JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Упрощенные модели черепно-мозговой травмы (ЧМТ) способствовали разработке терапевтических подходов. Этот протокол описывает создание коры головного мозга мыши с ножевыми ранениями с помощью игл, что позволяет анализировать кровотечение и воспаление. Модель мыши TBI с ножевым ранением имеет преимущество, заключающееся в том, что она не требует специального оборудования.

Аннотация

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) возникает в результате физических повреждений, часто вызванных несчастными случаями или спортивными инцидентами. Причины ЧМТ разнообразны, включая сотрясения мозга, ушибы головного мозга, гематомы и переломы черепа. Чтобы воспроизвести эти различные причины, были разработаны различные модели мышей с ЧМТ с использованием различных протоколов. Физическая травма головного мозга приводит как к первичным, так и к вторичным повреждениям головного мозга, которые усугубляют потерю нейронов. Первичная травма возникает сразу после повреждения, часто из-за кровоизлияния, и впоследствии провоцирует вторичные повреждения, включая воспаление вокруг поражения. Поэтому разработка модели ЧМТ, подходящей для оценки расширения кровоизлияния и тяжести воспаления, имеет решающее значение. Этот протокол представляет метод имитации проникающей черепно-мозговой травмы, называемый мышиной моделью ЧМТ с ножевым ранением, для изучения механизмов кровоизлияния, воспаления и потери нейронов, связанных с патологией ЧМТ. Эта модель создается путем прокола черепа и мозга иглами и проста в выполнении без необходимости использования специализированного экспериментального оборудования. Кроме того, незначительная травма, нанесенная коре головного мозга мыши иглой, не влияет на поведение животного после операции. Эта особенность позволяет исследователям изучать локализованные последствия черепно-мозговой травмы, не беспокоясь о более широких поведенческих последствиях. Данные образцов из коры головного мозга мышей, раненых ножом, демонстрируют эффективность модели в оценке утечки крови в паренхиму, активации глии и воспалительной продукции цитокинов. Кроме того, этот протокол облегчает оценку коагулянтов крови и противовоспалительных соединений, помогая в разработке терапевтических агентов для ЧМТ.

Введение

Черепно-мозговая травма (ЧМТ) возникает в результате физических повреждений, часто возникающих в результате несчастных случаев, включая дорожно-транспортные происшествия и несчастные случаи при падении. ЧМТ классифицируется на два типа: проникающая черепно-мозговая травма, которая возникает, когда острый предмет проделывает череп, а также мозг, и закрытая черепно-мозговая травма, которая вызвана сильным сотрясением мозга внутри без перелома черепа.

Причины ЧМТ очень разнообразны, включая сотрясения мозга, ушибы головного мозга, гематомы и переломы черепа; Поэтому мышиные модели ЧМТ были разработаны с использованием различных протоколов для воспроизведения этих различных причин. Например, повторяющаяся модель сотрясения мозга включает в себя сотрясение мозга, при котором мыши застревают несколько раз с помощью электромагнитно управляемого резинового импактора2. Кроме того, в модели ЧМТ с падением веса на голову с помощью стандартизированного устройства для сброса веса действует сильная внешняя сила, вызывающая очаговую тупую травму с неповрежденнымчерепом. Кроме того, модель ЧМТ с ножевым ранением получают путем прокола черепа и мозга с помощью иглы4 (рисунок 1А). Поскольку было разработано несколько моделей ЧМТ, важно выбрать модель, исходя из конкретной патологии, которую необходимо наблюдать.

Черепно-мозговая травма, вызванная физическим повреждением, приводит к первичным и вторичным повреждениям головного мозга, которые еще больше усугубляют потерю нейронов. Первичная травма возникает сразу после повреждения в результате разрушения гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), кровоизлияния и гематомы. Таким образом, минимизация кровотечения и расширения гематомы имеет решающее значение, так как эти факторы могут усугубить тяжесть симптомов ЧМТ. Вторичное повреждение провоцируется внутрипаренхиматозными компонентами крови, что впоследствии приводит к воспалению вокруг очагапоражения5. Прогноз после черепно-мозговой травмы зависит от динамики воспаления; Поэтому крайне важно быстро смягчить как первичные, так и вторичные травмы для благоприятного прогноза 6,7,8.

ГЭБ состоит из перицитов, плотных соединений между эндотелиальными клетками, и концевых ступней астроцитов, которые работают вместе, ограничивая утечку веществ из кровеносных сосудов в здоровоммозге. В представленной системе с ножевыми ранениями ГЭБ физически нарушен. Общие методы оценки целостности ГЭБ включают окрашивание на иммуноглобулин G (IgG) и оценку утечки флуоресцентных индикаторов, таких как синий Эванса и декстран10,11. Окрашивание IgG помечает компоненты крови, которые вытекают из места поражения и откладываются в мозге. По мере восстановления ГЭБ утечка компонентов крови в мозг уменьшается, и эти отложения постепенно разрушаются. Поэтому окрашивание IgG используется для оценки степени восстановления ГЭБ после черепно-мозговой травмы. Кроме того, уровень утечки внутривенно вводимого индикатора в паренхиму мозга отражает восстановление ГЭБ. Этот метод обеспечивает более четкую оценку динамики ГЭБ, так как утечка индикатора напрямую указывает на переход компонентов крови из кровотока в паренхиму мозга. Кроме того, минимизация кровоизлияния приводит к более легкому первичному повреждению, которое поддерживается быстрым свертыванием крови и своевременным фибринолизом. Таким образом, количественная оценка экспрессии регуляторов свертываемости крови и фибринолиза является эффективным способом анализа этого процесса. Что касается молекулярного механизма, лежащего в основе коагуляции, кровоизлияние после черепно-мозговой травмы останавливается образованием фибрина. Впоследствии богатый фибрином тромб разрушается тканевым активатором плазминогена (tPA) и активатором плазминогена (uPA) урокиназы. В мышиной модели с ножевым ранением и ЧМТ образование фибрина достигает пика на 1 день после травмы и снижается через10 дней. Таким образом, уровень восстановления ГЭБ можно предсказать путем количественной оценки компонентов крови и экстравазации индикаторов в паренхиму мозга, а также экспрессии факторов свертывания крови.

Методы количественной оценки воспаления в процессе вторичного повреждения включают глиальную активацию и экспрессию воспалительных цитокинов. Длительное воспаление в основном вызвано чрезмерным накоплением микроглии и астроцитов вокруг места поражения. Например, в модели ЧМТ с ножевыми ранениями ножевые раны стимулируют реактивацию глиальных клеток вокруг поражения для удаления клеточных остатков и компонентов крови. Эта глиальная реактивация обычно достигает пика через 3 дня после колотого ранения12,13. В дополнение к функции фагоцитоза, реактивированные глиальные клетки выделяют чрезмерное количество воспалительных цитокинов, что приводит к потере нейронов вокругпоражения. Сообщалось, что ослабление глиального воспаления способствует благоприятному прогнозу после черепно-мозговой травмы12,14. Определение уровня воспаления полезно для оценки тяжести и прогноза. Поэтому важно разработать модель ЧМТ, подходящую для оценки распространения кровоизлияния и тяжести воспаления. В этом исследовании представлена мышиная модель с ножевым ранением, которая имитирует проникающую черепно-мозговую травму, с целью изучения механизмов кровоизлияния, воспаления и потери нейронов при патологии ЧМТ.

протокол

Все протоколы по уходу за животными были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Отяномидзу, Япония, и выполнялись в соответствии с руководящими принципами, установленными Министерством образования, науки и культуры Японии. Использовали шестинедельных взрослых самок мышей C57BL/6J (20-25 г). Всем мышам был предоставлен свободный доступ к пище и воде в чистой окружающей среде. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Хирургия ножевых ранений коры головного мозга

  1. Приготовление реагентов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол анестезии аналогичен описанному ранее15. Если учреждение для животных рекомендует определенный анестетик, следуйте их инструкциям. Ранее было подтверждено, что пентобарбитал натрия эффективен при хирургии колотых ран в коре головного мозга 4,13,16,17.
    1. Комбинированный анестетик MMB: растворите 1,875 мл 1 мг/мл медетомидина, 2,0 мл 5 мг/мл мидазолама и 2,5 мл 5 мг/мл тартрата буторфанола в 18,625 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) для получения общего объема 25 мл. Эта смесь будет иметь концентрацию медетомидина 75 мг/л, мидазолама 400 мг/л и смесь тартрата буторфанола 500 мг/л. Хранить при температуре 4 °C до 8 недель перед использованием.
    2. Антагонист анестезии: Растворите 150 мкл 5 мг/мл атипамезола гидрохлорида в 9,85 мл PBS для получения общего объема 10 мл, с концентрацией 75 мг/л атипамезола гидрохлорида. Хранить при температуре 4 °C в защищенном от света месте до 8 недель до использования.
  2. Процедура операции
    1. Мышиная анестезия: временно обезболите мышей с помощью бумаги, смоченной в растворе изофлурана, до тех пор, пока они не заснут. Затем введите комбинированный анестетик MMB 10 мкл/г внутрибрюшинно с помощью шприца объемом 1 мл с иглой 27 г x 3/4 дюйма. Через 3-5 мин подтвердите эффективность анестезии, выполнив щипывание пальцев ног и проверив выпрямляющий рефлекс.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте внимательны, чтобы не дать передозировку анестезии при использовании ингаляционного раствора изофлурана.
    2. Положите мышь на брюшную сторону в бумажное полотенце. После переноса подтвердите, что мышь все еще находится под наркозом, ущипнув палец ноги.
    3. Сбрейте шерсть на коже затылочной области. Простерилизуйте шерсть на затылке мыши с помощью 70% этанола с помощью ватного тампона. Захватите затылочную кожу тупыми щипцами и сделайте разрез шириной 1,0-1,5 мм, чтобы обнажить затылочную кость, не повреждая череп или какой-либо другой орган. Осторожно и медленно откройте разрез, чтобы увидеть границу между корой головного мозга и мозжечком через череп (рисунок 1B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что череп или мозг не повреждены мышью без ран.
    4. Трепанация черепа мыши: Создайте небольшое отверстие в правом полушарии затылочной кости с помощью иглы размером 19 г x 1•1/2 дюйма. Осторожно поверните иглу, чтобы образовалась точка введения для иглоукалывания колотой раны, стараясь не повредить паренхиму мозга. Отверстие должно быть расположено в средней точке межушной линии правого полушария между лямбдой и краем (рис. 1B). Это отверстие служит ориентиром для введения иглы с колотой на последующем этапе.
    5. Колотая рана: Введите иглу размером 27 G x 3/4 дюйма от точки введения и проколите кору головного мозга вдоль рострокаудальной оси (рис. 1B, C). Игла вводится до тех пор, пока она не соприкоснется с передней частью черепа, затем аккуратно извлекается. Подходящая глубина — это та, на которой игла видна через поверхность коры головного мозга. Левая сторона коры головного мозга используется в качестве неповрежденного контроля.
    6. Зашиваем разрез кожи с помощью нейлонового шва 3-0 с иглой 1/2 круглой.
    7. Вводите 10 мкл/г антагониста анестезии внутрибрюшинно в качестве комбинированного анестетика MMB. Мышь должна быть в состоянии ходить в течение 8-16 ч после введения антагониста анестезии.

2. Оценка кровоизлияния и восстановление после распада ГЭБ

  1. Иммуноферментативное окрашивание участка мозга с ножевым ранением на предмет утечки IgG у мышей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь были использованы срезы замороженного мозга, установленные на предметном стекле. Свободно плавающие замороженные участки мозга также подходят для этого протокола.
    1. Мышиная анестезия: Вызовите анестезию, поместив мышь рядом с бумагой, смоченной в растворе изофлурана, до тех пор, пока она не заснет. Затем немедленно введите 100 μл/кг комбинированного анестетика MMB внутрибрюшинно. Подтвердите действие анестезии щипцом ноги и выпрямляющим рефлексом.
    2. Положите мышь на заднюю часть и прикрепите обе руки и ноги к доске для вскрытия.
    3. Торакотомия мыши: Захватите кожу живота с помощью тупых щипцов и сделайте разрез на 1,0-1,5 см через кожу и брюшину, чтобы обнажить грудную клетку. Осторожно вскройте грудную клетку ножницами, избегая при этом повреждения сердца, чтобы подвергнуть его сердечной перфузии.
    4. Фиксация сердечной перфузии: Подготовьте перистальтический перфузионный насос и прикрепите трубку с иглой 19 г x 1 • 1/2 дюйма на одном конце. Заполните трубку PBS, включив насос перед использованием. Затем, во время работы насоса, введите кончик иглы в левый желудочек и закрепите его щипцами. Сделайте разрез 0,5-1,0 мм в правом предсердии. Перфузируйте мышь18 со скоростью 4-6 мл/мин в течение 5 мин не менее чем 20 мл PBS для удаления крови.
    5. Остановите насос и переведите трубку в раствор 4% параформальдегида (PFA) в PBS. Перезапустите насос со скоростью 4-6 мл/мин в течение 5 мин с концентрацией не менее 20 мл 4% PFA в PBS для фиксации18.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если насос недоступен, также можно использовать шприц объемом 50 мл с иглой 19 г x 1•1/2 дюйма для перфузии.
    6. Вскрытие мозга: Поместите мышь на вентральную сторону на доске для вскрытия и обнажите череп, сделав разрез по средней линии кожи от затылочной области до носа. Осторожно полностью обнажите мозг, удалив череп ножницами, стараясь не повредить мозг. Подтяните мозг с помощью изогнутых щипцов и перенесите его в трубку объемом 15 мл, заполненную 10 мл 4% PFA в PBS.
    7. Инкубируйте расчлененный мозг в течение ночи в 4% PFA в PBS при 4 °C для полной фиксации. После этого инкубируйте мозг в течение ночи в 10 мл 15% сахарозы в PBS и перенесите его в 10 мл 30% сахарозы в PBS на дополнительный день на качалках. Эта постепенная замена сахарозы помогает предотвратить повреждение тканей льдом, когда мозг позже хранится в морозильной камере.
    8. Встраивание мозга: Коронально встраивайте мозг в среду для встраивания в форму для встраивания ткани, а затем замораживайте с помощью 2-метилбутана с сухим льдом19.
    9. Замороженные срезы мозга: с помощью криостата установите последовательные корональные срезы (толщиной 20 мкм) встроенного мозга на положительно заряженное стекло. Срезы мозга полностью высушиваются на воздухе при комнатной температуре в течение ночи и хранятся в морозильной камере при температуре -80 °C.
    10. Препарат блокирующего буфера: Смешайте 10% сыворотки новорожденных телят, 30 мг/мл бычьего альбумина, 10 мг/мл глицина и 0,4% Triton X-100 в TBS для создания блокирующего буфера. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель перед использованием.
    11. Окрашивание IgG у мышей: После того, как поврежденные ножом участки коры головного мозга высушивают на воздухе при комнатной температуре в течение 1 часа, после фиксации их 500 мкл 4% PFA на предметное стекло в течение 30 минут. Затем промойте секцию PBS (500 μл/слайд) в течение 5 минут, а затем два раза промойте трис-буферным физиологическим раствором (TBS, 500 μл/слайд) в течение 5 минут каждая.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все процедуры в увлажняющей коробке, чтобы предотвратить испарение буферов.
    12. Погасить активность эндогенных ферментов в срезах с 10% метанолом и 3% перекисью водорода в TBS на 5 мин, затем провести две промывки трис-буферным физиологическим раствором (TBS, 500 мкл/слайд) в течение 5 мин каждая.
    13. Проводите блокирование с помощью блокирующего буфера (500 мкл/слайд) в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антитела. Затем инкубируют срезы с биотин-конъюгированным антителом IgG мыши (разведение 1:300 с блокирующим буфером, 300 мкл/слайд) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    14. Во время инкубации с мышиным антителом IgG приготовьте смесь из 1 мкл реагента А и 1 мкл реагента В из набора системы пероксидазы на основе авидина/биотина в 300 мкл блокирующего буфера. Перед использованием выдержите эту смесь в течение 30 минут при комнатной температуре. После завершения инкубации антител IgG у мышей промойте срезы TBS в течение 5 минут три раза. Затем инкубируйте секции с приготовленной смесью реагентов А и В (300 мкл/слайд) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    15. Промойте срезы 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 в течение 5 минут, три раза, в течение 1 часа. Затем проявите цвет, используя 0,05% 3,3'-диаминобензидина (DAB) в 0,05% перекиси водорода с добавлением 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 (500 мкл/слайд) в течение от 5 минут до 1 ч (рис. 2A). Наблюдайте под микроскопом за изменением цвета перед остановкой реакции.
    16. Промойте секции 0,1 М Tris-HCl pH 8,0 в течение 5 мин три раза и высушите секции на воздухе в течение 15 мин. После этого обезвоживайте секции, погрузив их в 95% этанол на 2 минуты дважды, а затем в 100% этанол на 2 минуты, дважды. Дважды очистите срезы в ксилоле в течение 5 минут. Защитите секции с помощью нерастворимого в воде монтажного материала и дайте им высохнуть.
    17. Анализ интенсивности окрашивания IgG у мыши: получение изображений срезов с помощью микроскопа с 20-кратным объективом.
    18. С помощью программного обеспечения ImageJ количественно измерьте интенсивность окрашивания, измерив средние значения серого в пяти случайно выбранных полях (8 × 8мкм2 для каждого) из иммуноферментативно окрашенных областей в каждом участке. Нормализуйте интенсивность окрашивания, используя среднее значение серого от каждого контралатера; Раненая область отсутствует в качестве коррекции фона. Вычислите среднее значение нормализованных средних значений IgG для пяти полей, чтобы определить среднее значение IgG мыши для каждого участка.
  2. Оценка синей утечки по Эвансу в паренхиму мозга
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол Evans blue аналогичен методу, описанному ранее11. Меченый флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) декстран также работает для восстановления после распада ГЭБ10.
    1. Инъекция Evans blue: Введите 2% Evans blue in PBS (3 мл/кг) мыши с ножевым ранением через хвостовую вену за 1 час до вскрытия.
    2. Экстракция свежего мозга: через 1 ч после введения синего цвета Эванса перфузируйте мышь PBS, как описано в шагах 2.1.1-2.1.4. Затем препарируйте и разрежьте свежий мозг коронально на участки толщиной 1 мм с помощью слайсера для мозга. Выберите четыре среза и вырежьте кусочки мозга (1 мм2 квадрата каждая), которые включают в себя область колотой раны или неповрежденные участки в коре головного мозга без раны, согласно миллиметровой бумаге (рис. 1D).
    3. Количественное определение синего цвета Эванса: соберите четыре кусочка мозга в пробирку объемом 1,5 мл и гомогенизируйте их 200 мкл трихлоруксусной кислоты с помощью измельчителя тканей. Центрифугируйте гомогенат при 10 000 x g при 4 °C в течение 20 минут. Затем соберите надосадочную жидкость с помощью пипетки и разбавьте ее 600 мкл этанола. Подготовьте стандартную кривую синего Эванса в диапазоне от 0 до 1,0 нг/мл, чтобы количественно оценить его концентрацию. Измерьте интенсивность флуоресценции на длине волны 680 нм с длиной волны возбуждения 620 нм с помощью планшетного ридера.

3. Оценка степени воспаления в головном мозге после ножевого ранения

  1. Иммуноферментативное окрашивание участка головного мозга с ножевыми ранениями на содержание глиальных клеток
    1. Подготовка срезов мозга: Изготовьте срезы мозга с помощью стекол, как описано в пунктах 2.1.1-2.1.9.
    2. Глиальное окрашивание: После сушки на воздухе поврежденных ножом участков коры головного мозга в течение 1 ч снова зафиксировать участки 4% PFA (500 мкл/слайд) в течение 30 минут. Затем промойте срезы PBS (500 μл/слайд) в течение 5 минут, а затем две промывки TBS (500 μл/слайд) в течение 5 минут каждая.
    3. Погасить активность эндогенных ферментов в срезах с 10% метанолом и 3% перекисью водорода в TBS на 5 мин, затем провести две промывки трис-буферным физиологическим раствором (TBS, 500 мкл/слайд) в течение 5 мин каждая.
    4. Проводите блокирование с помощью блокирующего буфера (500 мкл/слайд) в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антитела.
    5. Инкубируйте срезы в течение ночи с первичным антителом (300 мкл/слайд). Используйте следующие разведения для первичного антитела: 1:3000 для Iba1 и 1:1000 для GFAP, разведенных в блокирующем буфере.
    6. Промойте секцию три раза TBS по 5 минут каждый. Затем инкубируют с конъюгированным с биотином вторичным антителом (разведение 1:300 с блокирующим буфером, 300 мкл/слайд) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    7. Во время инкубации со вторичным антителом приготовьте смесь из 1 мкл реагента А и 1 мкл реагента В из набора системы авидин/биотин на основе пероксидазы в 300 мкл блокирующего буфера. Затем перед использованием смесь инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут.
    8. После завершения инкубации вторичных антител срезы трижды промыть TBS в течение 5 мин каждый и инкубировать срезы с приготовленной смесью реагентов А и В (300 мкл/слайд) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    9. Промойте срезы 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 в течение 5 минут, три раза, в течение 1 часа. Затем проявите цвет, используя 0,05% DAB в 0,05% добавленной перекиси водорода 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 (500 μл/слайд) в течение от 30 минут до 3 часов. Наблюдайте под микроскопом за изменением цвета перед остановкой реакции.
    10. Промойте секции 0,1 М Tris-HCl pH 8,0 в течение 5 мин три раза и высушите секции на воздухе в течение 15 мин. После этого обезвоживайте секции, погрузив их в 95% этанол на 2 минуты дважды, а затем в 100% этанол на 2 минуты, дважды. Дважды очистите срезы в ксилоле в течение 5 минут. Защитите секции с помощью нерастворимого в воде монтажного материала и дайте им высохнуть. Делайте снимки среза с помощью микроскопа с объективом 20x.
  2. Иммунофлуоресцентное окрашивание участка головного мозга на глиальные клетки
    1. Подготовка срезов мозга: Изготовьте срезы мозга с помощью стекол, как описано в пунктах 2.1.1-2.1.9.
    2. Глиальное окрашивание: После сушки на воздухе поврежденных ножом участков коры головного мозга в течение 1 ч снова зафиксировать участки 4% PFA (500 мкл/слайд) в течение 30 минут. Затем промойте срезы PBS (500 μл/слайд) в течение 5 минут, а затем две промывки TBS (500 μл/слайд) в течение 5 минут каждая. Проводите блокирование с помощью блокирующего буфера (500 мкл/слайд) в течение 1 ч при комнатной температуре, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антитела.
    3. Инкубируйте срезы в течение ночи с первичным антителом (300 мкл/слайд). Используйте следующие разведения для первичного антитела: 1:3000 для Iba1 и 1:1000 для GFAP, разведенный в блокирующем буфере.
    4. Промойте секцию три раза TBS по 5 минут каждый. Затем инкубируют с флуоресцентно-конъюгированным вторичным антителом (разведение 1:300 с блокирующим буфером, 300 мкл/слайд) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    5. Срезы трижды промыть TBS в течение 5 мин каждая и инкубировать срезы с 0,4 мкг/мл раствора DAPI в TBS (500 мкл/слайд) в течение 5 мин при комнатной температуре.
    6. Промойте срезы TBS (500 μл/слайд) в течение 5 минут и дистиллированной водой (500 μл/слайд) в течение 5 минут. После сушки на воздухе в течение 15 минут накройте их монтажным материалом на водной основе и дайте им высохнуть. Получение изображений среза осуществляется с помощью конфокального микроскопа с 20-кратным объективом.
  3. КПЦР в реальном времени для маркеров глиальных клеток и воспалительных цитокинов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров 16,20,21,22, используемые в представленном протоколе, перечислены в таблице 1.
    1. Подготовка свежей мозговой ткани: Проведите перфузию мыши с помощью PBS, как описано в шагах 2.1.1-2.1.4. Затем извлеките и разрежьте свежий мозг коронально на участки толщиной 1 мм с помощью слайсера для мозга. Выберите четыре среза и вырежьте кусочки мозга (1 мм2 квадрата каждая), которые включают в себя область колотой раны или неповрежденные участки на контралатеральной стороне коры головного мозга, согласно миллиметровой бумаге. Определите область для вырезания, которая включает в себя очаг поражения в центре (рисунок 1D).
    2. Экстракция РНК: Соберите четыре кусочка мозга в пробирку объемом 1,5 мл и гомогенизируйте их 1 мл реагента TRIzol с помощью пипетирования. Выдержать смесь в течение 5 минут при комнатной температуре. Затем добавьте 200 μл хлороформа, хорошо перемешайте и инкубируйте еще 2 минуты при комнатной температуре. Центрифугируйте смесь при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Осторожно переложите верхний, прозрачный слой в новую пробирку объемом 1,5 мл, избегая белых осадков, которые содержат ДНК и белки.
    3. Добавьте в собранный верхний слой 500 μл изопропанола, хорошо перемешайте и выдержите 10 минут при комнатной температуре. После центрифугирования при 12 000 x g в течение 10 мин при 4 °C удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 мл 70% этанола для промывки гранул РНК. Центрифугируйте при 7 500 x g в течение 5 минут при 4 °C, полностью удалите надосадочную жидкость и высушите гранулу на воздухе в течение 10 минут. Растворите гранулу РНК в 15 μл воды, не содержащей РНКазы, и денатурируйте РНК в течение 10 минут при 55°C.
    4. Измерьте концентрацию РНК с помощью микрообъемного спектрофотометра. Немедленно храните РНК при температуре -80 °C.
    5. Синтез кДНК: Для синтеза кДНК используйте коммерчески доступный набор для синтеза ДНК. Приготовьте в общей сложности 10 мкл реакционного буфера в пробирке объемом 1,5 мкл для каждого образца, который включает 2 мкл 5 x RT буфера, 0,5 мкл RT Enzyme Mix, 0,5 мкл Primer Mix, 1 μг РНК и воду без нуклеаз. Инкубировать при 37 °C в течение 15 мин для реакции обратной транскрипции и при 98 °C в течение 5 мин для реакции инактивации фермента. Затем добавьте в буфер 90 μл воды, не содержащей нуклеаз, и хорошо перемешайте. Храните раствор кДНК при температуре -20°C.
    6. Количественная оценка экспрессии РНК: Для анализа количественной ПЦР в режиме реального времени используйте коммерчески доступный набор мастер-микса для количественной ПЦР. Приготовьте раствор Mix для каждого образца, смешав 5 мкл смеси KOD SYBR qPCR Mix, 0,4 мкл прямого праймера 5 мкМ, 0,4 мкл 5 мкМ обратного праймера и 0,2 мкл 50 x ROX в 2 мкл воды, не содержащей нуклеаз.
    7. Приготовьте смесь из 2 μL раствора кДНК и 8 μL раствора Mix в 8-полосковой пробирке, хорошо перемешайте и уменьшите вращение.
    8. Инициируйте реакцию ПЦР при следующих циклических условиях: 98 °C в течение 2 мин, затем 40 циклов при 98 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 10 с и 68 °C в течение 30 с. Выполните этап анализа кривой плавления/диссоциации с помощью машины для количественной ПЦР в режиме реального времени.
    9. Анализ экспрессии мРНК: Анализ уровня экспрессии мРНК с использованием метода 2-Delta-Delta-Ct, который выполняется путем нормализации с помощью гена-домохозяйки Gapdh, а затем с помощью гена контралатеральной стороны23.

Результаты

Для анализа восстановления после распада ГЭБ уровень кровоизлияния в кору головного мозга с ножевыми ранениями оценивали путем измерения уровня экстравазации сывороточного IgG через 1, 3, 5 и 7 дней после черепно-мозговой травмы. Изображения окрашивания IgG у мышей выяви?...

Обсуждение

Здесь был представлен протокол создания модели мыши ЧМТ с помощью игл. Этот протокол позволяет количественно оценить восстановление после распада ГЭБ и воспаления после черепно-мозговой травмы с использованием гистологических и молекулярно-биологических подходов....

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Аяну Хамано, Минори Ямаситу, Мисаки Эндо, Хироно Кобаяши и Нито Накахиру за помощь в иммуногистохимии и количественной ПЦР в реальном времени. Эта работа была поддержана JSPS KAKENHI 19K16122, Научным фондом Такеда, Фондом Астелласа по исследованиям метаболических нарушений, Фондом Мицубиси, Фондом науки о мозге и Мемориальным фондом Уэхара для К.Х.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
19 G x 1•1/2" needleTERUMONN-1938R 
27 G x 3/4" needleTERUMONN-2719S
anti-GFAP antibodySigma-AldrichG9269
anti-Iba1 antibodyWako019-19741
Atipamezole HydrochlorideNippon Zenyaku KogyoProduct name: Antisedan
Biotin-conjugated mouse IgG antibodyVector LaboratoriesBA-9200
Biotin-conjugated rabbit IgG antibodyVector LaboratoriesBA-1000
Bovine albuminNacalai tesque01860-07
Brain SlicerVisikolBSLM-2
Butorphanol TartrateMeiji Animal HealthProduct name: Vetorphale 5 mg
Confocal microscopeZeissLSM700
Cryostat LeicaCM1520
DABSigma-AldrichD5637-1G
DAPIRoche10236276001
Evans blueWako056-04061
Fluorescent-conjugated rabbit IgG antibodyInvitrogenA-21206
Fluoromount-GInvitrogen4958-02Water-based mounting medium
Isoflurane Inhalation SolutionViatrisv002139
KOD SYBR qPCR MixTOYOBOQKD-201qPCR master mix kit
MedetomidineNippon Zenyaku KogyoProduct name: Domitor
MicroscopeOlympusFSX100
Microvolume spectrophotometerThermoFisher ScientificNanoDrop One
Midazolam 10 mg/2 mLSandoz1124401A1060
MOUNT QUICKDaido SangyoDM01Water insoluble mounting medium
Newborn calf serumGibco16010159
O.C.T. compoundSakura Finetek Japan45833Embedding medium
Peel-A-Way, Truncated 22 mm Square TopTed Pella27118Tissue embedding mold
Peristaltic perfusion pumpATTOSJ-1211
Plate readerFisher ScientificCytation 3
Real-time qPCR machineThermoFisher ScientificStepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101cDNA synthesis kit
Superfrost Plus Slide GlassFisher Scientific12-550-15Positive-charged slide glass
Suture with needle AlfresaHT2003NA75-KF2
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
VECTASTAIN ABC Standard KitVector LaboratoriesPK-4000Avidin/biotin-based peroxidase system kit

Ссылки

  1. Narayan, R. K., et al. Clinical trials in head injury. J Neurotrauma. 19 (5), 503-557 (2002).
  2. Shitaka, Y., et al. Repetitive closed-skull traumatic brain injury in mice causes persistent multifocal axonal injury and microglial reactivity. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (7), 551-567 (2011).
  3. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  4. Ikeshima-Kataoka, H., Shen, J. S., Eto, Y., Saito, S., Yuasa, S. Alteration of inflammatory cytokine production in the injured central nervous system of tenascin-deficient mice. In Vivo. 22 (4), 409-413 (2008).
  5. Zhou, Y., Wang, Y., Wang, J., Anne Stetler, R., Yang, Q. W. Inflammation in intracerebral hemorrhage: From mechanisms to clinical translation. Prog Neurobiol. 115, 25-44 (2014).
  6. Hijazi, N., et al. Endogenous plasminogen activators mediate progressive intracerebral hemorrhage after traumatic brain injury in mice. Blood. 125 (16), 2558-2567 (2015).
  7. Kataoka, K., et al. Roles of urokinase-type plasminogen activator in a brain stab-wound. Brain Res. 887 (1), 187-190 (2000).
  8. Wang, Y., et al. Early posttraumatic csf1r inhibition via plx3397 leads to time- and sex-dependent effects on inflammation and neuronal maintenance after traumatic brain injury in mice. Brain Behav Immun. 106, 49-66 (2022).
  9. Kaplan, L., Chow, B. W., Gu, C. Neuronal regulation of the blood-brain barrier and neurovascular coupling. Nat Rev Neurosci. 21 (8), 416-432 (2020).
  10. Endo, M., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid regulates blood coagulation and fibrinolysis system for repair after brain injury. Brain Res. 1818, 148511 (2023).
  11. Goldim, M. P. S., Della Giustina, A., Petronilho, F. Using Evans blue dye to determine blood-brain barrier integrity in rodents. Curr Protoc Immunol. 126 (1), e83 (2019).
  12. Hashimoto, K., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid suppresses inflammation via regulation of microglial polarization in the stab-wounded mouse cerebral cortex. Sci Rep. 8 (1), 9715 (2018).
  13. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Yasui, M. Aquaporin 4-dependent expression of glial fibrillary acidic protein and tenascin-c in activated astrocytes in stab-wound mouse brain and in primary culture. J Neurosci Res. 93 (1), 121-129 (2015).
  14. Nakashima, M., et al. The neuroprotective function of 2-carba-cyclic phosphatidic acid: Implications for tenascin-c via astrocytes in traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 361, 577749 (2021).
  15. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  16. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Abe, T., Yasui, M. Immunological function of aquaporin-4 in stab-wounded mouse brain in concert with a pro-inflammatory cytokine inducer, osteopontin. Mol Cell Neurosci. 56, 65-75 (2013).
  17. Ikeshima-Kataoka, H., Yasui, M. Correlation between astrocyte activity and recovery from blood-brain barrier breakdown caused by brain injury. Neuroreport. 27 (12), 894-900 (2016).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Botta, S., Chemiakine, A., Gennarino, V. A. Dual antibody strategy for high-resolution imaging of murine Purkinje cells and their dendrites across multiple layers. STAR Protoc. 3 (2), 101427 (2022).
  20. Amin, D. N., et al. Identification of stage biomarkers for human African trypanosomiasis. Am J Trop Med Hyg. 82 (6), 983-990 (2010).
  21. Jiang, J., et al. Therapeutic window for cyclooxygenase-2 related anti-inflammatory therapy after status epilepticus. Neurobiol Dis. 76, 126-136 (2015).
  22. Wei, J., et al. Microglia activation: One of the checkpoints in the CNS inflammation caused by angiostrongylus cantonensis infection in rodent model. Parasitol Res. 114 (9), 3247-3254 (2015).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2(-delta delta c(t)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Hazy, A., et al. Divergent age-dependent peripheral immune transcriptomic profile following traumatic brain injury. Sci Rep. 9 (1), 8564 (2019).
  25. Xia, Y., et al. Osthole confers neuroprotection against cortical stab-wound injury and attenuates secondary brain injury. J Neuroinflammation. 12, 155 (2015).
  26. Cieri, M. B., Villarreal, A., Gomez-Cuautle, D. D., Mailing, I., Ramos, A. J. Progression of reactive gliosis and astroglial phenotypic changes following stab-wound-induced traumatic brain injury in mice. J Neurochem. 167 (2), 183-203 (2023).
  27. Barreda-Manso, M. A., Yanguas-Casas, N., Nieto-Sampedro, M., Romero-Ramirez, L. Neuroprotection and blood-brain barrier restoration by salubrinal after a cortical stab injury. J Cell Physiol. 232 (6), 1501-1510 (2017).
  28. Rapp, P. E., et al. Patient characterization protocols for psychophysiological studies of traumatic brain injury and post-TBI psychiatric disorders. Front Neurol. 4, 91 (2013).
  29. Brody, D. L., Benetatos, J., Bennett, R. E., Klemenhagen, K. C., Mac Donald, C. L. The pathophysiology of repetitive concussive traumatic brain injury in experimental models; new developments and open questions. Mol Cell Neurosci. 66 (Pt B), 91-98 (2015).
  30. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing recovery time between injuries improves cognitive outcome after repetitive mild concussive brain injuries in mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-891 (2012).
  31. Chen, C., et al. A novel simple traumatic brain injury mouse model. Chin Neurosurg J. 8 (1), 8 (2022).
  32. Machado, C. A., et al. Weight-drop model as a valuable tool to study potential neurobiological processes underlying behavioral and cognitive changes secondary to mild traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 385, 578242 (2023).
  33. Hashimoto, K., Ikeda, N., Nakashima, M., Ikeshima-Kataoka, H., Miyamoto, Y. Vitronectin regulates the fibrinolytic system during the repair of cerebral cortex in stab-wounded mice. J Neurotrauma. 34 (22), 3183-3191 (2017).
  34. Unterberg, A. W., Stover, J., Kress, B., Kiening, K. L. Edema and brain trauma. Neuroscience. 129 (4), 1021-1029 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены