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Method Article
本研究提出了一种制造用于慢性伤口愈合的核心护套 3D 生物打印支架的方案。从间充质干细胞中分离出细胞外囊泡,并用由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶制成的鞘装入核心(海藻酸盐)。这种设计允许受控的支架降解和高效的 EV 释放。
本研究概述了制造芯鞘 3D 生物打印支架的详细方案,旨在增强慢性伤口愈合。该方案涉及从间充质干细胞 (MSC) 中分离细胞外囊泡 (EV),MSC 以其再生和免疫调节特性而闻名。然后将这些 EV 整合到独特的支架结构中。该支架具有一个由载有 EV 的海藻酸盐组成的核心,周围环绕着由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶制成的护套。这种创新设计确保了受控的支架降解,同时促进了 EV 在伤口部位的高效和受控释放。该协议涵盖了关键步骤,包括 EV 的制备和表征、用于 3D 生物打印的生物墨水的配方以及打印参数的优化以实现所需的核心鞘结构。通过结合结构完整性和生物活性,该支架旨在解决传统伤口敷料的局限性,提供一种有针对性的方法来加速组织再生并减少慢性伤口的炎症。该方法为开发具有潜在临床应用在慢性伤口管理中的先进生物材料提供了一种可重复和可扩展的策略。该方案还强调了获得一致结果的关键考虑因素,确保对未来治疗应用的适应性。
慢性伤口通常与过度炎症有关,需要及时处理以防止感染和组织坏死等严重并发症,这可能导致截肢。尽管取得了进步,但目前的治疗方法仍然昂贵、不方便、有副作用且疗效有限,这凸显了对更多治愈性敷料的需求 1,2,3。开发专为慢性伤口设计的新一代伤口敷料对于应对这些挑战至关重要。此外,伤口愈合的复杂性要求敷料材料具有一系列特性,包括保湿性、柔韧性、粘附性、生物活性和生物降解性4。本研究旨在开发一种生物工程伤口敷料,将细胞外囊泡 (EV) 与核心鞘 3D 生物打印支架相结合,以提供受控的治疗环境并加速慢性伤口愈合。
源自干细胞的 EV 通过促进抗炎反应、细胞生长、迁移和血管形成来帮助慢性伤口愈合5。此外,EV 可以递送生物活性分子,包括用于慢性伤口管理的生物活性分子、基因和蛋白质构建体 6。此外,它们保护货物免受酶降解的能力提高了治疗剂的稳定性和生物利用度,与传统生长因子和小分子药物相比具有明显的优势,后者通常在体内迅速降解7。尽管有这些优势,但将 EV 高效、持续地递送到靶组织仍然是一个重大挑战。
3D 生物打印支架可以作为 EV 的递送平台,以提高其治疗效果8。这些支架模拟自然细胞环境,并允许 EV 的受控释放 9,10。它们还可以保护 EV 免于降解,增强其 microRNA 和蛋白质的稳定性11。Han 等人证明,EV 可以从 3D 生物打印的 GelMA 支架中有效释放。这种释放导致细胞粘附得到改善,并增强了与接种到支架上的人口腔脂肪垫间充质干细胞 (hBFP-MSCs) 中的机械转导途径相关的基因表达12。Born 等人通过优化交联剂的浓度,实现了 EV 的受控释放。这种方法已被证明在促进血管生成方面有效,并为 EV 的调节递送提供了一种有前途的方法13。
芯鞘 3D 生物打印通过打印包裹在鞘中的芯材,可以创建复杂的多材料结构。核心可以包括细胞、生长因子或药物,而护套提供机械支撑和保护或充当屏障。该方法在组织工程和再生医学中具有应用,例如开发血管网络、模拟自然组织结构和创建药物递送系统。它允许精确控制材料分布和组成,增强结构的功能和生物学相关性。与其他技术相比,芯鞘 3D 生物打印提供了对材料分布和组成的精确控制,从而提高了结构的功能和生物学相关性14,15。
伤口敷料中的工程降解具有减少变化期间的不适感、用于愈合和感染控制的潮湿环境、及时的治疗输送以及最佳的组织再生等好处 16,17,18。海藻酸盐 (Alg) 和羧甲基纤维素 (CMCh) 水凝胶具有生物相容性,可有效将细胞外囊泡 (EV) 输送到伤口,通过细胞通讯和减少炎症来促进愈合18。在这项研究中,EV 被整合到 Alg 的核心中,而 CMCh 和 AlgLyase (AlgLyase) 的鞘被用于实现快速敷料降解和 EV 递送。这种核心鞘设计有助于响应支架降解而快速释放 EV,增强其治疗效果并解决现有慢性伤口治疗的局限性。本研究的主要目的是开发一种生物工程敷料,通过将受控的 EV 释放与响应性可降解的支架相结合来促进伤口愈合,最终改善慢性伤口的治疗结果。
动物研究完全按照国家生物伦理委员会和尼兹瓦大学动物伦理委员会制定的道德标准进行。本研究的伦理批准是在许可 ID:VCGSR, AREC/01/2023 下授予的。所有动物都被饲养在标准的实验室条件下,确保最佳的环境控制、适当的营养和全面的照顾,以在整个研究过程中保护它们的福利。所有涉及动物的程序都严格遵守机构政策、国际动物护理标准和 ARRIVE 指南。
1. 细胞培养
2. 电动汽车隔离
3. 使用 PKH-26 标记 EV
4. 3D 生物打印
5. 跟踪电动汽车的发布
Alg-EVs/CMCh 和 Alg-EVs/CMCh-AlgLyase 支架的 EV 在体内释放如图 1B、C 所示。正如预期的那样,与 Alg-EVs/CMCh 相比,Alg-EVs/CMCh-AlgLyase 支架表现出更快的释放曲线,尤其是在 2 h 和 4 h 时间点。EV 从水凝胶中释放受物理化学机制的组合控制,包括扩散、溶胀、侵蚀和降解20。通过利用 Alglyase ,支架促进 Alg 的分解,加速 EV 的...
该协议的一个关键方面是核心护套支架设计,这对于实现高效的电动汽车交付至关重要。该设计以 Alg 为核心材料,将 CMCh 与 Alglyase 相结合作为鞘。这种设置有助于 EV 的受控和快速释放。核心材料 Alg 封装了 EV,确保其保护和本地化交付。该鞘由 CMCh 和 Alglyase 组成,能够加速 Alg 核心的降解,这对于及时释放 EV 至关重要。在我们之前的出版物18 中,我?...
作者声明他们没有利益冲突。
特别感谢 Happy Production 的 Said Al-Hashmi 和 Abdulrahman Almharbi 在拍摄中的出色工作。我们还感谢高等教育、研究和创新部以及 Nizwa 大学提供的财政支持和提供所需的资源。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
23 G Purple precision conical Nozzle | Cellink | KT0000002000 | To provide precise extrusion of bioinks with minimal clogging |
Alginate lyase (AlgLyase) | Sigma Aldrich | A1603-100MG | Algyase is an enzyme that degrades alginate. |
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCO | Merck | UFC9030 | Used to wash PKH-26 labeled-EVs |
BCA assay Kit | Thermo Scientific | 10678484 | To determine the protein/EVs concentration |
Bioprinting System | Regemat | V1 | To fabricate core-sheath scaffold |
Bovine serum albumin (BSA) | sigma-aldrich | 05470-5G | To stop PKH 26 reaction |
Calcium chloride | Sigma Aldrich | C3306-100G | To crosslink and stabilize bioinks in tissue engineering |
Centrifuge | Sigma | 2-16P | Used for EVs isolation |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 22625101 | Used for cell culture |
Class II Biological Safety Cabinet | Telstar | Bio II Advance | Cell culture |
CryoCube F570 Series - ULT Freezer | Eppendorf | F571240035 | To store EVs |
fluorescent microscope | OLYMPUS | IX73P1F | Used to check the residual PKH-26 in the filtrate |
Gentamicin (50 mg/mL) | Thermofisher | 15750 | Antibiotic for cell culture media |
GlutaMAX-I CTS, (100X), liquid | Thermofisher | A12860 | Cell culture media supplement |
HCl | Sigma Aldrich | 7647-01-0 | Buffer preparation |
HEPES | Carl Roth | Art. No. 6763.3 | Buffer preparation |
High viscous carboxymethyl cellulose (CMCh) | BDH | 27929 4T | CMCh is a water-soluble cellulose derivative. |
Incubator | New Brunswick | NB-170R | Cell culture |
Invivo imaging | PerkinElmer | IVIS Lumina XRMS Series III | To track EVs release, in vivo |
Magnet stirer | SalvisLAB | MC35 | For Bioinks preparation |
miRCURY Exosome Kits for Exosome Isolation | Qiagen | 76743 | Evs isolation |
NaOh | Daejung | 1310-73-2 | Buffer preparation |
phosphate buffered saline(PBS) | Thermo Scientific | J61196.AP | Cell culture |
PKH 26 | MCE | 154214-55-8 | Red fluorescent dye for labeling theEVs |
Sodium alginate (Alg) | Sigma Aldrich | A0682-100G | Natural polysaccharide derived from brown seaweed. |
Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | Art-Nr-P029.1 | Buffer preparation |
StemPro BM Mesenchymal Stem Cells | Thermofisher | A1382901 | Mesenchymal stem cells |
StemPro MSC SFM XenoFree | Thermofisher | A1067501 | Cell culture media |
Trypsin 0.25% | Thermofisher | 25050014 | Cell dissociation |
Vortex-Mixer | Daihan Scientific | VM-10 | Used to mix precipitation buffer with the conditioned media |
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