JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

سهلت نماذج إصابات الدماغ الرضحية المبسطة (TBI) تطوير الأساليب العلاجية. يحدد هذا البروتوكول إنشاء قشرة فأر جرح طعنة باستخدام الإبر ، مما يتيح تحليل النزيف والالتهابات. يوفر نموذج ماوس TBI المصنوع من الطعن ميزة إجراؤه دون الحاجة إلى معدات متخصصة.

Abstract

تنتج إصابات الدماغ الرضحية (TBI) عن الضرر الجسدي ، وغالبا ما يحدث بسبب الحوادث أو الحوادث المتعلقة بالرياضة. تتنوع أسباب إصابات الدماغ الرضية ، بما في ذلك الارتجاج والكدمات الدماغية والأورام الدموية وكسور الجمجمة. لتكرار هذه الأسباب المختلفة ، تم تطوير نماذج مختلفة من ماوس TBI باستخدام بروتوكولات متميزة. تؤدي إصابات الدماغ الجسدية إلى إصابات الدماغ الأولية والثانوية ، مما يؤدي إلى تفاقم فقدان الخلايا العصبية. تحدث الإصابة الأولية مباشرة بعد الضرر ، غالبا بسبب النزيف ، وبالتالي تؤدي إلى إصابات ثانوية ، بما في ذلك الالتهاب حول الآفة. لذلك فإن تطوير نموذج إصابات الدماغ الرضية مناسب لتقييم امتداد النزف وشدة الالتهاب أمر بالغ الأهمية. يقدم هذا البروتوكول طريقة لتقليد إصابات الدماغ المخترقة ، والتي يشار إليها باسم نموذج فأر TBI الجرح طعنة ، لدراسة آليات النزيف والالتهاب وفقدان الخلايا العصبية المرتبطة بأمراض إصابات الدماغ الرضية. يتم إنشاء هذا النموذج عن طريق ثقب الجمجمة والدماغ بالإبر وهو سهل التنفيذ دون الحاجة إلى معدات تجريبية متخصصة. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الإصابة الطفيفة التي لحقت بالقشرة الدماغية للفأر باستخدام إبرة لا تؤثر على سلوك بعد الجراحة. تسمح هذه الميزة للباحثين بدراسة الآثار الموضعية لإصابات الدماغ دون القلق بشأن العواقب السلوكية الأوسع. توضح بيانات العينة من القشرة الدماغية للفأر المصاب بطعنات فعالية النموذج في تقييم تسرب الدم إلى الحمة ، والتنشيط الدبقي ، وإنتاج السيتوكين الالتهابي. علاوة على ذلك ، يسهل هذا البروتوكول تقييم مواد تخثر الدم والمركبات المضادة للالتهابات ، مما يساعد في تطوير عوامل علاجية لإصابات الدماغ الرضية.

Introduction

تحدث إصابات الدماغ الرضحية (TBI) بسبب الأضرار الجسدية ، وغالبا ما تنتج عن الحوادث ، بما في ذلك حوادث المرور وحوادث السقوط. يصنف إصابات الدماغ الرضية إلى نوعين: إصابة الدماغ المخترقة ، والتي تحدث عندما يثقب جسم حاد الجمجمة وكذلك الدماغ ، وإصابة الدماغ المغلقة ، والتي تحدث بسبب اهتزاز عنيف للدماغ من الداخل دون كسر في الجمجمة1.

أسباب إصابات الدماغ الرضية متنوعة للغاية ، بما في ذلك الارتجاج والكدمات الدماغية والأورام الدموية وكسور الجمجمة. لذلك ، تم تطوير نماذج فأر TBI باستخدام بروتوكولات مختلفة لتكرار هذه الأسباب المختلفة. على سبيل المثال ، يتضمن نموذج إصابات الدماغ الرضية الارتجاجي المتكرر اهتزاز الدماغ ، حيث تعلق الفئران عدة مرات باستخدام مصطاد مطاطي يتم التحكم فيهكهرومغناطيسيا 2. بالإضافة إلى ذلك ، في نموذج TBI لخفض الوزن ، يتم ممارسة قوة خارجية قوية على الرأس بواسطة جهاز قياسي لإنزال الوزن ، مما يتسبب في إصابة حادة بؤرية بجمجمةسليمة 3. علاوة على ذلك ، يتم إعداد نموذج إصابات الدماغ الرضية عن طريق ثقب الجمجمة والدماغ باستخدام إبرة4 (الشكل 1 أ). نظرا لأنه تم تطوير العديد من نماذج TBI ، فمن المهم اختيار نموذج يعتمد على علم الأمراض المحدد الذي يجب ملاحظته.

تؤدي إصابة الدماغ الناجمة عن الضرر الجسدي إلى إصابات الدماغ الأولية والثانوية ، مما يؤدي إلى تفاقم فقدان الخلايا العصبية. تحدث الإصابة الأولية مباشرة بعد الضرر ، الناتجة عن انهيار الحاجز الدموي الدماغي (BBB) والنزيف والورم الدموي. لذلك ، يعد تقليل النزيف وتوسع الورم الدموي أمرا بالغ الأهمية ، حيث يمكن أن تؤدي هذه العوامل إلى تفاقم شدة أعراض إصابات الدماغ الرضية. تحدث الإصابة الثانوية بسبب مكونات الدم داخل المتني ، والتي تؤدي لاحقا إلى التهاب حول الآفة5. يعتمد التشخيص بعد إصابة الدماغ على الديناميكيات الالتهابية. لذلك ، من الأهمية بمكان التخفيف بسرعة من الإصابات الأولية والثانوية من أجل تشخيص إيجابي6،7،8.

يتكون BBB من الخلايا الحضاقية ، والوصلات الضيقة بين الخلايا البطانية ، ونهاية الخلايا النجمية ، والتي تعمل معا لتقييد تسرب المواد من الأوعية الدموية في الأدمغة السليمة9. في نظام الطعن المعروض ، يتعطل BBB جسديا. تشمل الطرق الشائعة لتقييم سلامة BBB تلطيخ الغلوبولين المناعي G (IgG) وتقييم تسرب متتبعات التألق ، مثل Evans blue و dextran10،11. يضع تلطيخ IgG على ملصقات مكونات الدم التي تتسرب من موقع الآفة وتترسب في الدماغ. مع تعافي BBB ، ينخفض تسرب مكونات الدم إلى الدماغ ، وتتحلل هذه الرواسب تدريجيا. لذلك ، يتم استخدام تلطيخ IgG لتقييم مدى تعافي BBB بعد إصابة الدماغ. بالإضافة إلى ذلك ، فإن مستوى تسرب التتبع الذي يتم إعطاؤه عن طريق الوريد إلى حمة الدماغ يعكس تعافي BBB. توفر هذه الطريقة تقييما أوضح لديناميكيات BBB ، حيث يشير تسرب التتبع بشكل مباشر إلى انتقال مكونات الدم من مجرى الدم إلى حمة الدماغ. علاوة على ذلك ، يؤدي تقليل النزيف إلى إصابة أولية أكثر اعتدالا ، والتي يدعمها تخثر الدم الفوري وانحلال الفيبرين في الوقت المناسب. لذلك ، فإن تحديد التعبير عن منظمات تخثر الدم وتحلل الفيبرين هو طريقة فعالة لتحليل هذه العملية. فيما يتعلق بالآلية الجزيئية الكامنة وراء التخثر ، يتم إيقاف النزيف بعد إصابة الدماغ عن طريق تكوين الفيبرين. بعد ذلك ، تتحلل الجلطة الغنية بالفيبرين بواسطة منشط البلازمينوجين الأنسجيكي (tPA) ومنشط البلازمينوجين اليوروكيناز (uPA). في نموذج فأر TBI الرضي ، يبلغ تكوين الفيبرين ذروته في يوم واحد بعد الإصابة ويقل بعدذلك 10. وبالتالي ، يمكن التنبؤ بمستوى تعافي BBB عن طريق تحديد مكونات الدم وتسرب التتبع في حمة الدماغ ، بالإضافة إلى التعبير عن عوامل تخثر الدم.

تشمل طرق القياس الكمي للالتهاب في عملية الإصابة الثانوية التنشيط الدبقي والتعبير عن السيتوكين الالتهابي. يحدث الالتهاب المطول بشكل أساسي بسبب تراكم الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية المفرط حول موقع الآفة. على سبيل المثال ، في نموذج إصابات الدماغ الرضية بالطعن ، تحفز جروح الطعن إعادة تنشيط الخلايا الدبقية حول الآفة لإزالة بقايا الخلية ومكونات الدم. عادة ما تصل إعادة تنشيط الدبقي هذه إلى ذروتها بعد 3 أيام من جرح الطعن12،13. بالإضافة إلى وظيفة البلعمة ، تفرز الخلايا الدبقية المعاد تنشيطها السيتوكينات الالتهابية المفرطة ، مما يؤدي إلى فقدان الخلايا العصبية حول الآفة14. تم الإبلاغ عن أن توهين الالتهاب الدبقي يساهم في تشخيص إيجابي بعد إصابة الدماغ12،14. يعد تحديد مستوى الالتهاب مفيدا لتقييم شدة المرض والتشخيص. لذلك ، من الضروري تطوير نموذج إصابات الدماغ الرضية المناسب لتقييم امتداد النزيف وشدة الالتهابات. تقدم هذه الدراسة نموذجا للفأر الجرح الطعن الذي يحاكي إصابات الدماغ المخترقة ، بهدف دراسة آليات النزيف والالتهاب وفقدان الخلايا العصبية في أمراض إصابات الدماغ الرضية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات رعاية من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة أوتشانوميزو ، اليابان ، وتم تنفيذها وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها وزارة التعليم والعلوم والثقافة في اليابان. تم استخدام إناث الفئران البالغة C57BL / 6J البالغة من العمر ستة أسابيع (20-25 جم). تم تزويد جميع الفئران بإمكانية الوصول إلى الغذاء والماء في بيئة نظيفة. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. جراحة الطعن الجرح في القشرة الدماغية

  1. تحضير الكواشف
    ملاحظة: يشبه بروتوكول التخدير ذلك الموصوف سابقا15. إذا أوصت منشأة بمخدر معين ، فيرجى اتباع تعليماتهم. تم التأكيد سابقا على أن البنتوباربيتال الصوديوم فعال في جراحة الطعن في القشرة الدماغية4،13،16،17.
    1. التخدير المركب MMB: قم بإذابة 1.875 مل من 1 مجم / مل ميديتوميدين ، و 2.0 مل من 5 مجم / مل ميدازولام ، و 2.5 مل من 5 مجم / مل طرطرات بوتورفانول في 18.625 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لإنشاء حجم إجمالي قدره 25 مل. سيكون لهذا الخليط تركيز 75 مجم / لتر ميديتوميدين ، و 400 مجم / لتر ميدازولام ، و 500 مجم / لتر خليط طرطرات بوتورفانول. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 8 أسابيع قبل الاستخدام.
    2. مضاد التخدير: قم بإذابة 150 ميكرولتر من 5 مجم / مل من هيدروكلوريد أتيبامزول في 9.85 مل من PBS لإنشاء حجم إجمالي قدره 10 مل ، بتركيز 75 مجم / لتر من هيدروكلوريد أتيباميزول. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء ، لمدة تصل إلى 8 أسابيع قبل الاستخدام.
  2. إجراء الجراحة
    1. تخدير الفئران: تخدير الفئران مؤقتا باستخدام ورق مبلل بمحلول استنشاق الأيزوفلوران حتى تغفو. بعد ذلك ، قم بحقن 10 ميكرولتر / جم مخدر MMB داخل الصفاق باستخدام حقنة 1 مل بإبرة 27 جم × 3/4 بوصة. بعد 3-5 دقائق ، تأكد من فعالية التخدير عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم والتحقق من المنعكس الصحيح.
      ملاحظة: تأكد من الانتباه جيدا لعدم إعطاء جرعة زائدة من التخدير عند استخدام محلول استنشاق الأيزوفلوران.
    2. ضع الماوس على جانبه البطني في منشفة ورقية. بعد النقل ، أعد التأكد من أن الماوس لا يزال مخدرا بقرص إصبع القدم.
    3. حلق الفراء على جلد المنطقة القذالية. عقم الفراء الموجود على الجزء الخلفي من رأس الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول باستخدام قطعة قطن. أمسك الجلد القذالي بالملقط الحاد وقم بعمل شق بعرض 1.0-1.5 مم لكشف العظم القذالي دون الإضرار بالجمجمة أو أي عضو. افتح الشق برفق وببطء لمراقبة الحدود بين القشرة الدماغية والمخيخ من خلال الجمجمة (الشكل 1 ب).
      ملاحظة: تأكد من عدم حدوث أي ضرر للجمجمة أو الدماغ للفأر الخالي من الجرح.
    4. حج قحف الفأر: قم بعمل ثقب صغير في نصف الكرة الأيمن من العظم القذالي باستخدام إبرة 19 جم × 1 • 1/2 بوصة. قم بتدوير الإبرة برفق لعمل نقطة إدخال لإدخال الوخز بالإبر بالطعن ، مع الحرص على عدم إتلاف حمة الدماغ. يجب وضع الثقب على نقطة منتصف الخط بين الأذنين في نصف الكرة الأيمن بين لامدا والحافة (الشكل 1 ب). يعمل هذا الثقب كدليل لإدخال إبرة الطعن في الخطوة اللاحقة.
    5. طعنة الجرح: أدخل إبرة 27 جم × 3/4 بوصة من نقطة الإدخال وطعن القشرة الدماغية على طول المحور الذهبي (الشكل 1 ب ، ج). يتم إدخال الإبرة حتى تلامس الجزء الأمامي من الجمجمة ، ثم يتم سحبها برفق. العمق المناسب هو العمق الذي يمكن فيه رؤية الإبرة من خلال سطح القشرة الدماغية. يستخدم الجانب الأيسر من القشرة الدماغية كعنصر تحكم غير تالف.
    6. خياطة شق الجلد باستخدام خياطة نايلون 3-0 بإبرة دائرية 1/2.
    7. يتم إعطاء 10 ميكرولتر / غرام من مضاد التخدير داخل الصفاق كمخدر MMB مركب. يجب أن يكون الفأر قادرا على المشي في غضون 8-16 ساعة بعد حقن مضاد التخدير.

2. تقييم النزيف والتعافي من انهيار BBB

  1. تلطيخ إنزيمي مناعي لقسم الدماغ المصاب بطعنة لتسرب IgG للفأر
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام أقسام الدماغ المجمدة المثبتة على المنزلق. أقسام الدماغ المجمدة العائمة هي أيضا مناسبة لهذا البروتوكول.
    1. تخدير الفأر: قم بتحفيز التخدير عن طريق وضع الفأر بالقرب من ورق مبلل بمحلول استنشاق الأيزوفلوران حتى ينام. بعد ذلك، يتم تطبيق 100 ميكرولتر/كغ مخدر MMB المركب داخل الصفاق على الفور. تأكد من تأثير التخدير مع قرصة إصبع القدم وانعكاس التصحيح.
    2. ضع الماوس على ظهره وقم بتثبيت الذراعين والقدمين على لوحة التشريح.
    3. بضع الصدر بالفأر: أمسك جلد البطن باستخدام ملقط حاد وقم بعمل شق 1.0-1.5 سم عبر الجلد والصفاق لكشف القفص الصدري. افتح القفص الصدري بعناية بالمقص مع تجنب تلف القلب لتعريضه لتروية القلب.
    4. تثبيت التروية القلبية: قم بإعداد مضخة التروية التمعجية وقم بتوصيل أنبوب بإبرة 19 جم × 1 • 1/2 بوصة في أحد طرفيها. املأ الأنبوب ب PBS عن طريق تشغيل المضخة قبل الاستخدام. بعد ذلك ، أثناء تشغيل المضخة ، أدخل طرف الإبرة في البطين الأيسر وثبته بالملقط. قم بعمل شق 0.5-1.0 مم في الأذين الأيمن. قم بنشر الماوس18 بمعدل 4-6 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق مع 20 مل على الأقل من PBS لإزالة الدم.
    5. أوقف المضخة وانقل الأنبوب إلى محلول 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في PBS. أعد تشغيل المضخة بمعدل 4-6 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق مع 20 مل على الأقل من 4٪ PFA في PBS للتثبيت18.
      ملاحظة: إذا لم تكن المضخة متوفرة ، فمن الممكن أيضا استخدام حقنة سعة 50 مل بإبرة 19 جم × 1 • 1/2 بوصة للنضح.
    6. تشريح الدماغ: ضع الفأر على جانبه البطني على لوح التشريح وكشف الجمجمة عن طريق عمل شق عبر خط الوسط للجلد من المنطقة القذالية إلى الأنف. كشف الدماغ بعناية تماما عن طريق إزالة الجمجمة بالمقص ، مع الحرص على عدم إتلاف الدماغ. ارفع الدماغ بالملقط المنحني وانقله إلى أنبوب سعة 15 مل مملوء ب 10 مل من 4٪ PFA في PBS.
    7. احتضان الدماغ المقطوع بين عشية وضحاها في 4٪ PFA في PBS عند 4 درجات مئوية للتثبيت الكامل. بعد ذلك ، احتضان الدماغ طوال الليل في 10 مل من السكروز بنسبة 15٪ في PBS ونقله إلى 10 مل من السكروز بنسبة 30٪ في PBS ليوم إضافي على شاكر الأرجوحة. يساعد هذا البديل التدريجي للسكروز على منع تلف الأنسجة من الجليد عندما يتم تخزين الدماغ لاحقا في الفريزر.
    8. تضمين الدماغ: قم بتضمين الدماغ في وسط تضمين داخل قالب تضمين الأنسجة ثم قم بتجميده باستخدام 2-ميثيل بوتان مع الثلج الجاف19.
    9. أقسام الدماغ المجمدة: باستخدام ناظم التبريد ، قم بتركيب أقسام إكليلية تسلسلية (بسمك 20 ميكرومتر) من الدماغ المدمج على زجاج منزلق موجب الشحنة. يتم تجفيف أقسام الدماغ بالهواء تماما في درجة حرارة الغرفة طوال الليل وتخزينها في فريزر -80 درجة مئوية.
    10. تحضير المخزن المؤقت للحظر: اخلطي 10٪ مصل العجل حديثي الولادة ، و 30 مجم / مل من الألبومين البقري ، و 10 مجم / مل جلايسين ، و 0.4٪ تريتون X-100 في TBS لإنشاء المخزن المؤقت للحظر. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين قبل الاستخدام.
    11. تلطيخ IgG للفأر: بعد تجفيف أقسام القشرة الدماغية المصابة بالطعن بالهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، قم بإصلاحها بعد ذلك ب 500 ميكرولتر من 4٪ PFA لكل شريحة لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل القسم باستخدام PBS (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق ، متبوعا بغسلتين بمحلول ملحي مخزن في Tris (TBS ، 500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
      ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الإجراءات في صندوق ترطيب لمنع المخازن المؤقتة من التبخر.
    12. قم بإخماد نشاط الإنزيم الداخلي في الأقسام التي تحتوي على 10٪ ميثانول و 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في TBS لمدة 5 دقائق ، متبوعا بغسلتين بمحلول ملحي مخزن في Tris (TBS ، 500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    13. قم بإجراء الحجب باستخدام مخزن مؤقت مانع (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد للجسم المضاد. بعد ذلك ، احتضان الأقسام بجسم مضاد IgG مترافق بالبيوتين (تخفيف 1: 300 مع المخزن المؤقت المانع ، 300 ميكرولتر / شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    14. أثناء الحضانة بالجسم المضاد IgG للفأر ، قم بإعداد خليط من 1 ميكرولتر من الكاشف A و 1 ميكرولتر من الكاشف B من مجموعة نظام البيروكسيديز القائم على أفيدين / البيوتين في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع. احتضن هذا الخليط لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام. بعد اكتمال حضانة الأجسام المضادة IgG للفأر ، اغسل الأقسام باستخدام TBS لمدة 5 دقائق ، ثلاث مرات. ثم احتضان الأقسام بالخليط المحضر من الكاشف A و B (300 ميكرولتر / شريحة) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    15. اغسل الأقسام بدرجة حموضة 0.1 M Tris-HCl 8.0 لمدة 5 دقائق ، ثلاث مرات ، على مدار 1 ساعة. بعد ذلك ، قم بتطوير اللون باستخدام 0.05٪ 3،3'-diaminobenzidine (DAB) في 0.05٪ بيروكسيد الهيدروجين المضاف 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق إلى 1 ساعة (الشكل 2 أ). راقب تحت المجهر لتغيير اللون قبل إيقاف التفاعل.
    16. اغسل الأقسام ب 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 لمدة 5 دقائق ثلاث مرات ، وجفف الأقسام بالهواء لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتجفيف الأقسام عن طريق غمرها في 95٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين مرتين ، متبوعا بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة دقيقتين ، مرتين. امسح الأقسام في الزيلين لمدة 5 دقائق مرتين. قم بتغطية الأقسام باستخدام وسيط تثبيت غير قابل للذوبان في الماء واتركها تجف.
    17. تحليل شدة تلطيخ IgG للفأر: التقط صورا للأقسام باستخدام مجهر بهدف 20x.
    18. باستخدام برنامج ImageJ ، قم بقياس كثافة التلوين عن طريق قياس متوسط القيم الرمادية في خمسة حقول مختارة عشوائيا (8 × 8 ميكرومتر2 لكل منها) من المناطق الملطخة بالإنزيم المناعي في كل قسم. تطبيع شدة التلوين باستخدام متوسط القيمة الرمادية من كل طرف مقابل ؛ لا توجد منطقة جريحة كتصحيح للخلفية. احسب متوسط متوسط القيم الرمادية الطبيعية من الحقول الخمسة لتحديد متوسط القيمة الرمادية لتلوين IgG بالماوس لكل قسم.
  2. تقييم تسرب إيفانز الأزرق إلى حمة الدماغ
    ملاحظة: يشبه بروتوكول إيفانز الأزرق الطريقة الموضحة سابقا11. يعمل ديكستران المسمى بالفلورسين إيزوثيوسيانات (FITC) أيضا على التعافي من انهيار BBB10.
    1. حقن إيفانز الأزرق: يعطى 2٪ إيفانز الأزرق في PBS (3 مل / كجم) للفأر المصاب بالطعن من خلال وريد الذيل قبل ساعة واحدة من التشريح.
    2. استخراج الدماغ الجديد: بعد ساعة واحدة من إدارة إيفانز الزرقاء ، قم بتدمير الفأر باستخدام PBS كما هو موضح في الخطوات 2.1.1-2.1.4. بعد ذلك ، قم بتشريح الدماغ الجديد وتقطيعه إلى أقسام بسمك 1 مم باستخدام قطاعة الدماغ. حدد أربع شرائح وقم بقص قطع الدماغ (1 مم2 مربع ، كل منها) التي تشمل منطقة الجرح أو المناطق السليمة في القشرة الدماغية الخالية من الجرح ، وفقا لورقة الرسم البياني (الشكل 1 د).
    3. القياس الكمي الأزرق لإيفانز: اجمع قطع الدماغ الأربع في أنبوب سعة 1.5 مل وقم بتجانسها ب 200 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك باستخدام مطحنة الأنسجة. جهاز الطرد المركزي المتجانس عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم اجمع المادة الطافية بماصة وقم بتخفيفها ب 600 ميكرولتر من الإيثانول. قم بإعداد منحنى قياسي من إيفانز الأزرق ، يتراوح من 0-1.0 نانوغرام / مل ، لتحديد تركيزه. قم بقياس شدة التألق عند 680 نانومتر بطول موجي للإثارة يبلغ 620 نانومتر باستخدام قارئ لوحة.

3. تقييم مستوى الالتهاب في الدماغ بعد الطعن

  1. تلطيخ أنزيمي مناعي لقسم الدماغ المصاب بطعنات للخلايا الدبقية
    1. تحضير أقسام الدماغ: اصنع نظارات منزلقة مثبتة على أقسام الدماغ كما هو موضح في الخطوات 2.1.1-2.1.9.
    2. تلطيخ الدبق: بعد تجفيف أقسام القشرة الدماغية المصابة بالطعن بالهواء لمدة ساعة واحدة ، قم بإصلاح الأقسام مرة أخرى باستخدام 4٪ PFA (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الأقسام باستخدام PBS (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق ، متبوعة بغسلتين باستخدام TBS (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    3. قم بإخماد نشاط الإنزيم الداخلي في الأقسام التي تحتوي على 10٪ ميثانول و 3٪ بيروكسيد الهيدروجين في TBS لمدة 5 دقائق ، متبوعا بغسلتين بمحلول ملحي مخزن في Tris (TBS ، 500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    4. قم بإجراء الحجب باستخدام مخزن مؤقت مانع (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد للجسم المضاد.
    5. احتضان الأقسام طوال الليل بالجسم المضاد الأساسي (300 ميكرولتر / شريحة). استخدم التخفيفات التالية للجسم المضاد الأساسي: تخفيف 1: 3,000 ل Iba1 ، و 1: 1,000 تخفيف ل GFAP ، مخفف في المخزن المؤقت للحظر.
    6. اغسل القسم ثلاث مرات باستخدام TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. بعد ذلك ، احتضن بالجسم المضاد الثانوي المترافق مع البيوتين (تخفيف 1: 300 مع المخزن المؤقت المانع ، 300 ميكرولتر / شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    7. أثناء الحضانة بالجسم المضاد الثانوي ، قم بإعداد خليط من 1 ميكرولتر من الكاشف A و 1 ميكرولتر من الكاشف B من مجموعة نظام البيروكسيديز القائم على أفيدين / البيوتين في 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانعب. ثم احتضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة قبل الاستخدام.
    8. بعد اكتمال حضانة الأجسام المضادة الثانوية ، اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام TBS لمدة 5 دقائق لكل منها ، واحتضن الأقسام بالخليط المحضر من الكاشف A و B (300 ميكرولتر / شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    9. اغسل الأقسام بدرجة حموضة 0.1 M Tris-HCl 8.0 لمدة 5 دقائق ، ثلاث مرات ، على مدار 1 ساعة. بعد ذلك ، قم بتطوير اللون باستخدام 0.05٪ DAB في 0.05٪ بيروكسيد الهيدروجين المضاف 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 30 دقيقة إلى 3 ساعات. راقب تحت المجهر لتغيير اللون قبل إيقاف التفاعل.
    10. اغسل الأقسام ب 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 لمدة 5 دقائق ثلاث مرات ، وجفف الأقسام بالهواء لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتجفيف الأقسام عن طريق غمرها في 95٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين مرتين ، متبوعا بالإيثانول بنسبة 100٪ لمدة دقيقتين ، مرتين. امسح الأقسام في الزيلين لمدة 5 دقائق مرتين. قم بتغطية الأقسام باستخدام وسيط تثبيت غير قابل للذوبان في الماء واتركها تجف. التقط صور القسم باستخدام المجهر بهدف 20x.
  2. تلطيخ الفلورسنت المناعي لقسم الدماغ المصاب بالطعن للخلايا الدبقية
    1. تحضير أقسام الدماغ: اصنع نظارات منزلقة مثبتة على أقسام الدماغ كما هو موضح في الخطوات 2.1.1-2.1.9.
    2. تلطيخ الدبق: بعد تجفيف أقسام القشرة الدماغية المصابة بالطعن بالهواء لمدة ساعة واحدة ، قم بإصلاح الأقسام مرة أخرى باستخدام 4٪ PFA (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، اغسل الأقسام باستخدام PBS (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق ، متبوعة بغسلتين باستخدام TBS (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق لكل منهما. قم بإجراء الحجب باستخدام مخزن مؤقت مانع (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة لمنع الارتباط غير المحدد للجسم المضاد.
    3. احتضان الأقسام طوال الليل بالجسم المضاد الأساسي (300 ميكرولتر / شريحة). استخدم التخفيفات التالية للجسم المضاد الأساسي: تخفيف 1: 3,000 ل Iba1 ، و 1: 1,000 تخفيف ل GFAP ، مخفف في المخزن المؤقت المانع.
    4. اغسل القسم ثلاث مرات باستخدام TBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. بعد ذلك ، احتضن الجسم المضاد الثانوي المترافق بالفلورسنت (تخفيف 1: 300 مع المخزن المؤقت المانع ، 300 ميكرولتر / شريحة) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    5. اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام TBS لمدة 5 دقائق لكل منها واحتضان الأقسام بمحلول DAPI 0.4 ميكروغرام / مل في TBS (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. اغسل الأقسام ب TBS (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق ، وبالماء المقطر (500 ميكرولتر / شريحة) لمدة 5 دقائق. بعد تجفيف الأقسام بالهواء لمدة 15 دقيقة ، قم بتغطيتها بوسط تثبيت مائي واتركها حتى تجف. التقط صور القسم باستخدام مجهر متحد البؤر بهدف 20x.
  3. qPCR في الوقت الحقيقي لعلامات الخلايا الدبقية والسيتوكينات الالتهابية
    ملاحظة: يتم سرد التسلسلات التمهيدية16،20،21،22 المستخدمة في البروتوكول المقدم في الجدول 1.
    1. تحضير أنسجة المخ الطازجة: قم بتنقية الفأر باستخدام PBS كما هو موضح في الخطوات 2.1.1-2.1.4. بعد ذلك ، قم باستخراج الدماغ الطازج وتقطيعه إلى أقسام بسمك 1 مم باستخدام قطاعة الدماغ. حدد أربع شرائح وقطع قطع الدماغ (1 مم2 مربع ، كل منها) التي تشمل منطقة الطعن أو المناطق السليمة على الجانب المقابل للقشرة الدماغية ، وفقا لورقة الرسم البياني. حدد المنطقة المراد قطعها ، والتي تشمل الآفة في المركز (الشكل 1 د).
    2. استخراج الحمض النووي الريبي: اجمع قطع الدماغ الأربع في أنبوب سعة 1.5 مل وقم بتجانسها ب 1 مل من كاشف TRIzol عن طريق سحب العينات. احتضن الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم ، ودوامة جيدا ، واحتضن لمدة دقيقتين إضافيتين في درجة حرارة الغرفة. الطرد المركزي الخليط عند 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل الطبقة العلوية الشفافة بعناية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل ، وتجنب أي رواسب بيضاء تحتوي على الحمض النووي والبروتينات.
    3. أضف 500 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى الطبقة العليا المجمعة ، واخلطها جيدا ، واحتضانها لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية وأضف 1 مل من 70٪ من الإيثانول لغسل حبيبات الحمض النووي الريبي. جهاز طرد مركزي عند 7,500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية تماما ، وجفف الحبيبات في الهواء لمدة 10 دقائق. قم بإذابة حبيبات الحمض النووي الريبي في 15 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase وقم بتغيير طبيعة الحمض النووي الريبي لمدة 10 دقائق عند 55 درجة مئوية.
    4. قم بقياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير. قم بتخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية على الفور.
    5. تخليق (كدنا): لتخليق (كدنا) ، استخدم مجموعة تركيب الحمض النووي المتاحة تجاريا. قم بإعداد ما مجموعه 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتفاعل في أنبوب 1.5 ميكرولتر لكل عينة ، والذي يتضمن 2 ميكرولتر من 5 × RT Buffer ، و 0.5 ميكرولتر من مزيج إنزيم RT ، و 0.5 ميكرولتر من مزيج التمهيدي ، و 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ، والماء الخالي من النوكلياز. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتفاعل النسخ العكسي وعند 98 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتفاعل تعطيل الإنزيم. ثم أضف 90 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى المخزن المؤقت واخلطه جيدا. قم بتخزين محلول (كدنا) عند -20 درجة مئوية.
    6. القياس الكمي لتعبير الحمض النووي الريبي: لتحليل qPCR في الوقت الفعلي ، استخدم مجموعة مزيج qPCR الرئيسية المتوفرة تجاريا. قم بإعداد محلول المزيج لكل عينة عن طريق الجمع بين 5 ميكرولتر من KOD SYBR qPCR Mix ، و 0.4 ميكرولتر من 5 ميكرومتر أولي أمامي ، و 0.4 ميكرولتر من 5 ميكرومتر برايمر عكسي ، و 0.2 ميكرولتر من 50 × ROX في 2 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
    7. اصنع مزيجا من 2 ميكرولتر من محلول (كدنا) و 8 ميكرولتر من محلول الخلط في أنبوب مكون من 8 شرائط ، واخلطه جيدا ، ثم قم بتدويره.
    8. ابدأ تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل بظروف التدوير التالية: 98 درجة مئوية لمدة دقيقتين ، متبوعة ب 40 دورة من 98 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 60 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 68 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. قم بإجراء خطوة تحليل منحنى الذوبان / التفكك باستخدام جهاز qPCR في الوقت الفعلي.
    9. تحليل تعبير الرنا المرسال: قم بتحليل مستوى تعبير الرنا المرسال باستخدام طريقة 2-Delta-Delta-Ct ، والتي يتم إجراؤها عن طريق التطبيع باستخدام جين التدبير المنزلي ، Gap ، ثم مع الجانب المقابل23.

النتائج

لتحليل التعافي من انهيار BBB ، تم تقييم مستوى النزيف في القشرة الدماغية المصابة بالطعن عن طريق قياس مستوى تسرب IgG في المصل في 1 و 3 و 5 و 7 أيام بعد إصابة الدماغ. كشفت صور تلطيخ IgG للفأر عن تسرب الدم وترسب في القشرة الدماغية بعد إصابة الدماغ. تم تقليل هذا بعد أكثر من 7 أيام ، حيث ت...

Discussion

هنا ، تم تقديم بروتوكول لإنشاء نموذج ماوس TBI باستخدام الإبر. يسمح هذا البروتوكول بإجراء تقييم كمي للتعافي من انهيار BBB والالتهاب بعد إصابة الدماغ باستخدام الأساليب البيولوجية النسيجية والجزيئية. يمكن أيضا استخدام البروتوكولات البديلة ، مثل نموذج إصابات الدماغ الرضية ا?...

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

نشكر أيانا هامانو ومينوري ياماشيتا وميساكي إندو وهيرونو كوباياشي ونيتو ناكاهيرا للمساعدة في الكيمياء المناعية وتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. تم دعم هذا العمل من قبل JSPS KAKENHI 19K16122 ، ومؤسسة تاكيدا للعلوم ، ومؤسسة Astellas لأبحاث اضطرابات التمثيل الغذائي ، ومؤسسة Mitsubishi ، ومؤسسة علوم الدماغ ، ومؤسسة Uehara Memorial Foundation إلى KH.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
19 G x 1•1/2" needleTERUMONN-1938R 
27 G x 3/4" needleTERUMONN-2719S
anti-GFAP antibodySigma-AldrichG9269
anti-Iba1 antibodyWako019-19741
Atipamezole HydrochlorideNippon Zenyaku KogyoProduct name: Antisedan
Biotin-conjugated mouse IgG antibodyVector LaboratoriesBA-9200
Biotin-conjugated rabbit IgG antibodyVector LaboratoriesBA-1000
Bovine albuminNacalai tesque01860-07
Brain SlicerVisikolBSLM-2
Butorphanol TartrateMeiji Animal HealthProduct name: Vetorphale 5 mg
Confocal microscopeZeissLSM700
Cryostat LeicaCM1520
DABSigma-AldrichD5637-1G
DAPIRoche10236276001
Evans blueWako056-04061
Fluorescent-conjugated rabbit IgG antibodyInvitrogenA-21206
Fluoromount-GInvitrogen4958-02Water-based mounting medium
Isoflurane Inhalation SolutionViatrisv002139
KOD SYBR qPCR MixTOYOBOQKD-201qPCR master mix kit
MedetomidineNippon Zenyaku KogyoProduct name: Domitor
MicroscopeOlympusFSX100
Microvolume spectrophotometerThermoFisher ScientificNanoDrop One
Midazolam 10 mg/2 mLSandoz1124401A1060
MOUNT QUICKDaido SangyoDM01Water insoluble mounting medium
Newborn calf serumGibco16010159
O.C.T. compoundSakura Finetek Japan45833Embedding medium
Peel-A-Way, Truncated 22 mm Square TopTed Pella27118Tissue embedding mold
Peristaltic perfusion pumpATTOSJ-1211
Plate readerFisher ScientificCytation 3
Real-time qPCR machineThermoFisher ScientificStepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101cDNA synthesis kit
Superfrost Plus Slide GlassFisher Scientific12-550-15Positive-charged slide glass
Suture with needle AlfresaHT2003NA75-KF2
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
VECTASTAIN ABC Standard KitVector LaboratoriesPK-4000Avidin/biotin-based peroxidase system kit

References

  1. Narayan, R. K., et al. Clinical trials in head injury. J Neurotrauma. 19 (5), 503-557 (2002).
  2. Shitaka, Y., et al. Repetitive closed-skull traumatic brain injury in mice causes persistent multifocal axonal injury and microglial reactivity. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (7), 551-567 (2011).
  3. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  4. Ikeshima-Kataoka, H., Shen, J. S., Eto, Y., Saito, S., Yuasa, S. Alteration of inflammatory cytokine production in the injured central nervous system of tenascin-deficient mice. In Vivo. 22 (4), 409-413 (2008).
  5. Zhou, Y., Wang, Y., Wang, J., Anne Stetler, R., Yang, Q. W. Inflammation in intracerebral hemorrhage: From mechanisms to clinical translation. Prog Neurobiol. 115, 25-44 (2014).
  6. Hijazi, N., et al. Endogenous plasminogen activators mediate progressive intracerebral hemorrhage after traumatic brain injury in mice. Blood. 125 (16), 2558-2567 (2015).
  7. Kataoka, K., et al. Roles of urokinase-type plasminogen activator in a brain stab-wound. Brain Res. 887 (1), 187-190 (2000).
  8. Wang, Y., et al. Early posttraumatic csf1r inhibition via plx3397 leads to time- and sex-dependent effects on inflammation and neuronal maintenance after traumatic brain injury in mice. Brain Behav Immun. 106, 49-66 (2022).
  9. Kaplan, L., Chow, B. W., Gu, C. Neuronal regulation of the blood-brain barrier and neurovascular coupling. Nat Rev Neurosci. 21 (8), 416-432 (2020).
  10. Endo, M., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid regulates blood coagulation and fibrinolysis system for repair after brain injury. Brain Res. 1818, 148511 (2023).
  11. Goldim, M. P. S., Della Giustina, A., Petronilho, F. Using Evans blue dye to determine blood-brain barrier integrity in rodents. Curr Protoc Immunol. 126 (1), e83 (2019).
  12. Hashimoto, K., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid suppresses inflammation via regulation of microglial polarization in the stab-wounded mouse cerebral cortex. Sci Rep. 8 (1), 9715 (2018).
  13. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Yasui, M. Aquaporin 4-dependent expression of glial fibrillary acidic protein and tenascin-c in activated astrocytes in stab-wound mouse brain and in primary culture. J Neurosci Res. 93 (1), 121-129 (2015).
  14. Nakashima, M., et al. The neuroprotective function of 2-carba-cyclic phosphatidic acid: Implications for tenascin-c via astrocytes in traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 361, 577749 (2021).
  15. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  16. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Abe, T., Yasui, M. Immunological function of aquaporin-4 in stab-wounded mouse brain in concert with a pro-inflammatory cytokine inducer, osteopontin. Mol Cell Neurosci. 56, 65-75 (2013).
  17. Ikeshima-Kataoka, H., Yasui, M. Correlation between astrocyte activity and recovery from blood-brain barrier breakdown caused by brain injury. Neuroreport. 27 (12), 894-900 (2016).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Botta, S., Chemiakine, A., Gennarino, V. A. Dual antibody strategy for high-resolution imaging of murine Purkinje cells and their dendrites across multiple layers. STAR Protoc. 3 (2), 101427 (2022).
  20. Amin, D. N., et al. Identification of stage biomarkers for human African trypanosomiasis. Am J Trop Med Hyg. 82 (6), 983-990 (2010).
  21. Jiang, J., et al. Therapeutic window for cyclooxygenase-2 related anti-inflammatory therapy after status epilepticus. Neurobiol Dis. 76, 126-136 (2015).
  22. Wei, J., et al. Microglia activation: One of the checkpoints in the CNS inflammation caused by angiostrongylus cantonensis infection in rodent model. Parasitol Res. 114 (9), 3247-3254 (2015).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2(-delta delta c(t)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Hazy, A., et al. Divergent age-dependent peripheral immune transcriptomic profile following traumatic brain injury. Sci Rep. 9 (1), 8564 (2019).
  25. Xia, Y., et al. Osthole confers neuroprotection against cortical stab-wound injury and attenuates secondary brain injury. J Neuroinflammation. 12, 155 (2015).
  26. Cieri, M. B., Villarreal, A., Gomez-Cuautle, D. D., Mailing, I., Ramos, A. J. Progression of reactive gliosis and astroglial phenotypic changes following stab-wound-induced traumatic brain injury in mice. J Neurochem. 167 (2), 183-203 (2023).
  27. Barreda-Manso, M. A., Yanguas-Casas, N., Nieto-Sampedro, M., Romero-Ramirez, L. Neuroprotection and blood-brain barrier restoration by salubrinal after a cortical stab injury. J Cell Physiol. 232 (6), 1501-1510 (2017).
  28. Rapp, P. E., et al. Patient characterization protocols for psychophysiological studies of traumatic brain injury and post-TBI psychiatric disorders. Front Neurol. 4, 91 (2013).
  29. Brody, D. L., Benetatos, J., Bennett, R. E., Klemenhagen, K. C., Mac Donald, C. L. The pathophysiology of repetitive concussive traumatic brain injury in experimental models; new developments and open questions. Mol Cell Neurosci. 66 (Pt B), 91-98 (2015).
  30. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing recovery time between injuries improves cognitive outcome after repetitive mild concussive brain injuries in mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-891 (2012).
  31. Chen, C., et al. A novel simple traumatic brain injury mouse model. Chin Neurosurg J. 8 (1), 8 (2022).
  32. Machado, C. A., et al. Weight-drop model as a valuable tool to study potential neurobiological processes underlying behavioral and cognitive changes secondary to mild traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 385, 578242 (2023).
  33. Hashimoto, K., Ikeda, N., Nakashima, M., Ikeshima-Kataoka, H., Miyamoto, Y. Vitronectin regulates the fibrinolytic system during the repair of cerebral cortex in stab-wounded mice. J Neurotrauma. 34 (22), 3183-3191 (2017).
  34. Unterberg, A. W., Stover, J., Kress, B., Kiening, K. L. Edema and brain trauma. Neuroscience. 129 (4), 1021-1029 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved