JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Basitleştirilmiş travmatik beyin hasarı (TBH) modelleri terapötik yaklaşımların geliştirilmesini kolaylaştırmıştır. Bu protokol, iğneler kullanılarak bıçak yarası olan bir fare korteksinin oluşturulmasını ana hatlarıyla belirtir ve kanama ve iltihabın analizini sağlar. Bıçak yaralı TBI fare modeli, özel ekipman gerektirmeden gerçekleştirilebilme avantajı sunar.

Özet

Travmatik beyin hasarı (TBI), genellikle kazalar veya sporla ilgili olayların neden olduğu fiziksel hasardan kaynaklanır. TBH'nin nedenleri beyin sarsıntısı, beyin kontüzyonları, hematomlar ve kafatası kırıkları dahil olmak üzere çeşitlidir. Bu farklı nedenleri çoğaltmak için, farklı protokoller kullanılarak çeşitli TBI fare modelleri geliştirilmiştir. Fiziksel beyin hasarı, nöronal kaybı şiddetlendiren hem birincil hem de ikincil beyin yaralanmalarına yol açar. Birincil yaralanma, hasardan hemen sonra, genellikle kanama nedeniyle ortaya çıkar ve daha sonra lezyon etrafındaki iltihaplanma da dahil olmak üzere ikincil yaralanmaları tetikler. Bu nedenle, kanama yayılımını ve inflamatuar şiddeti değerlendirmek için uygun bir TBI modeli geliştirmek çok önemlidir. Bu protokol, TBI patolojisi ile ilişkili kanama, iltihaplanma ve nöronal kayıp mekanizmalarını incelemek için bıçak yaralı TBI fare modeli olarak adlandırılan penetran beyin hasarını taklit etmek için bir yöntem sunar. Bu model, kafatasının ve beynin iğnelerle delinmesiyle oluşturulmuştur ve özel deney ekipmanına ihtiyaç duymadan yürütülmesi kolaydır. Ek olarak, bir iğne kullanılarak fare serebral korteksine verilen küçük yaralanma, hayvanın ameliyat sonrası davranışını etkilemez. Bu özellik, araştırmacıların beyin hasarının lokalize etkilerini daha geniş davranışsal sonuçlar hakkında endişe duymadan incelemelerine olanak tanır. Bıçakla yaralanmış fare serebral kortekslerinden alınan örnek veriler, modelin parankim, glial aktivasyon ve inflamatuar sitokin üretimine kan sızıntısını değerlendirmedeki etkinliğini göstermektedir. Ayrıca, bu protokol kan pıhtılaştırıcılarının ve anti-enflamatuar bileşiklerin değerlendirilmesini kolaylaştırarak TBH için terapötik ajanların geliştirilmesine yardımcı olur.

Giriş

Travmatik beyin hasarı (TBH), genellikle trafik kazaları ve düşme kazaları dahil olmak üzere kazalardan kaynaklanan fiziksel hasardan kaynaklanır. TBH iki tipe ayrılır: keskin bir cisim beynin yanı sıra kafatasını da deldiğinde ortaya çıkan penetran beyin hasarı ve kafatasında bir kırılma olmaksızın beynin şiddetli bir şekilde sallanmasından kaynaklanan kapalı beyin hasarı1.

TBH'nin nedenleri beyin sarsıntısı, beyin kontüzyonu, hematomlar ve kafatası kırıkları dahil olmak üzere çok çeşitlidir; bu nedenle, TBI fare modelleri, bu farklı nedenleri çoğaltmak için çeşitli protokoller kullanılarak geliştirilmiştir. Örneğin, tekrarlayan bir sarsıntılı TBI modeli, farelerin elektromanyetik olarak kontrol edilen bir kauçuk çarpma tertibatı2 kullanılarak birkaç kez sıkıştığı beyin sallamayı içerir. Ek olarak, ağırlık düşürme TBI modelinde, standart bir ağırlık düşürme cihazı tarafından kafaya güçlü bir dış kuvvet uygulanır ve sağlam bir kafatası3 ile fokal künt yaralanmaya neden olur. Ayrıca, bıçak yaralı TBI modeli, bir iğne4 kullanılarak kafatası ve beynin delinmesiyle hazırlanır (Şekil 1A). Birkaç TBI modeli geliştirildiğinden, gözlemlenmesi gereken spesifik patolojiye dayalı bir model seçmek önemlidir.

Fiziksel hasarın neden olduğu beyin hasarı, nöronal kaybı daha da kötüleştiren birincil ve ikincil beyin yaralanmalarına yol açar. Birincil yaralanma, kan-beyin bariyerinin (BBB), kanama ve hematomun bozulmasından kaynaklanan hasardan hemen sonra meydana gelir. Bu nedenle, kanama ve hematom genişlemesini en aza indirmek çok önemlidir, çünkü bu faktörler TBH semptomlarının şiddetini şiddetlendirebilir. İkincil yaralanma, intraparankimal kan bileşenleri tarafından tetiklenir ve bu daha sonra lezyon5 çevresinde iltihaplanmaya yol açar. Beyin hasarı sonrası prognoz, inflamatuar dinamiklere bağlıdır; Bu nedenle, olumlu bir prognoz için hem birincil hem de ikincil yaralanmaları hızla azaltmak çok önemlidir 6,7,8.

BBB, sağlıklı beyinlerdeki kan damarlarından madde sızıntısını kısıtlamak için birlikte çalışan perisitlerden, endotel hücreleri arasındaki sıkı bağlantılardan ve astrositlerin uç ayaklarından oluşur9. Sunulan bıçak yarası sisteminde, BBB fiziksel olarak bozulmuştur. BBB bütünlüğünü değerlendirmek için yaygın yöntemler arasında immünoglobulin G (IgG) için boyama ve Evans mavisi ve dekstran10,11 gibi floresan izleyicilerin sızıntısının değerlendirilmesi yer alır. IgG boyama, lezyon bölgesinden sızan ve beyinde biriken kan bileşenlerini etiketler. BBB iyileştikçe, kan bileşenlerinin beyne sızması azalır ve bu birikintiler yavaş yavaş bozulur. Bu nedenle, IgG boyama, beyin hasarından sonra BBB iyileşmesinin derecesini değerlendirmek için kullanılır. Ek olarak, intravenöz olarak uygulanan izleyicinin beyin parankimine sızma seviyesi, BBB'nin iyileşmesini yansıtır. Bu yöntem, BBB dinamiklerinin daha net bir değerlendirmesini sağlar, çünkü izleyici sızıntısı doğrudan kan bileşenlerinin kan dolaşımından beyin parankimine geçişini gösterir. Ayrıca, kanamayı en aza indirmek, hızlı kan pıhtılaşması ve zamanında fibrinoliz ile desteklenen daha hafif bir birincil yaralanmaya yol açar. Bu nedenle, kan pıhtılaşması ve fibrinoliz düzenleyicilerinin ekspresyonunun ölçülmesi, bu süreci analiz etmenin etkili bir yoludur. Pıhtılaşmanın altında yatan moleküler mekanizma ile ilgili olarak, beyin hasarı sonrası kanama fibrin oluşumu ile durdurulur. Daha sonra, fibrin açısından zengin trombüs, doku plazminojen aktivatörü (tPA) ve ürokinaz plazminojen aktivatörü (uPA) tarafından parçalanır. Bıçak yarası TBI fare modelinde, fibrin oluşumu yaralanmadan 1 gün sonra zirve yapar ve daha sonra10 azalır. Bu nedenle, BBB'nin geri kazanım seviyesi, kan bileşenlerinin ölçülmesi ve beyin parankimine izleyici ekstravazasyonunun yanı sıra kan pıhtılaşma faktörlerinin ekspresyonu ile tahmin edilebilir.

İkincil yaralanma sürecinde inflamasyon için kantitasyon yöntemleri arasında glial aktivasyon ve inflamatuar sitokin ekspresyonu bulunur. Uzun süreli inflamasyon esas olarak lezyon bölgesi çevresinde aşırı mikroglia ve astrosit birikimi ile indüklenir. Örneğin, bıçak yaralı bir TBI modelinde, bıçak yaraları, hücre kalıntılarını ve kan bileşenlerini uzaklaştırmak için lezyon etrafındaki glial hücrelerin yeniden aktivasyonunu uyarır. Bu glial reaktivasyon tipik olarak bıçak yarasından 3 gün sonrazirve yapar 12,13. Fagositoz fonksiyonlarına ek olarak, yeniden aktive edilmiş glial hücreler aşırı inflamatuar sitokinler salgılar ve bu da lezyon14 çevresinde nöronal kayba neden olur. Glial inflamasyonun zayıflamasının beyin hasarı sonrası olumlu bir prognoza katkıda bulunduğu bildirilmiştir12,14. Enflamasyon seviyesinin belirlenmesi, şiddetini ve prognozunu değerlendirmek için yararlıdır. Bu nedenle, kanama yayılımını ve inflamatuar şiddetini değerlendirmek için uygun bir TBI modeli geliştirmek önemlidir. Bu çalışma, TBH patolojisinde kanama, inflamasyon ve nöronal kayıp mekanizmalarını incelemek amacıyla, penetran beyin hasarını taklit eden bıçak yaralı bir fare modelini tanıtmaktadır.

Protokol

Tüm hayvan bakımı protokolleri, Japonya Ochanomizu Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Japonya'daki Eğitim, Bilim ve Kültür Bakanlığı tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi. Altı haftalık yetişkin C57BL / 6J dişi fareler (20-25 g) kullanıldı. Tüm farelere temiz bir ortamda yiyecek ve suya ad libitum erişim sağlandı. Kullanılan reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Serebral kortekse bıçak yarası ameliyatı

  1. Reaktiflerin hazırlanması
    NOT: Anestezi protokolü daha önce tarif edilene benzer15. Hayvan tesisi belirli bir anestezik önerirse, lütfen talimatlarına uyun. Pentobarbital sodyumun serebral korteks 4,13,16,17'de bıçak yarası ameliyatı için etkili olduğu daha önce doğrulanmıştır.
    1. Kombinasyon anestezik MMB: 18.625 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1.875 mL 1 mg / mL medetomidin, 2.0 mL 5 mg / mL midazolam ve 2.5 mL 5 mg / mL butorphanol tartratı çözün (PBS) toplam 25 mL hacim oluşturmak için. Bu karışım 75 mg/L medetomidin, 400 mg/L midazolam ve 500 mg/L butorphanol tartrat karışımı konsantrasyonuna sahip olacaktır. Kullanmadan önce 4 °C'de 8 haftaya kadar saklayın.
    2. Anestezi antagonisti: 75 mg / L atipamezol hidroklorür konsantrasyonu ile toplam 10 mL'lik bir hacim oluşturmak için 150 μL 5 mg / mL atipamezol hidroklorürü 9.85 mL PBS içinde çözün. Kullanmadan önce 4 °C'de, ışıktan koruyarak 8 haftaya kadar saklayın.
  2. Ameliyat prosedürü
    1. Fare anestezisi: Fareleri uykuya dalana kadar izofluran inhalasyon solüsyonuna batırılmış bir kağıt kullanarak geçici olarak uyuşturun. Daha sonra, 27 G x 3/4 "iğne ile 1 mL'lik bir şırınga kullanarak 10 μL / g kombinasyon anestezik MMB intraperitoneal enjekte edin. 3-5 dakika sonra, ayak parmağınızı kıstırarak ve doğru refleksi kontrol ederek anestezinin etkinliğini onaylayın.
      NOT: İzofluran inhalasyon solüsyonu kullanırken aşırı dozda anestezi vermemeye çok dikkat ettiğinizden emin olun.
    2. Fareyi ventral tarafı üzerine bir kağıt havluya yerleştirin. Aktarımdan sonra, farenin hala bir ayak parmağı çimdikleme ile uyuşturulduğunu yeniden onaylayın.
    3. Oksipital bölgenin derisindeki kürkü tıraş edin. Farenin kafasının arkasındaki kürkü pamuklu çubuk kullanarak% 70 etanol ile sterilize edin. Oksipital cildi künt forseps ile kavrayın ve kafatasına veya herhangi bir organa zarar vermeden oksipital kemiği ortaya çıkarmak için 1.0-1.5 mm genişliğinde bir kesi yapın. Kafatası boyunca serebral korteks ve beyincik arasındaki sınırı gözlemlemek için kesiyi nazikçe ve yavaşça açın (Şekil 1B).
      NOT: Yara almayan fare için kafatasına veya beyne herhangi bir zarar gelmediğinden emin olun.
    4. Fare kraniyotomisi: 19 G x 1 • 1/2 "iğne kullanarak oksipital kemiğin sağ yarım küresinde küçük bir delik oluşturun. Beyin parankimine zarar vermemeye dikkat ederek, bıçak yarası iğneleme için bir yerleştirme noktası oluşturmak üzere iğneyi hafifçe döndürün. Delik, lambda ve kenar arasındaki sağ hemisfer interaural çizginin orta noktasına yerleştirilmelidir (Şekil 1B). Bu delik, bir sonraki adımda bıçakla sarılmış iğnenin yerleştirilmesi için bir kılavuz görevi görür.
    5. Bıçak yarası: Yerleştirme noktasından 27 G x 3/4" iğne sokun ve serebral korteksi rostrokaudal eksen boyunca bıçaklayın (Şekil 1B,C). İğne, kafatasının ön kısmına temas edene kadar sokulur, ardından yavaşça geri çekilir. Uygun derinlik, iğnenin serebral korteksin yüzeyinden görülebildiği derinliktir. Serebral korteksin sol tarafı hasarsız kontrol olarak kullanılır.
    6. 1/2 yuvarlak iğne ile naylon 3-0 sütür kullanarak cilt kesisini dikin.
    7. Kombinasyon anestezik MMB olarak intraperitoneal olarak 10 μL / g anestezi antagonisti uygulayın. Fare, anestezi antagonisti enjeksiyonundan sonra 8-16 saat içinde yürüyebilmelidir.

2. Kanamanın değerlendirilmesi ve BBB arızasından iyileşme

  1. Fare IgG sızıntısı için bıçak yarası beyin bölümünün immünoenzimatik boyanması
    NOT: Burada kızağa monte edilmiş donmuş beyin kesitleri kullanılmıştır. Serbest yüzen donmuş beyin bölümleri de bu protokol için uygundur.
    1. Fare anestezisi: Fareyi uykuya dalana kadar izofluran inhalasyon solüsyonuna batırılmış bir kağıdın yanına yerleştirerek anesteziyi indükleyin. Daha sonra hemen intraperitoneal olarak 100 μL / kg kombinasyon anestezik MMB uygulayın. Anestezinin etkisini bir ayak parmağı sıkışması ve düzeltme refleksi ile onaylayın.
    2. Fareyi sırt üstü yatırın ve hem kollarınızı hem de ayaklarınızı diseksiyon tahtasına sabitleyin.
    3. Fare torakotomisi: Künt forseps kullanarak karın derisini kavrayın ve göğüs kafesini ortaya çıkarmak için cilt ve peritondan 1.0-1.5 cm'lik bir kesi yapın. Kalp perfüzyonunu açığa çıkarmak için kalbe zarar vermekten kaçınırken göğüs kafesini makasla dikkatlice açın.
    4. Kardiyak perfüzyon fiksasyonu: Bir peristaltik perfüzyon pompası hazırlayın ve bir ucunda 19 G x 1 • 1/2 "iğne bulunan bir tüp takın. Kullanmadan önce pompayı açarak tüpü PBS ile doldurun. Daha sonra pompa çalışırken iğne ucunu sol ventriküle sokun ve forseps ile sabitleyin. Sağ kulakçıkta 0.5-1.0 mm'lik bir kesi yapın. Kanı çıkarmak için fareyi18 5 dakika boyunca 4-6 mL / dk hızında en az 20 mL PBS ile perfüze edin.
    5. Pompayı durdurun ve tüpü PBS'de %4'lük bir paraformaldehit (PFA) çözeltisine aktarın. Sabitleme18 için PBS'de en az 20 mL %4 PFA ile pompayı 5 dakika boyunca 4-6 mL / dk hızında yeniden başlatın.
      NOT: Pompa mevcut değilse, perfüzyon için 19 G x 1•1/2" iğneli 50 mL'lik bir şırınga kullanmak da mümkündür.
    6. Beyin diseksiyonu: Fareyi diseksiyon tahtasının üzerine ventral tarafına yerleştirin ve oksipital bölgeden buruna kadar cildin orta hattından bir kesi yaparak kafatasını ortaya çıkarın. Beyne zarar vermemeye özen göstererek, kafatasını makasla çıkararak beyni dikkatlice tamamen açığa çıkarın. Beyni kavisli forseps ile kaldırın ve PBS'de 10 mL% 4 PFA ile doldurulmuş 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
    7. Tam fiksasyon için diseke edilen beyni gece boyunca PBS'de% 4 PFA'da 4 ° C'de inkübe edin. Bunu takiben, beyni gece boyunca PBS'de 10 mL% 15 sükroz içinde inkübe edin ve bir tahterevalli çalkalayıcı üzerinde ek bir gün boyunca PBS'de 10 mL% 30 sükroza aktarın. Bu kademeli sükroz replasmanı, beyin daha sonra bir dondurucuda saklandığında buzdan kaynaklanan doku hasarını önlemeye yardımcı olur.
    8. Beyin gömme: Beyni, bir doku gömme kalıbı içindeki bir gömme ortamına koronal olarak gömün ve ardından kuru buz19 ile 2-metilbütan kullanarak dondurun.
    9. Donmuş beyin bölümleri: Bir kriyostat kullanarak, gömülü beynin seri koronal bölümlerini (20 μm kalınlığında) pozitif yüklü bir slayt camına monte edin. Beyin bölümleri gece boyunca oda sıcaklığında tamamen havayla kurutulur ve -80 °C dondurucuda saklanır.
    10. Bloke edici tampon hazırlığı: Bloke edici tamponu oluşturmak için% 10 yenidoğan buzağı serumu, 30 mg / mL sığır albümini, 10 mg / mL glisin ve% 0.4 Triton X-100'ü TBS'de karıştırın. Kullanmadan önce 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.
    11. Fare IgG boyama: Bıçak yarası olan serebral korteks bölümleri oda sıcaklığında 1 saat havada kurutulduktan sonra, 30 dakika boyunca slayt başına 500 μL %4 PFA ile sonradan sabitleyin. Daha sonra, bölümü PBS (500 μL / slayt) ile 5 dakika yıkayın, ardından her biri 5 dakika boyunca Tris tamponlu salin (TBS, 500 μL / slayt) ile iki yıkama yapın.
      NOT: Tamponların buharlaşmasını önlemek için tüm prosedürleri bir nemlendirici kutusunda gerçekleştirin.
    12. TBS'de% 10 metanol ve% 3 hidrojen peroksit içeren bölümlerde endojen enzim aktivitesini 5 dakika söndürün, ardından her biri 5 dakika boyunca Tris tamponlu salin (TBS, 500 μL / slayt) ile iki yıkama yapın.
    13. Antikorun spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir bloke edici tampon (500 μL / slayt) kullanarak blokaj gerçekleştirin. Daha sonra, bölümleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca biyotin konjuge fare IgG antikoru (bloke edici tampon ile 1:300 seyreltme, 300 μL / slayt) ile inkübe edin.
    14. Fare IgG antikoru ile inkübe edilirken, avidin/biotin bazlı peroksidaz sistem kitinden 1 μL Reaktif A ve 1 μL Reaktif B karışımını 300 μL bloke edici tamponda hazırlayın. Kullanmadan önce bu karışımı oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Fare IgG antikoru inkübasyonu tamamlandıktan sonra, bölümleri TBS ile üç kez 5 dakika boyunca yıkayın. Ardından, hazırlanan Reaktif A ve B karışımı (300 μL/slayt) ile bölümleri oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    15. Bölümleri 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 ile 1 saat boyunca 5 dakika, üç kez yıkayın. Daha sonra, 5 dakika ila 1 saat boyunca% 0.05 hidrojen peroksit eklenmiş 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 (500 μL / slayt) içinde% 0.05 3,3'-diaminobenzidin (DAB) kullanarak renk geliştirin (Şekil 2A). Reaksiyonu durdurmadan önce renk değişimi için mikroskop altında gözlemleyin.
    16. Bölümleri 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın ve bölümleri 15 dakika havayla kurutun. Daha sonra, bölümleri iki kez 2 dakika boyunca %95 etanole, ardından iki kez 2 dakika boyunca %100 etanole batırarak kurutun. Ksilen içindeki bölümleri iki kez 5 dakika boyunca temizleyin. Bölümleri suda çözünmeyen bir montaj ortamı kullanarak lamel yapın ve kurumasını bekleyin.
    17. Fare IgG boyama yoğunluğunun analizi: 20x objektifli bir mikroskop kullanarak bölümlerin görüntülerini yakalayın.
    18. ImageJ yazılımını kullanarak, her bölümdeki immünoenzimatik olarak boyanmış bölgelerden rastgele seçilen beş alanda (her biri için 8 × 8μm2 ) ortalama gri değerleri ölçerek boyama yoğunluğunu ölçün. Her kontralateralden ortalama gri değeri kullanarak boyama yoğunluğunu normalleştirin; Arka plan düzeltmesi olarak yaralı bölge yoktur. Her bölüm için fare IgG boyamanın ortalama gri değerini belirlemek için beş alandan normalleştirilmiş ortalama gri değerlerinin ortalamasını hesaplayın.
  2. Beyin parankimine Evans mavisi sızıntısının değerlendirilmesi
    NOT: Evans blue protokolü, daha önce açıklanan yönteme benzer11. Floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli dekstran ayrıca BBB parçalanmasından10 geri kazanım için de çalışır.
    1. Evans mavisi enjeksiyonu: Diseksiyondan 1 saat önce kuyruk damarından bıçaklanmış fareye PBS'de% 2 Evans mavisi (3 mL / kg) uygulayın.
    2. Taze beyin ekstraksiyonu: Evans mavisi uygulamasından 1 saat sonra, fareyi 2.1.1-2.1.4 adımlarında açıklandığı gibi PBS ile perfüze edin. Ardından, taze beyni bir beyin dilimleyici kullanarak koronal olarak 1 mm kalınlığında bölümler halinde inceleyin ve dilimleyin. Grafik kağıdına göre, bıçak yarası bölgesini veya yarasız serebral korteksteki sağlam bölgeleri içeren dört dilim seçin ve beyin parçalarını (her biri1 mm 2 kare) kesin (Şekil 1D).
    3. Evans mavisi miktar tayini: Dört beyin parçasını 1,5 mL'lik bir tüpte toplayın ve bir doku öğütücü kullanarak 200 μL trikloroasetik asit ile homojenize edin. Homojenatı 10.000 x g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, süpernatanı bir pipetle toplayın ve 600 μL etanol ile seyreltin. Konsantrasyonunu ölçmek için 0-1.0 ng/mL arasında değişen standart bir Evans mavisi eğrisi hazırlayın. Bir plaka okuyucu kullanarak 620 nm'lik bir uyarma dalga boyu ile 680 nm'de floresan yoğunluğunu ölçün.

3. Bıçak yarası sonrası beyindeki iltihap seviyesinin değerlendirilmesi

  1. Glial hücreler için bıçak yarası beyin bölümünün immünoenzimatik boyanması
    1. Beyin bölümlerinin hazırlanması: Adım 2.1.1-2.1.9'da anlatıldığı gibi beyin bölümlerine monte edilmiş sürgülü camlar yapın.
    2. Glial boyama: Bıçak yarası olan serebral korteks bölümlerini 1 saat havayla kuruttuktan sonra, bölümleri 30 dakika boyunca %4 PFA (500 μL/slayt) ile tekrar sabitleyin. Daha sonra, bölümleri PBS (500 μL / slayt) ile 5 dakika yıkayın, ardından her biri 5 dakika boyunca TBS (500 μL / slayt) ile iki yıkama yapın.
    3. TBS'de% 10 metanol ve% 3 hidrojen peroksit içeren bölümlerde endojen enzim aktivitesini 5 dakika söndürün, ardından her biri 5 dakika boyunca Tris tamponlu salin (TBS, 500 μL / slayt) ile iki yıkama yapın.
    4. Antikorun spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir bloke edici tampon (500 μL / slayt) kullanarak blokaj gerçekleştirin.
    5. Bölümleri gece boyunca birincil antikor (300 μL / slayt) ile inkübe edin. Birincil antikor için aşağıdaki dilüsyonları kullanın: Iba1 için 1:3.000 seyreltme ve bloke edici tamponda seyreltilmiş GFAP için 1:1.000 seyreltme.
    6. Bölümü TBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, oda sıcaklığında 1 saat boyunca biyotin konjuge ikincil antikor (bloke edici tampon ile 1:300 seyreltme, 300 μL / slayt) ile inkübe edin.
    7. İkincil antikor ile inkübe edilirken, avidin/biotin bazlı peroksidaz sistem kitinden 1 μL Reaktif A ve 1 μL Reaktif B karışımını 300 μL bloke edici tamponda hazırlayın. Daha sonra karışımı kullanmadan önce 30 dakika oda sıcaklığında inkübe edin.
    8. İkincil antikor inkübasyonu tamamlandıktan sonra, bölümleri TBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın ve bölümleri hazırlanan Reaktif A ve B karışımı (300 μL / slayt) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    9. Bölümleri 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 ile 1 saat boyunca 5 dakika, üç kez yıkayın. Ardından, 30 dakika ila 3 saat boyunca% 0.05 hidrojen peroksit eklenmiş 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 (500 μL / slayt) içinde% 0.05 DAB kullanarak renk geliştirin. Reaksiyonu durdurmadan önce renk değişimi için mikroskop altında gözlemleyin.
    10. Bölümleri 0.1 M Tris-HCl pH 8.0 ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın ve bölümleri 15 dakika havayla kurutun. Bundan sonra, bölümleri iki kez 2 dakika boyunca% 95 etanole, ardından 2 dakika boyunca% 100 etanole batırarak kurutun. Ksilen içindeki bölümleri iki kez 5 dakika boyunca temizleyin. Bölümleri suda çözünmeyen bir montaj ortamı kullanarak lamel yapın ve kurumasını bekleyin. Kesit görüntülerini mikroskobu kullanarak 20x objektifle yakalayın.
  2. Glial hücreler için bıçak yarası beyin bölümünün immünofloresan boyaması
    1. Beyin bölümlerinin hazırlanması: Adım 2.1.1-2.1.9'da anlatıldığı gibi beyin bölümlerine monte edilmiş sürgülü camlar yapın.
    2. Glial boyama: Bıçak yarası olan serebral korteks bölümlerini 1 saat havayla kuruttuktan sonra, bölümleri 30 dakika boyunca %4 PFA (500 μL/slayt) ile tekrar sabitleyin. Daha sonra, bölümleri PBS (500 μL / slayt) ile 5 dakika yıkayın, ardından her biri 5 dakika boyunca TBS (500 μL / slayt) ile iki yıkama yapın. Antikorun spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için oda sıcaklığında 1 saat boyunca bir bloke edici tampon (500 μL / slayt) kullanarak blokaj gerçekleştirin.
    3. Bölümleri gece boyunca birincil antikor (300 μL / slayt) ile inkübe edin. Birincil antikor için aşağıdaki dilüsyonları kullanın: Iba1 için 1:3.000 seyreltme ve GFAP için 1:1.000 seyreltme, bloke edici tamponda seyreltilmiş.
    4. Bölümü TBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra, floresan konjuge ikincil antikor (bloke edici tampon ile 1:300 seyreltme, 300 μL / slayt) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    5. Bölümleri TBS ile her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın ve bölümleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca TBS (500 μL / slayt) içinde 0.4 μg / mL DAPI çözeltisi ile inkübe edin.
    6. Bölümleri TBS (500 μL/slayt) ile 5 dakika ve damıtılmış su (500 μL/slayt) ile 5 dakika yıkayın. Bölümleri 15 dakika havayla kuruttuktan sonra, su bazlı bir montaj ortamı ile lamel yapın ve kurumaya bırakın. 20x objektifli konfokal bir mikroskop kullanarak kesit görüntülerini yakalayın.
  3. Glial hücre belirteçleri ve inflamatuar sitokinler için gerçek zamanlı qPCR
    NOT: Sunulan protokolde kullanılan primer dizileri 16,20,21,22 Tablo 1'de listelenmiştir.
    1. Taze beyin dokusu hazırlığı: Fareyi adım 2.1.1-2.1.4'te açıklandığı gibi PBS ile perfüze edin. Ardından, taze beyni bir beyin dilimleyici kullanarak koronal olarak 1 mm kalınlığında bölümler halinde çıkarın ve dilimleyin. Grafik kağıdına göre, dört dilim seçin ve serebral korteksin karşı tarafındaki bıçak yarası bölgesini veya sağlam bölgeleri içeren beyin parçalarını (her biri 1 mm2 kare) kesin. Merkezdeki lezyonu içeren kesilecek bölgeyi belirleyin (Şekil 1D).
    2. RNA ekstraksiyonu: Dört beyin parçasını 1.5 mL'lik bir tüpte toplayın ve pipetleme yoluyla 1 mL TRIzol reaktifi ile homojenize edin. Karışımı oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Daha sonra 200 μL kloroform ekleyin, iyice girdaplayın ve oda sıcaklığında 2 dakika daha inkübe edin. Karışımı 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Üst, şeffaf tabakayı, DNA ve protein içeren beyaz çökeltilerden kaçınarak dikkatlice 1,5 mL'lik yeni bir tüpe aktarın.
    3. Toplanan üst tabakaya 500 μL izopropanol ekleyin, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjlemeden sonra, süpernatanı çıkarın ve RNA peletini yıkamak için 1 mL %70 etanol ekleyin. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 7.500 x g'da santrifüjleyin, süpernatantı tamamen çıkarın ve peleti 10 dakika havayla kurutun. RNA peletini 15 μL RNaz içermeyen suda çözün ve RNA'yı 55°C'de 10 dakika denatüre edin.
    4. Bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak RNA konsantrasyonunu ölçün. RNA'yı hemen -80 °C'de saklayın.
    5. cDNA sentezi: cDNA sentezi için piyasada bulunan bir DNA sentez kiti kullanın. Her numune için 1,5 μL'lik bir tüpte 2 μL 5 x RT Tamponu, 0,5 μL RT Enzim Karışımı, 0,5 μL Primer Karışımı, 1 μg RNA ve nükleaz içermeyen su içeren toplam 10 μL Reaksiyon tamponu hazırlayın. Ters transkripsiyon reaksiyonu için 37 ° C'de 15 dakika ve enzim inaktivasyon reaksiyonu için 98 ° C'de 5 dakika inkübe edin. Daha sonra tampona 90 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve iyice karıştırın. cDNA çözeltisini -20°C'de saklayın.
    6. RNA ekspresyonunun miktarının belirlenmesi: Gerçek zamanlı qPCR analizi için piyasada bulunan bir qPCR ana karışım kiti kullanın. 5 μL KOD SYBR qPCR Karışımı, 0,4 μL 5 μM ileri astar, 0,4 μL 5 μM ters astar ve 0,2 μL 50 x ROX'u 2 μL nükleaz içermeyen suda birleştirerek her numune için Karışım çözeltisini hazırlayın.
    7. 8 şeritli bir tüpte 2 μL cDNA çözeltisi ve 8 μL Karışım çözeltisi karışımı yapın, iyice karıştırın ve döndürün.
    8. PCR reaksiyonunu aşağıdaki döngü koşullarıyla başlatın: 98 dakika boyunca 2 °C, ardından 40 saniye boyunca 98°C, 10 saniye boyunca 60°C ve 68 saniye boyunca 30°C. Gerçek zamanlı bir qPCR makinesi kullanarak Erime/Ayrışma Eğrisi Analizi adımını gerçekleştirin.
    9. mRNA ekspresyon analizi: mRNA ekspresyon seviyesini, bir temizlik geni olan Gapdh ile normalleştirme ve ardından karşı taraf 23 ile normalleştirme ile gerçekleştirilen 2-Delta-Delta-Ct yöntemini kullanarak analiz edin.

Sonuçlar

BBB parçalanmasından iyileşmeyi analiz etmek için, bıçak yaralı serebral kortekslerdeki kanama seviyesi, beyin hasarından 1, 3, 5 ve 7 gün sonra serum IgG'nin ekstravazasyon seviyesi ölçülerek değerlendirildi. Fare IgG boyama görüntüleri, beyin hasarını takiben serebral kortekslerde kan sızıntısı ve birikim olduğunu ortaya çıkardı. Bu, BBB iyileştikçe ve IgG proteini bozulduğunda 7 günden fazla bir süre sonra azaldı (Şekil 2B...

Tartışmalar

Burada, iğneler kullanarak bir TBI fare modeli oluşturmak için bir protokol tanıtıldı. Bu protokol, histolojik ve moleküler biyolojik yaklaşımlar kullanılarak BBB'nin parçalanmasından ve beyin hasarı sonrası inflamasyondan iyileşmenin kantitatif bir değerlendirmesine izin verir. Tekrarlayan sarsıntılı TBI modeli ve kilo düşüşü TBI modeli gibi alternatif protokoller, BBB parçalanmasını ve iltihabını analiz etmek için de kullanılabilir. Bu modeller, özel mak...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

İmmünohistokimya ve gerçek zamanlı qPCR konusunda yardımcı oldukları için Ayana Hamano, Minori Yamashita, Misaki Endo, Hirono Kobayashi ve Nito Nakahira'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma JSPS KAKENHI 19K16122, Takeda Bilim Vakfı, Astellas Metabolik Bozukluklar Araştırma Vakfı, Mitsubishi Vakfı, Beyin Bilimi Vakfı ve Uehara Memorial Vakfı tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
19 G x 1•1/2" needleTERUMONN-1938R 
27 G x 3/4" needleTERUMONN-2719S
anti-GFAP antibodySigma-AldrichG9269
anti-Iba1 antibodyWako019-19741
Atipamezole HydrochlorideNippon Zenyaku KogyoProduct name: Antisedan
Biotin-conjugated mouse IgG antibodyVector LaboratoriesBA-9200
Biotin-conjugated rabbit IgG antibodyVector LaboratoriesBA-1000
Bovine albuminNacalai tesque01860-07
Brain SlicerVisikolBSLM-2
Butorphanol TartrateMeiji Animal HealthProduct name: Vetorphale 5 mg
Confocal microscopeZeissLSM700
Cryostat LeicaCM1520
DABSigma-AldrichD5637-1G
DAPIRoche10236276001
Evans blueWako056-04061
Fluorescent-conjugated rabbit IgG antibodyInvitrogenA-21206
Fluoromount-GInvitrogen4958-02Water-based mounting medium
Isoflurane Inhalation SolutionViatrisv002139
KOD SYBR qPCR MixTOYOBOQKD-201qPCR master mix kit
MedetomidineNippon Zenyaku KogyoProduct name: Domitor
MicroscopeOlympusFSX100
Microvolume spectrophotometerThermoFisher ScientificNanoDrop One
Midazolam 10 mg/2 mLSandoz1124401A1060
MOUNT QUICKDaido SangyoDM01Water insoluble mounting medium
Newborn calf serumGibco16010159
O.C.T. compoundSakura Finetek Japan45833Embedding medium
Peel-A-Way, Truncated 22 mm Square TopTed Pella27118Tissue embedding mold
Peristaltic perfusion pumpATTOSJ-1211
Plate readerFisher ScientificCytation 3
Real-time qPCR machineThermoFisher ScientificStepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101cDNA synthesis kit
Superfrost Plus Slide GlassFisher Scientific12-550-15Positive-charged slide glass
Suture with needle AlfresaHT2003NA75-KF2
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
VECTASTAIN ABC Standard KitVector LaboratoriesPK-4000Avidin/biotin-based peroxidase system kit

Referanslar

  1. Narayan, R. K., et al. Clinical trials in head injury. J Neurotrauma. 19 (5), 503-557 (2002).
  2. Shitaka, Y., et al. Repetitive closed-skull traumatic brain injury in mice causes persistent multifocal axonal injury and microglial reactivity. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (7), 551-567 (2011).
  3. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  4. Ikeshima-Kataoka, H., Shen, J. S., Eto, Y., Saito, S., Yuasa, S. Alteration of inflammatory cytokine production in the injured central nervous system of tenascin-deficient mice. In Vivo. 22 (4), 409-413 (2008).
  5. Zhou, Y., Wang, Y., Wang, J., Anne Stetler, R., Yang, Q. W. Inflammation in intracerebral hemorrhage: From mechanisms to clinical translation. Prog Neurobiol. 115, 25-44 (2014).
  6. Hijazi, N., et al. Endogenous plasminogen activators mediate progressive intracerebral hemorrhage after traumatic brain injury in mice. Blood. 125 (16), 2558-2567 (2015).
  7. Kataoka, K., et al. Roles of urokinase-type plasminogen activator in a brain stab-wound. Brain Res. 887 (1), 187-190 (2000).
  8. Wang, Y., et al. Early posttraumatic csf1r inhibition via plx3397 leads to time- and sex-dependent effects on inflammation and neuronal maintenance after traumatic brain injury in mice. Brain Behav Immun. 106, 49-66 (2022).
  9. Kaplan, L., Chow, B. W., Gu, C. Neuronal regulation of the blood-brain barrier and neurovascular coupling. Nat Rev Neurosci. 21 (8), 416-432 (2020).
  10. Endo, M., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid regulates blood coagulation and fibrinolysis system for repair after brain injury. Brain Res. 1818, 148511 (2023).
  11. Goldim, M. P. S., Della Giustina, A., Petronilho, F. Using Evans blue dye to determine blood-brain barrier integrity in rodents. Curr Protoc Immunol. 126 (1), e83 (2019).
  12. Hashimoto, K., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid suppresses inflammation via regulation of microglial polarization in the stab-wounded mouse cerebral cortex. Sci Rep. 8 (1), 9715 (2018).
  13. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Yasui, M. Aquaporin 4-dependent expression of glial fibrillary acidic protein and tenascin-c in activated astrocytes in stab-wound mouse brain and in primary culture. J Neurosci Res. 93 (1), 121-129 (2015).
  14. Nakashima, M., et al. The neuroprotective function of 2-carba-cyclic phosphatidic acid: Implications for tenascin-c via astrocytes in traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 361, 577749 (2021).
  15. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  16. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Abe, T., Yasui, M. Immunological function of aquaporin-4 in stab-wounded mouse brain in concert with a pro-inflammatory cytokine inducer, osteopontin. Mol Cell Neurosci. 56, 65-75 (2013).
  17. Ikeshima-Kataoka, H., Yasui, M. Correlation between astrocyte activity and recovery from blood-brain barrier breakdown caused by brain injury. Neuroreport. 27 (12), 894-900 (2016).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564 (2012).
  19. Botta, S., Chemiakine, A., Gennarino, V. A. Dual antibody strategy for high-resolution imaging of murine Purkinje cells and their dendrites across multiple layers. STAR Protoc. 3 (2), 101427 (2022).
  20. Amin, D. N., et al. Identification of stage biomarkers for human African trypanosomiasis. Am J Trop Med Hyg. 82 (6), 983-990 (2010).
  21. Jiang, J., et al. Therapeutic window for cyclooxygenase-2 related anti-inflammatory therapy after status epilepticus. Neurobiol Dis. 76, 126-136 (2015).
  22. Wei, J., et al. Microglia activation: One of the checkpoints in the CNS inflammation caused by angiostrongylus cantonensis infection in rodent model. Parasitol Res. 114 (9), 3247-3254 (2015).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2(-delta delta c(t)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Hazy, A., et al. Divergent age-dependent peripheral immune transcriptomic profile following traumatic brain injury. Sci Rep. 9 (1), 8564 (2019).
  25. Xia, Y., et al. Osthole confers neuroprotection against cortical stab-wound injury and attenuates secondary brain injury. J Neuroinflammation. 12, 155 (2015).
  26. Cieri, M. B., Villarreal, A., Gomez-Cuautle, D. D., Mailing, I., Ramos, A. J. Progression of reactive gliosis and astroglial phenotypic changes following stab-wound-induced traumatic brain injury in mice. J Neurochem. 167 (2), 183-203 (2023).
  27. Barreda-Manso, M. A., Yanguas-Casas, N., Nieto-Sampedro, M., Romero-Ramirez, L. Neuroprotection and blood-brain barrier restoration by salubrinal after a cortical stab injury. J Cell Physiol. 232 (6), 1501-1510 (2017).
  28. Rapp, P. E., et al. Patient characterization protocols for psychophysiological studies of traumatic brain injury and post-TBI psychiatric disorders. Front Neurol. 4, 91 (2013).
  29. Brody, D. L., Benetatos, J., Bennett, R. E., Klemenhagen, K. C., Mac Donald, C. L. The pathophysiology of repetitive concussive traumatic brain injury in experimental models; new developments and open questions. Mol Cell Neurosci. 66 (Pt B), 91-98 (2015).
  30. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing recovery time between injuries improves cognitive outcome after repetitive mild concussive brain injuries in mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-891 (2012).
  31. Chen, C., et al. A novel simple traumatic brain injury mouse model. Chin Neurosurg J. 8 (1), 8 (2022).
  32. Machado, C. A., et al. Weight-drop model as a valuable tool to study potential neurobiological processes underlying behavioral and cognitive changes secondary to mild traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 385, 578242 (2023).
  33. Hashimoto, K., Ikeda, N., Nakashima, M., Ikeshima-Kataoka, H., Miyamoto, Y. Vitronectin regulates the fibrinolytic system during the repair of cerebral cortex in stab-wounded mice. J Neurotrauma. 34 (22), 3183-3191 (2017).
  34. Unterberg, A. W., Stover, J., Kress, B., Kiening, K. L. Edema and brain trauma. Neuroscience. 129 (4), 1021-1029 (2004).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Travmatik Beyin HasarTBHFare ModeliB ak Yaras ModeliKanamaEnflamasyonN ronal Kay pBirincil Yaralanmakincil YaralanmaBeyin Kont zyonuKafatas K rSitokin retimiGlial AktivasyonTerap tik Ajanlar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır