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  • Déclarations de divulgation
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  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Cette étude présente un protocole de fabrication d’échafaudages bio-imprimés en 3D pour la cicatrisation des plaies chroniques. Les vésicules extracellulaires sont isolées à partir de cellules souches mésenchymateuses et chargées dans le noyau (alginate) avec la gaine fabriquée à partir de carboxyméthylcellulose et d’alginate lyase. Cette conception permet une dégradation contrôlée de l’échafaudage et une libération efficace des VE.

Résumé

Cette étude décrit un protocole détaillé pour la fabrication d’échafaudages bio-imprimés en 3D conçus pour améliorer la cicatrisation des plaies chroniques. Le protocole consiste à isoler des vésicules extracellulaires (VE) à partir de cellules souches mésenchymateuses (CSM), connues pour leurs propriétés régénératives et immunomodulatrices. Ces véhicules électriques sont ensuite incorporés dans une structure d’échafaudage unique. L’échafaudage comporte un noyau composé d’alginate chargé de VE, entouré d’une gaine faite de carboxyméthylcellulose et d’alginate lyase. Cette conception innovante assure une dégradation contrôlée de l’échafaudage tout en favorisant une libération efficace et contrôlée des VE au site de la plaie. Le protocole couvre des étapes clés, notamment la préparation et la caractérisation des VE, la formulation de bio-encres pour la bio-impression 3D et l’optimisation des paramètres d’impression pour obtenir l’architecture cœur-gaine souhaitée. En combinant l’intégrité structurelle et la bioactivité, l’échafaudage vise à remédier aux limites des pansements conventionnels, en offrant une approche ciblée pour accélérer la régénération des tissus et réduire l’inflammation dans les plaies chroniques. Cette méthode fournit une stratégie reproductible et évolutive pour le développement de biomatériaux avancés avec des applications cliniques potentielles dans la gestion des plaies chroniques. Le protocole met également en évidence les considérations essentielles pour obtenir des résultats cohérents, garantissant l’adaptabilité aux applications thérapeutiques futures.

Introduction

Les plaies chroniques, souvent liées à une inflammation excessive, nécessitent une prise en charge rapide pour prévenir des complications graves telles que les infections et la nécrose des tissus, qui peuvent entraîner des amputations. Malgré les progrès, les traitements actuels restent coûteux, peu pratiques, ont des effets secondaires et ont une efficacité limitée, ce qui souligne la nécessité de plus de pansements curatifs 1,2,3. Le développement d’une nouvelle génération de pansements spécialement conçus pour les plaies chroniques est essentiel pour relever ces défis. De plus, la nature complexe de la cicatrisation des plaies exige des matériaux de pansement dotés d’une gamme de propriétés, notamment l’hydratation, la flexibilité, l’adhérence, la bioactivité et la biodégradabilité4. Cette étude vise à développer un pansement bio-conçu qui intègre des vésicules extracellulaires (VE) avec un échafaudage bio-imprimé en 3D pour fournir un environnement thérapeutique contrôlé et accélérer la cicatrisation des plaies chroniques.

Les VE dérivées des cellules souches aident à la cicatrisation chronique des plaies en favorisant les réponses anti-inflammatoires, la croissance cellulaire, la migration et la formation de vaisseaux sanguins5. De plus, les VE peuvent délivrer des molécules bioactives, y compris des médicaments à petites molécules, des constructions de gènes et de protéines pour la gestion des plaies chroniques6. De plus, leur capacité à protéger la cargaison de la dégradation enzymatique améliore la stabilité et la biodisponibilité des agents thérapeutiques, offrant des avantages distincts par rapport aux facteurs de croissance conventionnels et aux médicaments à petites molécules, qui se dégradent souvent rapidement in vivo7. Malgré ces avantages, l’administration efficace et durable de VE aux tissus cibles reste un défi important.

Les échafaudages de bio-impression 3D peuvent servir de plate-forme d’administration aux VE pour renforcer leurs effets thérapeutiques8. Ces échafaudages imitent les environnements cellulaires naturels et permettent la libération contrôlée des VE 9,10. Ils protègent également les VE de la dégradation, améliorant ainsi la stabilité de leurs microARN et protéines11. Han et al. ont démontré que les VE peuvent être efficacement libérés à partir d’échafaudages GelMA bio-imprimés en 3D. Cette libération a conduit à une meilleure fixation cellulaire et à une expression génique accrue liée aux voies de mécanotransduction dans les cellules souches mésenchymateuses du coussinet adipeux buccal humain (hBFP-MSCs) ensemencées sur les échafaudages12. Born et al., en optimisant la concentration de l’agent de réticulation, ont obtenu une libération contrôlée des VE. Cette approche a démontré son efficacité dans la promotion de l’angiogenèse et offre une méthode prometteuse pour l’administration régulée des VE13.

La bio-impression 3D à gaine centrale permet de créer des structures complexes et multi-matériaux en imprimant un matériau de base enveloppé dans une gaine. Le noyau peut inclure des cellules, des facteurs de croissance ou des médicaments, tandis que la gaine offre un soutien mécanique et une protection ou agit comme une barrière. Cette méthode a des applications dans l’ingénierie tissulaire et la médecine régénérative, telles que le développement de réseaux vasculaires, l’imitation de structures tissulaires naturelles et la création de systèmes d’administration de médicaments. Il permet un contrôle précis de la distribution et de la composition des matériaux, améliorant ainsi la fonctionnalité et la pertinence biologique des constructions. Par rapport aux techniques alternatives, la bio-impression 3D à gaine de noyau offre un contrôle précis de la distribution et de la composition des matériaux, améliorant ainsi la fonctionnalité et la pertinence biologique des constructions14,15.

La dégradation artificielle des pansements offre des avantages tels que la réduction de l’inconfort lors des changements, un environnement humide pour la cicatrisation et le contrôle des infections, une administration thérapeutique rapide et une régénération optimale des tissus 16,17,18. Les hydrogels d’alginate (Alg) et de carboxyméthylcellulose (CMCh) sont biocompatibles et efficaces pour délivrer des vésicules extracellulaires (VE) aux plaies, améliorant la cicatrisation grâce à la communication cellulaire et à la réduction de l’inflammation18. Dans cette étude, les VE ont été intégrés dans un noyau d’Alg, tandis qu’une gaine de CMCh et d’AlgLyase (AlgLyase) a été utilisée pour permettre une dégradation rapide du pansement et la livraison des VE. Cette conception de gaine centrale facilite la libération rapide des VE en réponse à la dégradation de l’échafaudage, améliorant ainsi leur efficacité thérapeutique et remédiant aux limites des traitements existants des plaies chroniques. L’objectif principal de cette étude est de développer un pansement bio-conçu qui améliore la cicatrisation des plaies en intégrant la libération contrôlée des VE avec un échafaudage dégradable réactif, améliorant ainsi les résultats du traitement des plaies chroniques.

Protocole

La recherche sur les animaux a été menée en pleine conformité avec les normes éthiques établies par le Comité national de bioéthique et le Comité d’éthique animale de l’Université de Nizwa. L’approbation éthique de cette étude a été accordée sous l’autorisation ID : VCGSR, AREC/01/2023. Tous les animaux ont été logés dans des conditions de laboratoire standard, assurant des contrôles environnementaux optimaux, une nutrition appropriée et des soins complets pour préserver leur bien-être tout au long de l’étude. Toutes les procédures impliquant des animaux ont respecté strictement les politiques de l’établissement, les normes internationales de soins aux animaux et les directives ARRIVE.

1. Culture cellulaire

  1. Récupérer un flacon de CSM (passage #2) du stockage d’azote liquide et le manipuler avec des techniques aseptiques pour éviter la contamination. Décongelez rapidement les cellules dans un bain d’eau à 37 °C, en veillant à les retirer dès qu’il reste un petit fragment de glace.
  2. Préparez un milieu complet comprenant le milieu de base MSC SFM, complété par 1 % (v/v) de supplément MSC SFM XenoFree, 1 % (v/v) de GlutaMAX et 0,01 % (v/v) de gentamicine. Ajouter 1 mL de milieu complet préchauffé (37 °C) à raison de 3 à 5 gouttes toutes les 5 s dans le flacon, puis mélanger délicatement. Transvaser tout le contenu du flacon des CSM dans un tube conique de 15 mL contenant 4 mL de milieu complet préchauffé, dans des conditions aseptiques dans une enceinte de biosécurité de classe II.
  3. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Assurez-vous que la centrifugeuse est correctement équilibrée.
  4. Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu complet préchauffé. Ensuite, transférez les cellules dans une fiole T25 contenant 4 mL de milieu complet.
  5. Inclinez doucement le ballon pour vous assurer que les cellules sont uniformément réparties. Incuber le ballon à 37 °C avec 5 % de CO2.
  6. Changez le milieu tous les 2 jours, en le remplaçant par un milieu frais, préchauffé et complet. Utilisez un pipetage doux pour éviter de perturber les cellules. Lorsque vous atteignez une confluence de 70 % à 80 %, aspirez le milieu usé de la fiole T25.
  7. Lavez les cellules avec 3 ml de PBS frais pour éliminer les résidus. Assurez-vous que la gourde est complètement couverte pendant le lavage.
  8. Ajouter 1 mL de solution de trypsine à 0,25 % dans la fiole T25, l’incuber à 37 °C pendant 3 à 7 minutes et surveiller attentivement le détachement au microscope à un grossissement de 4x.
  9. Tapotez doucement le ballon si nécessaire pour assurer un détachement complet de la cellule. Ajoutez un milieu complet préchauffé dans le ballon et pipetez de haut en bas sur la surface pour aider à détacher les cellules. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml.
  10. Centrifugez le tube à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Mettez en suspension la pastille cellulaire dans un milieu frais et complet et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer. Transférez les cellules dans une fiole T75. Assurer une densité de semis de 5 000 cellules/cm2 pour une croissance optimale.
  11. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2. Après 72 h d’incubation cellulaire, prélever les milieux conditionnés des cellules pour l’isolement des VE. Utiliser immédiatement après le prélèvement.

2. Isolation des VE

  1. Centrifuger les 13 mL du milieu conditionné collecté à 800 x g pendant 15 min pour éliminer les débris cellulaires. Filtrez doucement le surnageant à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm pour éliminer les grosses particules.
  2. Ajouter 5 mL de tampon de précipitation dans le média filtré conditionné et bien mélanger au tourbillon. Assurez-vous que la solution est homogène.
  3. Incuber le mélange pendant la nuit à 4 °C pour permettre aux VE de précipiter. Centrifuger le mélange à 3 220 x g pendant 30 min à 20 °C. Vérifiez l’équilibre des tubes.
  4. Jetez soigneusement le surnageant sans déranger la pastille. Centrifugez à nouveau la pastille à 3 220 x g pendant 5 s pour éliminer le liquide résiduel.
  5. Pipetez doucement la pastille de VE dans 200 μL de PBS pour éviter d’endommager les VE. Mesurez la concentration en protéines des VE en suivant les instructions du fabricant (kit de dosage des protéines BCA).
  6. Effectuer un transfert Western pour détecter les marqueurs spécifiques des VE (CD63, CD81 et CD9), afin de vérifier le phénotype18 des VE. L’analyse a confirmé la présence de ces marqueurs, validant l’identité des VE19.
  7. Pour minimiser le risque de contamination par la RNase, il est recommandé de l’utiliser directement sans stockage supplémentaire. En cas de besoin, stockez les VE à -80 °C pour une utilisation ultérieure. Aliquote la suspension des VE dans des volumes de 40 μL pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.

3. Étiquetage des VE avec PKH-26

  1. Préparation du tampon
    1. Dissoudre 0,238 g de HEPES dans environ 90 mL d’eau stérile ultra-pure dans un récipient stérile. Utilisez une solution HEPES fraîchement préparée. Ajouter 0,85 g de NaCl à la solution HEPES.
    2. Ajustez le pH à 7,4 à l’aide de 1 M de NaOH ou de HCl, au besoin, à l’aide d’un pH-mètre étalonné. Ajouter de l’eau déminéralisée pour porter le volume total à 100 ml. Filtrez la solution à travers un filtre de 0,22 μm pour la stériliser.
  2. Diluer 4 μL de colorant PKH-26 dans 1 mL de tampon préparé. Bien mélanger à l’aide d’une pipette pour assurer l’homogénéité.
  3. Remettre en suspension les VE purifiés dans 1 mL de PBS à une concentration de 700 μg/mL. Ajouter 1 mL de suspension EVs à 1 mL de solution PKH-26 préparée. Pour le groupe témoin à colorant seul, ajouter 1 mL de support complet sans VE à 1 mL de solution PKH-26. Toutes les étapes suivantes sont également effectuées pour le groupe témoin afin de tenir compte d’une agrégation non spécifique potentielle ou de la formation de micelles.
  4. Mélangez soigneusement les VE en inversant doucement le tube 10x-15x. Incuber le mélange pendant 3 à 5 minutes à température ambiante, en assurant une exposition uniforme des VE au colorant.
  5. Préparez une solution fraîche de 2 ml de BSA à 1 % en utilisant de l’eau ultrapure stérile et ajoutez-la aux 2 ml du mélange résultant pour éteindre la réaction d’étiquetage. Mélangez doucement pour éviter l’agrégation.
  6. Concentrez les VE marqués PKH-26 selon le protocole mentionné ci-dessus (étapes 2.2-2.7). Remettez en suspension les VE marqués dans 300 μL de PBS. Pipetez l’échantillon de VE étiqueté PKH-26 dans un tube filtrant de 30 kDa.
  7. Centrifuger l’échantillon à 3 220 x g pendant 30 min à 4 °C. Au cours de cette étape, le colorant PKH-26 libre et les petites molécules passeront à travers la membrane dans le filtrat, tandis que les VE marquées au PKH-26 seront retenues dans le rétentat.
  8. Après la centrifugation initiale, jeter le filtrat et ajouter 300 μL de PBS au rétentat. Remettez doucement les VE en suspension dans le PBS en les pipetant de haut en bas.
  9. Centrifugez à nouveau l’échantillon à 3 220 x g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer tout colorant libre ou petites molécules restantes.
  10. Confirmer l’absence de PKH-26 dans la solution de filtrat à l’aide d’un microscope fluorescent. Si un colorant est détecté, répétez les étapes de lavage.
  11. Prélever la solution supérieure à l’aide d’une micropipette et retirer le filtre du tube de collecte. Retournez soigneusement le filtre (retournez-le).
  12. Centrifuger le filtre inversé à 800 x g pendant 5 min à 4 °C. Cela aidera à collecter les PKH-26-EV retenus de la membrane filtrante dans le nouveau tube de collecte. Utilisez directement les PKH-26-EV pour l’étape suivante.

4. 3D Bio-impression

  1. Préparation des bio-encres
    1. Préparez une solution fraîche d’Alg sodique à 4,5 % (p/v) en utilisant de l’eau stérile ultra-pure. Remuez toute la nuit à 60 °C pour permettre à la solution de se dissoudre complètement.
    2. Dissoudre le CMCh dans de l’eau stérile ultra-pure pour obtenir une solution à 3,8 % (p/v). Préparez frais. Remuer toute la nuit à 60 °C pour dissoudre complètement.
    3. Centrifugez les bio-encres préparées à 3 220 x g pendant 10 min à 25 °C pour éliminer toutes les bulles qui pourraient interférer avec le processus d’impression.
    4. Mélanger les 3 mL de solution d’Alg préparés avec les VE étiquetés ou le témoin à colorant seul à l’aide d’un mélangeur à seringue pour obtenir la concentration de 0,01 % (p/v) des VE. Assurez une distribution uniforme en mélangeant doucement.
    5. À l’aide d’un mélangeur à seringue, combiner 1 mL de CMCh avec une solution d’AlgLyase fraîchement préparée dans de l’eau stérile ultra-pure pour obtenir une concentration finale de 0,5 mU/mL.
  2. Comme illustré à la figure 1A, chargez simultanément la bio-encre Alg/Exo dans la partie centrale et la bio-encre CMCh/AlgLyase dans la partie gaine de la seringue cœur/gaine.
  3. Laissez reposer les bio-encres pendant 15 minutes avant d’imprimer.
  4. Configuration de la bio-imprimante 3D
    1. À l’aide du logiciel de bio-impression 3D, créez la structure de l’échafaudage en sélectionnant une forme cylindrique avec un motif de remplissage diagonal. Pour ce faire, réglez le diamètre et la hauteur du cylindre sur 20 mm et 1,1 mm, respectivement. Configurez la taille des pores à 1 mm.
    2. Réglez la vitesse de pompage du noyau et de la buse de la gaine à 1 mm/s avec une épaisseur de 0,25 mm par couche et réglez la vitesse de déplacement à 6 mm/s. Imprimez quatre couches d’une épaisseur de 0,25 mm par couche à température ambiante.
  5. Commencez à imprimer sur un film polyester.
  6. Utilisez l’humidificateur avec du chlorure de calcium en aérosol (2,2 %) pour réticuler l’échafaudage pendant le processus d’extrusion. Positionnez la buse de l’humidificateur à environ 20 cm de la tête d’extrusion pour assurer une réticulation efficace sans compromettre la structure de l’échafaudage. Pour une réticulation supplémentaire, immergez l’échafaudage dans une solution de chlorure de calcium (2,2 %) pendant 10 min.
  7. Rincez l’échafaudage 3 fois avec de l’eau stérile ultra-pure pour éliminer tout excès de chlorure de calcium et de bio-encre non liée.
  8. Assurez-vous que l’échafaudage est stocké dans un environnement stérile à 4 °C afin de maintenir l’intégrité et la fonctionnalité de l’échafaudage jusqu’à trois mois.

5. Suivi de la sortie des VE

  1. Création d’un modèle de plaie cutanée circulaire
    1. Anesthésier des souris diabétiques hétérozygotes Akita mâles (8 semaines) par injection intrapéritonéale de kétamine (70 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg). Confirmez la bonne anesthésie en évaluant l’absence de réponses réflexes (par exemple, pincement des orteils) et surveillez la fréquence respiratoire. Pour prévenir la sécheresse de la cornée pendant l’anesthésie, appliquez une pommade ophtalmique vétérinaire stérile sur les yeux.
    2. Préparez la zone de la peau dorsale en la rasant d’abord à l’aide d’une tondeuse électrique. Évitez les irritations ou les blessures cutanées. Stérilisez la zone rasée à l’aide d’une solution de povidone iodée.
    3. À l’aide d’un appareil de saisie stérile, créez une plaie cutanée circulaire de 6 mm sur toute l’épaisseur sur la surface dorsale de chaque souris.
    4. Placez délicatement l’échafaudage bio-imprimé en 3D contenant des VE marqués au PKH directement sur le lit de la plaie. Assurez-vous que l’échafaudage recouvre entièrement la surface de la plaie avec un minimum de poches d’air en appuyant légèrement à l’aide d’une pince stérile. Assurez-vous que l’animal est surveillé de près après l’intervention et qu’il reste surveillé jusqu’à ce qu’il ait complètement repris conscience et puisse maintenir une déposition sternale.
  2. Imagerie fluorescente
    1. À 2 h, 4 h, 8 h, 24 h après l’implantation, anesthésier les souris à l’aide d’isoflurane. Pour l’induction de l’anesthésie, placez les souris dans la chambre du système d’imagerie in vivo (IVIS) et exposez-les à 2 % à 3 % d’isoflurane dans l’oxygène. Appliquez une pommade ophtalmique sur les yeux des souris pour prévenir la sécheresse. Une fois anesthésiées, transférez les souris dans le système IVIS et maintenez-les avec 1 % à 2 % d’isoflurane dans l’oxygène délivré par les canaux nasaux. Vérifiez que les animaux sont complètement anesthésiés et stables avant de procéder à l’imagerie.
    2. Utilisez le système IVIS pour capturer les signaux fluorescents des VE marqués PKH libérés de l’échafaudage. Dans l’assistant d’imagerie, sélectionnez l’option Imagerie de fluorescence et activez les filtres d’excitation et d’émission pour le colorant PKH. Ajustez les paramètres de l’appareil photo, y compris le champ de vision et la hauteur du sujet, pour optimiser la détection du signal. Assurez un positionnement cohérent à tous les points temporels de l’imagerie pour permettre des comparaisons précises. Commencez à acquérir des images et enregistrez les données résultantes.
    3. Quantifiez l’intensité des signaux fluorescents à l’aide du logiciel IVIS. Cela permettra de suivre la sortie des VE au fil du temps.

Résultats

La libération in vivo de VE à partir des échafaudages Alg-EVs/CMCh et Alg-EVs/CMCh-AlgLyase est illustrée aux figures 1B et C. Comme prévu, l’échafaudage Alg-EVs/CMCh-AlgLyase a présenté un profil de libération plus rapide par rapport aux Alg-EVs/CMCh, en particulier aux points de temps de 2 h et 4 h. La libération de VE par les hydrogels est régie par une combinaison de mécanismes physicochimiques, notamment la diffus...

Discussion

Un aspect central du protocole est la conception de l’échafaudage à gaine centrale, qui est essentielle pour obtenir une livraison efficace des VE. La conception intègre l’Alg comme matériau de base et une combinaison de CMCh et d’Alglyase comme gaine. Cette configuration facilite la libération contrôlée et rapide des VE. Le matériau de base, Alg, encapsule les VE, assurant leur protection et leur livraison localisée. La gaine, composée de CMCh et d’Alglyase, permet la ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Un merci spécial à Said Al-Hashmi et Abdulrahman Almharbi de Happy Production pour leur excellent travail de tournage. Nous exprimons également notre gratitude au ministère de l’Enseignement supérieur, de la Recherche et de l’Innovation et à l’Université de Nizwa pour leur soutien financier et pour avoir fourni les ressources nécessaires.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
23 G Purple precision conical NozzleCellinkKT0000002000To provide precise extrusion of bioinks with minimal clogging
Alginate lyase (AlgLyase)Sigma AldrichA1603-100MGAlgyase is an enzyme that degrades alginate.
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCOMerckUFC9030Used to wash PKH-26 labeled-EVs
BCA assay KitThermo Scientific10678484To determine the protein/EVs concentration
Bioprinting SystemRegematV1To fabricate core-sheath scaffold
Bovine serum albumin (BSA)sigma-aldrich05470-5GTo stop PKH 26 reaction 
Calcium chlorideSigma AldrichC3306-100GTo crosslink and stabilize bioinks in tissue engineering
CentrifugeSigma2-16PUsed for EVs isolation
Centrifuge 5810 REppendorf22625101Used for cell culture
Class II Biological Safety CabinetTelstarBio II AdvanceCell culture
CryoCube F570 Series - ULT FreezerEppendorfF571240035To store EVs
fluorescent microscopeOLYMPUS IX73P1F Used to check the residual PKH-26 in the filtrate
Gentamicin (50 mg/mL)Thermofisher15750Antibiotic for cell culture media
GlutaMAX-I CTS, (100X), liquidThermofisherA12860Cell culture media supplement
HClSigma Aldrich7647-01-0Buffer preparation 
HEPESCarl RothArt. No. 6763.3Buffer preparation 
High viscous carboxymethyl cellulose (CMCh)BDH27929 4TCMCh is a water-soluble cellulose derivative.
IncubatorNew Brunswick NB-170RCell culture
Invivo imagingPerkinElmerIVIS Lumina XRMS Series III To track EVs release, in vivo
Magnet stirerSalvisLABMC35For Bioinks preparation
miRCURY Exosome Kits for Exosome IsolationQiagen76743Evs isolation
NaOhDaejung1310-73-2Buffer preparation 
phosphate buffered saline(PBS)Thermo ScientificJ61196.APCell culture
PKH 26MCE154214-55-8Red fluorescent dye for labeling theEVs
Sodium alginate (Alg)Sigma AldrichA0682-100GNatural polysaccharide derived from brown seaweed.
Sodium chloride (NaCl)Carl RothArt-Nr-P029.1Buffer preparation 
StemPro BM Mesenchymal Stem CellsThermofisherA1382901Mesenchymal stem cells
StemPro MSC SFM XenoFreeThermofisherA1067501Cell culture media
Trypsin 0.25%Thermofisher25050014Cell dissociation
Vortex-MixerDaihan ScientificVM-10Used to mix precipitation buffer with the conditioned media

Références

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