-5G | To stop PKH 26 reaction |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C3306-100G | To crosslink and stabilize bioinks in tissue engineering |
Centrifuge | Sigma | 2-16P | Used for EVs isolation |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Used for cell culture |
Class II Biological Safety Cabinet | Telstar | Bio II Advance | Cell culture |
CryoCube F570 Series - ULT Freezer | Eppendorf | F571240035 | To store EVs |
fluorescent microscope | OLYMPUS | IX73P1F | Used to check the residual PKH-26 in the filtrate |
Gentamicin (50 mg/mL) | Thermofisher | 15750 | Antibiotic for cell culture media |
GlutaMAX-I CTS, (100X), liquid | Thermofisher | A12860 | Cell culture media supplement |
HCl | Sigma Aldrich | 7647-01-0 | Buffer preparation |
HEPES | Carl Roth | Art. No. 6763.3 | Buffer preparation |
High viscous carboxymethyl cellulose (CMCh) | BDH | 27929 4T | CMCh is a water-soluble cellulose derivative. |
Incubator | New Brunswick | NB-170R | Cell culture |
Invivo imaging | PerkinElmer | IVIS Lumina XRMS Series III | To track EVs release, in vivo |
Magnet stirer | SalvisLAB | MC35 | For Bioinks preparation |
miRCURY Exosome Kits for Exosome Isolation | Qiagen | 76743 | Evs isolation |
NaOh | Daejung | 1310-73-2 | Buffer preparation |
phosphate buffered saline(PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | Cell culture |
PKH 26 | MCE | 154214-55-8 | Red fluorescent dye for labeling theEVs |
Sodium alginate (Alg) | Sigma Aldrich | A0682-100G | Natural polysaccharide derived from brown seaweed. |
Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | Art-Nr-P029.1 | Buffer preparation |
StemPro BM Mesenchymal Stem Cells | Thermofisher | A1382901 | Mesenchymal stem cells |
StemPro MSC SFM XenoFree | Thermofisher | A1067501 | Cell culture media |
Trypsin 0.25% | Thermofisher | 25050014 | Cell dissociation |
Vortex-Mixer | Daihan Scientific | VM-10 | Used to mix precipitation buffer with the conditioned media |
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