Modelo de ratón con herida de puñalada para estudiar la hemorragia y la inflamación en lesiones cerebrales traumáticas

Resumen

Los modelos simplificados de lesiones cerebrales traumáticas (TCE) han facilitado el desarrollo de enfoques terapéuticos. Este protocolo describe la creación de una corteza de ratón con heridas punzadas utilizando agujas, lo que permite el análisis de la hemorragia y la inflamación. El modelo de ratón con LCT con herida punzada ofrece la ventaja de realizarse sin necesidad de equipo especializado.

Resumen

La lesión cerebral traumática (TBI, por sus siglas en inglés) es el resultado de daños físicos, a menudo causados por accidentes o incidentes relacionados con el deporte. Las causas de las lesiones cerebrales traumáticas son diversas, incluyendo conmociones cerebrales, contusiones cerebrales, hematomas y fracturas de cráneo. Para replicar estas diferentes causas, se han desarrollado varios modelos de ratones con LCT utilizando distintos protocolos. Las lesiones cerebrales físicas conducen a lesiones cerebrales primarias y secundarias, que exacerban la pérdida neuronal. La lesión primaria ocurre inmediatamente después del daño, a menudo debido a una hemorragia, y posteriormente desencadena lesiones secundarias, incluida la inflamación alrededor de la lesión. Por lo tanto, es crucial desarrollar un modelo de TCE adecuado para evaluar la extensión de la hemorragia y la gravedad inflamatoria. Este protocolo introduce un método para imitar la lesión cerebral penetrante, denominado modelo de ratón con LCT con herida punzante, para estudiar los mecanismos de hemorragia, inflamación y pérdida neuronal asociados con la patología del TCE. Este modelo se crea perforando el cráneo y el cerebro con agujas y es fácil de ejecutar sin necesidad de equipo experimental especializado. Además, la lesión menor infligida en la corteza cerebral del ratón con una aguja no afecta el comportamiento del animal después de la cirugía. Esta característica permite a los investigadores estudiar los efectos localizados de las lesiones cerebrales sin preocuparse por las consecuencias conductuales más amplias. Los datos de muestra de cortezas cerebrales de ratones heridos por puñaladas demuestran la eficacia del modelo para evaluar la fuga de sangre al parénquima, la activación glial y la producción de citocinas inflamatorias. Además, este protocolo facilita la evaluación de coagulantes sanguíneos y compuestos antiinflamatorios, ayudando en el desarrollo de agentes terapéuticos para el TCE.

Introducción

La lesión cerebral traumática (TBI, por sus siglas en inglés) es causada por daños físicos, a menudo resultantes de accidentes, incluidos accidentes de tráfico y accidentes por caídas. El traumatismo craneoencefálico se clasifica en dos tipos: lesión cerebral penetrante, que ocurre cuando un objeto afilado perfora el cráneo y el cerebro, y lesión cerebral cerrada, que es causada por una sacudida violenta del cerebro por dentro sin una ruptura en el^cráneo.

Las causas de las lesiones cerebrales traumáticas son muy diversas, incluyendo conmociones cerebrales, contusiones cerebrales, hematomas y fracturas de cráneo; por lo tanto, se han desarrollado modelos de ratones con LCT utilizando varios protocolos para replicar estas diferentes causas. Por ejemplo, un modelo repetitivo de TBI por conmoción cerebral consiste en sacudidas cerebrales, en las que los ratones se atascan varias veces con un impactador de goma controlado electromagnéticamente². Además, en el modelo TBI de caída de peso, un dispositivo estandarizado de caída de peso ejerce una fuerte fuerza externa sobre la cabeza, lo que causa una lesión contundente focal con un cráneo intacto³. Además, el modelo de TCE por puñalada se prepara perforando el cráneo y el cerebro con una aguja⁴ (Figura 1A). Dado que se han desarrollado varios modelos de TCE, es importante elegir un modelo basado en la patología específica que se debe observar.

Las lesiones cerebrales causadas por daños físicos conducen a lesiones cerebrales primarias y secundarias, que exacerban aún más la pérdida neuronal. La lesión primaria ocurre inmediatamente después del daño, como resultado de la ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB), hemorragia y hematoma. Por lo tanto, es crucial minimizar la hemorragia y la expansión del hematoma, ya que estos factores pueden exacerbar la gravedad de los síntomas de la LCT. La lesión secundaria es desencadenada por componentes sanguíneos intraparenquimatosos, que posteriormente conducen a la inflamación alrededor de la lesión⁵. El pronóstico después de una lesión cerebral depende de la dinámica inflamatoria; Por lo tanto, es crucial mitigar rápidamente las lesiones primarias y secundarias para un pronóstico favorable ^6,7,8.

La BHE está compuesta por pericitos, uniones estrechas entre las células endoteliales, y los extremos de los^astrocitos, que trabajan juntos para restringir la fuga de sustancias de los vasos sanguíneos en cerebros sanos. En el sistema de herida por puñaladas presentado, la BHE está físicamente alterada. Los métodos comunes para evaluar la integridad de la BHE incluyen la tinción de inmunoglobulina G (IgG) y la evaluación de la fuga de trazadores de fluorescencia, como el azul de Evans y el dextrano^10,11. La tinción con IgG marca los componentes sanguíneos que se filtran del sitio de la lesión y se depositan en el cerebro. A medida que la barrera hematoencefálica se recupera, la fuga de componentes sanguíneos al cerebro disminuye y estos depósitos se degradan gradualmente. Por lo tanto, la tinción con IgG se utiliza para evaluar el grado de recuperación de la BHE después de una lesión cerebral. Además, el nivel de fuga del marcador administrado por vía intravenosa en el parénquima cerebral refleja la recuperación de la BBB. Este método proporciona una evaluación más clara de la dinámica de la BBB, ya que la fuga del marcador indica directamente la transición de los componentes sanguíneos del torrente sanguíneo al parénquima cerebral. Además, la minimización de la hemorragia conduce a una lesión primaria más leve, que está respaldada por una coagulación rápida de la sangre y una fibrinólisis oportuna. Por lo tanto, cuantificar la expresión de la coagulación sanguínea y los reguladores de la fibrinólisis es una forma eficaz de analizar este proceso. En cuanto al mecanismo molecular que subyace a la coagulación, la hemorragia tras una lesión cerebral se detiene mediante la formación de fibrina. Posteriormente, el trombo rico en fibrina es degradado por el activador tisular del plasminógeno (tPA) y el activador del plasminógeno uroquinasa (uPA). En el modelo de ratón con LCT con herida punzante, la formación de fibrina alcanza su punto máximo 1 día después de la lesión y se reduce a partir de entonces¹⁰. Por lo tanto, el nivel de recuperación de la BHE se puede predecir mediante la cuantificación de los componentes sanguíneos y la extravasación del marcador en el parénquima cerebral, así como la expresión de factores de coagulación sanguínea.

Los métodos de cuantificación de la inflamación en el proceso de lesión secundaria incluyen la activación glial y la expresión de citocinas inflamatorias. La inflamación prolongada es inducida principalmente por la acumulación excesiva de microglía y astrocitos alrededor del sitio de la lesión. Por ejemplo, en un modelo de LCT con herida punzante, las heridas por puñalada estimulan la reactivación de las células gliales alrededor de la lesión para eliminar los restos celulares y los componentes sanguíneos. Esta reactivación glial suele alcanzar su punto máximo 3 días después de la puñalada^12,13. Además de su función de fagocitosis, las células gliales reactivadas secretan un exceso de citoquinas inflamatorias, lo que resulta en una pérdida neuronal alrededor de la lesión¹⁴. Se ha reportado que la atenuación de la inflamación glial contribuye para un pronóstico favorable después de la lesión cerebral^12,14. Determinar el nivel de inflamación es útil para evaluar la gravedad y el pronóstico. Por lo tanto, es esencial desarrollar un modelo de TCE adecuado para evaluar la extensión de la hemorragia y la gravedad inflamatoria. Este estudio presenta un modelo de ratón con herida de arma blanca que imita la lesión cerebral penetrante, con el objetivo de estudiar los mecanismos de hemorragia, inflamación y pérdida neuronal en la patología del TCE.

Protocolo

Todos los protocolos de cuidado animal fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Ochanomizu, Japón, y se realizaron de acuerdo con las pautas establecidas por el Ministerio de Educación, Ciencia y Cultura de Japón. Se utilizaron ratones hembra C57BL/6J adultos de seis semanas de edad (20-25 g). A todos los ratones se les proporcionó acceso ad libitum a alimentos y agua en un ambiente limpio. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cirugía de puñaladas en la corteza cerebral

1. Preparación de reactivos
   NOTA: El protocolo anestésico es similar al descrito anteriormente¹⁵. Si el centro de animales recomienda un anestésico específico, siga sus instrucciones. Se ha confirmado previamente que el pentobarbital sódico es eficaz para la cirugía de heridas punzantes en la corteza cerebral 4,13,16,17.
   1. Anestésico combinado MMB: Disuelva 1,875 mL de 1 mg/mL de medetomidina, 2,0 mL de 5 mg/mL de midazolam y 2,5 mL de 5 mg/mL de tartrato de butorfanol en 18,625 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para crear un volumen total de 25 mL. Esta mezcla tendrá una concentración de 75 mg/L de medetomidina, 400 mg/L de midazolam y 500 mg/L de mezcla de tartrato de butorfanol. Almacenar a 4 °C durante un máximo de 8 semanas antes de su uso.
   2. Antagonista de la anestesia: Disolver 150 μL de 5 mg/mL de clorhidrato de atipamezol en 9,85 mL de PBS para crear un volumen total de 10 mL, con una concentración de 75 mg/L de clorhidrato de atipamezol. Almacenar a 4 °C, protegido de la luz, hasta 8 semanas antes de su uso.
2. Procedimiento quirúrgico
   1. Anestesia para ratones: Anestesiar temporalmente a los ratones con un papel empapado en una solución de inhalación de isoflurano hasta que se duerman. A continuación, inyecte 10 μL/g de anestésico combinado MMB intraperitoneal con una jeringa de 1 mL con una aguja de 27 G x 3/4". Después de 3-5 minutos, confirme la eficacia de la anestesia realizando un pellizco en la punta del pie y comprobando el reflejo de enderezamiento.
      NOTA: Asegúrese de prestar mucha atención a no administrar una sobredosis de anestesia cuando use la solución de inhalación de isoflurano.
   2. Coloque el ratón sobre su lado ventral en una toalla de papel. Después de la transferencia, vuelva a confirmar que el mouse todavía está anestesiado con un pellizco en el dedo del pie.
   3. Afeita el pelaje de la piel de la región occipital. Esteriliza el pelaje de la parte posterior de la cabeza del ratón con etanol al 70% utilizando un bastoncillo de algodón. Agarre la piel occipital con pinzas romas y haga una incisión de 1,0 a 1,5 mm de ancho para exponer el hueso occipital sin dañar el cráneo ni ningún órgano. Abra suave y lentamente la incisión para observar el límite entre la corteza cerebral y el cerebelo a través del cráneo (Figura 1B).
      NOTA: Asegúrese de que no se produzcan daños en el cráneo o el cerebro del ratón sin heridas.
   4. Craneotomía de ratón: cree un pequeño orificio en el hemisferio derecho del hueso occipital con una aguja de 19 G x 1•1/2". Gire suavemente la aguja para hacer un punto de inserción para la punción de la herida punzante, teniendo cuidado de no dañar el parénquima cerebral. El orificio debe colocarse en el punto medio de la línea interaural del hemisferio derecho entre lambda y borde (Figura 1B). Este orificio sirve como guía para la inserción de la aguja de la puñalada en el paso siguiente.
   5. Herida punzante: Inserte una aguja de 27 G x 3/4" desde el punto de inserción y apuñale la corteza cerebral a lo largo del eje rostrocaudal (Figura 1B, C). La aguja se inserta hasta que entra en contacto con la parte frontal del cráneo y luego se retira suavemente. La profundidad apropiada es aquella en la que la aguja se puede ver a través de la superficie de la corteza cerebral. El lado izquierdo de la corteza cerebral se utiliza como el control no dañado.
   6. Sutura la incisión cutánea con una sutura de nylon 3-0 con una aguja redonda de 1/2.
   7. Administrar 10 μL/g del antagonista anestésico por vía intraperitoneal como anestésico combinado MMB. El ratón debe ser capaz de caminar dentro de las 8-16 horas posteriores a la inyección del antagonista de la anestesia.

2. Evaluación de la hemorragia y recuperación de la ruptura de la BHE

1. Tinción inmunoenzimática de una sección de cerebro herida por arma blanca para la fuga de IgG en ratones
   NOTA: Aquí, se utilizaron secciones de cerebro congelado montadas en portaobjetos. Las secciones de cerebro congeladas que flotan libremente también son adecuadas para este protocolo.
   1. Anestesia para ratones: induzca la anestesia colocando al ratón cerca de un papel empapado en una solución de inhalación de isoflurano hasta que se duerma. A continuación, administrar inmediatamente 100 μL/kg de anestésico combinado MMB por vía intraperitoneal. Confirme el efecto de la anestesia con un pellizco en el dedo del pie y un reflejo de enderezamiento.
   2. Coloque el ratón boca arriba y sujete ambos brazos y pies en el tablero de disección.
   3. Toracotomía de ratón: agarre la piel abdominal con pinzas romas y haga una incisión de 1,0 a 1,5 cm a través de la piel y el peritoneo para exponer la caja torácica. Abra cuidadosamente la caja torácica con unas tijeras evitando dañar el corazón para exponerlo a la perfusión cardíaca.
   4. Fijación de la perfusión cardíaca: Prepare una bomba de perfusión peristáltica y conecte un tubo con una aguja de 19 G x 1•1/2" en un extremo. Llene el tubo con PBS encendiendo la bomba antes de usarlo. Luego, mientras la bomba está funcionando, inserte la punta de la aguja en el ventrículo izquierdo y asegúrela con pinzas. Haga una incisión de 0,5 a 1,0 mm en la aurícula derecha. Perfundir el ratón¹⁸ a una velocidad de 4-6 mL/min durante 5 min con al menos 20 mL de PBS para eliminar la sangre.
   5. Detenga la bomba y transfiera el tubo a una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% en PBS. Vuelva a poner en marcha la bomba a una velocidad de 4-6 mL/min durante 5 min con al menos 20 mL de PFA al 4% en PBS para la fijación¹⁸.
      NOTA: Si la bomba no está disponible, también es posible utilizar una jeringa de 50 ml con una aguja de 19 G x 1•1/2" para la perfusión.
   6. Disección del cerebro: Coloque el ratón sobre su lado ventral en la tabla de disección y exponga el cráneo haciendo una incisión a través de la línea media de la piel desde el área occipital hasta la nariz. Exponga cuidadosamente el cerebro por completo quitando el cráneo con unas tijeras, teniendo cuidado de no dañar el cerebro. Levante el cerebro con pinzas curvas y transfiéralo a un tubo de 15 mL lleno de 10 mL de PFA al 4 % en PBS.
   7. Incubar el cerebro diseccionado durante la noche en el PFA al 4% en PBS a 4 °C para una fijación completa. Después de esto, incube el cerebro durante la noche en 10 mL de sacarosa al 15% en PBS y transfiéralo a 10 mL de sacarosa al 30% en PBS durante un día adicional en un agitador de balancín. Este reemplazo gradual de sacarosa ayuda a prevenir el daño tisular del hielo cuando el cerebro se almacena posteriormente en un congelador.
   8. Incrustación cerebral: Incrustar el cerebro coronalmente en un medio de inclusión dentro de un molde de inclusión de tejido y luego congelar usando 2-metilbutano con hielo seco¹⁹.
   9. Secciones de cerebro congeladas: Usando un criostato, monte secciones coronales en serie (20 μm de grosor) del cerebro incrustado en un vidrio deslizante con carga positiva. Las secciones del cerebro se secan completamente al aire a temperatura ambiente durante la noche y se almacenan en un congelador a -80 °C.
   10. Preparación del tampón de bloqueo: Mezcle 10% de suero de ternero recién nacido, 30 mg/mL de albúmina bovina, 10 mg/mL de glicina y 0,4% de Triton X-100 en TBS para crear el tampón de bloqueo. Almacenar a 4 °C hasta 2 semanas antes de su uso.
   11. Tinción de IgG en ratón: Después de secar al aire las secciones de la corteza cerebral heridas por arma blanca a temperatura ambiente durante 1 h, se fijan posteriormente con 500 μL de PFA al 4% por portaobjetos durante 30 min. A continuación, lavar la sección con PBS (500 μL/portaobjetos) durante 5 minutos, seguido de dos lavados con solución salina tamponada con Tris (TBS, 500 μL/portaobjetos) durante 5 minutos cada uno.
       NOTA: Realice todos los procedimientos en una caja humectante para evitar que los tampones se evaporen.
   12. Extinguir la actividad enzimática endógena en secciones con 10% de metanol y 3% de peróxido de hidrógeno en TBS durante 5 min, seguidas de dos lavados con solución salina tamponada con Tris (TBS, 500 μL/portaobjetos) durante 5 min cada una.
   13. Realice el bloqueo con un tampón de bloqueo (500 μL/portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica del anticuerpo. A continuación, incubar las secciones con un anticuerpo IgG de ratón conjugado con biotina (dilución 1:300 con el tampón bloqueante, 300 μL/portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente.
   14. Durante la incubación con el anticuerpo IgG de ratón, prepare la mezcla de 1 μL de reactivo A y 1 μL de reactivo B del kit del sistema de peroxidasa a base de avidina/biotina en 300 μL del tampón de bloqueo. Incubar esta mezcla durante 30 minutos a temperatura ambiente antes de usarla. Una vez completada la incubación de los anticuerpos IgG en ratones, lavar las secciones con TBS durante 5 min, tres veces. A continuación, incubar las secciones con la mezcla preparada de reactivo A y B (300 μL/portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente.
   15. Lavar las secciones con 0,1 M de Tris-HCl pH 8,0 durante 5 min, tres veces, en el transcurso de 1 h. A continuación, revele el color utilizando 3,3'-diaminobenzidina (DAB) al 0,05% en peróxido de hidrógeno al 0,05% con 0,1 M de Tris-HCl añadido pH 8,0 (500 μL/portaobjetos) durante 5 min a 1 h (Figura 2A). Observe bajo un microscopio el cambio de color antes de detener la reacción.
   16. Lave las secciones con Tris-HCl 0.1 M pH 8.0 durante 5 min tres veces, y seque las secciones al aire durante 15 min. A continuación, deshidrate las secciones sumergiéndolas en etanol al 95% durante 2 minutos dos veces, seguidas de etanol al 100% durante 2 minutos, dos veces. Limpie las secciones en xileno durante 5 minutos dos veces. Cubra las secciones con un medio de montaje insoluble en agua y deje que se sequen.
   17. Análisis de la intensidad de la tinción de IgG en ratones: Captura de imágenes de las secciones utilizando un microscopio con un objetivo de 20x.
   18. Con el software ImageJ, cuantifique la intensidad de la tinción midiendo los valores medios de gris en cinco campos seleccionados al azar (8 × 8 μm² para cada uno) de regiones teñidas inmunoenzimáticamente en cada sección. Normalice la intensidad de la tinción utilizando el valor medio de gris de cada contralateral; No hay ninguna región herida como corrección de fondo. Calcule el promedio de los valores medios de gris normalizados de los cinco campos para determinar el valor medio de gris de la tinción de IgG de ratón para cada sección.
2. Evaluación de la fuga de azul de Evans al parénquima cerebral
   NOTA: El protocolo azul de Evans es similar al método descrito anteriormente¹¹. El dextrano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) también funciona para la recuperación de la descomposición de la BBB¹⁰.
   1. Inyección de azul de Evans: Administrar azul de Evans al 2% en PBS (3 mL/kg) al ratón herido por puñalada a través de la vena de la cola 1 h antes de la disección.
   2. Extracción de cerebro fresco: 1 h después de la administración de azul de Evans, perfundir el ratón con PBS como se describe en los pasos 2.1.1-2.1.4. A continuación, disecciona y corta el cerebro fresco coronalmente en secciones de 1 mm de grosor con una cortadora de cerebros. Seleccione cuatro cortes y recortes de piezas de cerebro (1 mm² cuadrados, cada una) que incluyan la región de la herida de la puñalada o las regiones intactas en la corteza cerebral sin herida, de acuerdo con el papel cuadriculado (Figura 1D).
   3. Cuantificación con azul de Evans: Recoger las cuatro piezas de cerebro en un tubo de 1,5 mL y homogeneizarlas con 200 μL de ácido tricloroacético utilizando un triturador de tejidos. Centrifugar el homogeneizado a 10.000 x g a 4 °C durante 20 min. A continuación, recoja el sobrenadante con una pipeta y dilúyalo con 600 μL de etanol. Prepare una curva estándar de azul de Evans, que oscile entre 0 y 1,0 ng/mL, para cuantificar su concentración. Mida la intensidad de fluorescencia a 680 nm con una longitud de onda de excitación de 620 nm utilizando un lector de placas.

3. Evaluación del nivel de inflamación en el cerebro después de una herida por arma blanca

1. Tinción inmunoenzimática de una sección de cerebro herida por arma blanca para células gliales
   1. Preparación de las secciones cerebrales: Prepare las secciones cerebrales con portaobjetos montados como se describe en los pasos 2.1.1-2.1.9.
   2. Tinción glial: Después de secar al aire las secciones de la corteza cerebral heridas por puñaladas durante 1 h, fije las secciones nuevamente con PFA al 4% (500 μL/portaobjetos) durante 30 minutos. A continuación, lave las secciones con PBS (500 μL/portaobjetos) durante 5 minutos, seguidas de dos lavados con TBS (500 μL/portaobjetos) durante 5 minutos cada una.
   3. Extinguir la actividad enzimática endógena en secciones con 10% de metanol y 3% de peróxido de hidrógeno en TBS durante 5 min, seguidas de dos lavados con solución salina tamponada con Tris (TBS, 500 μL/portaobjetos) durante 5 min cada una.
   4. Realice el bloqueo con un tampón de bloqueo (500 μL/portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica del anticuerpo.
   5. Incubar las secciones durante la noche con el anticuerpo primario (300 μL/portaobjetos). Utilice las siguientes diluciones para el anticuerpo primario: dilución 1:3.000 para Iba1 y dilución 1:1.000 para GFAP, diluidos en el tampón de bloqueo.
   6. Lave la sección tres veces con TBS durante 5 minutos cada una. A continuación, incubar con el anticuerpo secundario conjugado con biotina (dilución 1:300 con el tampón de bloqueo, 300 μL/portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente.
   7. Durante la incubación con el anticuerpo secundario, prepare la mezcla de 1 μL de reactivo A y 1 μL de reactivo B del kit del sistema de peroxidasa a base de avidina/biotina en 300 μL del tampón de bloqueo. A continuación, incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de usarla.
   8. Una vez completada la incubación del anticuerpo secundario, lavar las secciones tres veces con TBS durante 5 minutos cada una e incubar las secciones con la mezcla preparada de reactivos A y B (300 μL/portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente.
   9. Lavar las secciones con 0,1 M de Tris-HCl pH 8,0 durante 5 min, tres veces, en el transcurso de 1 h. A continuación, revele el color utilizando un DAB al 0,05 % en 0,1 M de Tris-HCl con peróxido de hidrógeno al 0,05 % y un pH 8,0 (500 μL/portaobjetos) durante 30 minutos a 3 h. Observe bajo un microscopio el cambio de color antes de detener la reacción.
   10. Lave las secciones con Tris-HCl 0.1 M pH 8.0 durante 5 min tres veces, y seque las secciones al aire durante 15 min. Después de eso, deshidrate las secciones sumergiéndolas en etanol al 95% durante 2 minutos dos veces, seguidas de etanol al 100% durante 2 minutos, dos veces. Limpie las secciones en xileno durante 5 minutos dos veces. Cubra las secciones con un medio de montaje insoluble en agua y deje que se sequen. Capture las imágenes de la sección con el microscopio con un objetivo de 20x.
2. Tinción inmunofluorescente de una sección de cerebro herida por una puñalada para células gliales
   1. Preparación de las secciones cerebrales: Prepare las secciones cerebrales con portaobjetos montados como se describe en los pasos 2.1.1-2.1.9.
   2. Tinción glial: Después de secar al aire las secciones de la corteza cerebral heridas por puñaladas durante 1 h, fije las secciones nuevamente con PFA al 4% (500 μL/portaobjetos) durante 30 minutos. A continuación, lave las secciones con PBS (500 μL/portaobjetos) durante 5 minutos, seguidas de dos lavados con TBS (500 μL/portaobjetos) durante 5 minutos cada una. Realice el bloqueo con un tampón de bloqueo (500 μL/portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica del anticuerpo.
   3. Incubar las secciones durante la noche con el anticuerpo primario (300 μL/portaobjetos). Utilice las siguientes diluciones para el anticuerpo primario: dilución 1:3.000 para Iba1 y dilución 1:1.000 para GFAP, diluido en tampón de bloqueo.
   4. Lave la sección tres veces con TBS durante 5 minutos cada una. A continuación, incubar con el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia (dilución 1:300 con el tampón de bloqueo, 300 μL/portaobjetos) durante 1 h a temperatura ambiente.
   5. Lave las secciones tres veces con TBS durante 5 min cada una e incube las secciones con 0,4 μg/mL de solución DAPI en TBS (500 μL/portaobjetos) durante 5 min a temperatura ambiente.
   6. Lavar las secciones con TBS (500 μL/portaobjetos) durante 5 min, y con agua destilada (500 μL/portaobjetos) durante 5 min. Después de secar las secciones al aire durante 15 minutos, cúbralas con un medio de montaje a base de agua y deje que se sequen. Capture las imágenes de la sección con un microscopio confocal con un objetivo de 20x.
3. qPCR en tiempo real para marcadores de células gliales y citocinas inflamatorias
   NOTA: Las secuencias de cebadores 16,20,21,22 utilizadas en el protocolo presentado se enumeran en la Tabla 1.
   1. Preparación de tejido cerebral fresco: Perfundir el ratón con PBS como se describe en los pasos 2.1.1-2.1.4. A continuación, extrae y corta el cerebro fresco coronalmente en secciones de 1 mm de grosor con un cortador de cerebros. Seleccione cuatro cortes y corte piezas de cerebro (1 mm² cuadrados, cada una) que incluyan la región de la herida de la puñalada o regiones intactas en el lado contralateral de la corteza cerebral, según el papel cuadriculado. Determine la región a cortar, que incluye la lesión en el centro (Figura 1D).
   2. Extracción de ARN: Recoger las cuatro piezas cerebrales en un tubo de 1,5 mL y homogeneizarlas con 1 mL de reactivo TRIzol mediante pipeteo. Incubar la mezcla durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, añada 200 μL de cloroformo, potencie en vórtice e incube durante 2 minutos más a temperatura ambiente. Centrifugar la mezcla a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C. Transfiera con cuidado la capa superior transparente a un nuevo tubo de 1,5 ml, evitando los precipitados blancos, que contienen ADN y proteínas.
   3. Agregue 500 μL de isopropanol a la capa superior recolectada, mezcle bien e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C, retire el sobrenadante y agregue 1 mL de etanol al 70% para lavar el pellet de ARN. Centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 °C, retirar completamente el sobrenadante y secar al aire el pellet durante 10 min. Disuelva el pellet de ARN en 15 μL de agua libre de ARNasa y desnaturalice el ARN durante 10 min a 55 °C.
   4. Mida la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro de microvolúmenes. Almacene el ARN a -80 °C inmediatamente.
   5. Síntesis de ADNc: Para la síntesis de ADNc, utilice un kit de síntesis de ADN disponible en el mercado. Prepare un total de 10 μL de tampón de reacción en un tubo de 1,5 μL para cada muestra, que incluye 2 μL de 5 x tampón RT, 0,5 μL de mezcla de enzimas RT, 0,5 μL de mezcla de cebador, 1 μg de ARN y agua sin nucleasas. Incubar a 37 °C durante 15 min para la reacción de transcripción inversa y a 98 °C durante 5 min para la reacción de inactivación enzimática. A continuación, añada 90 μL de agua sin nucleasas en el tampón y mezcle bien. Almacene la solución de ADNc a -20 °C.
   6. Cuantificación de la expresión de ARN: Para el análisis de qPCR en tiempo real, utilice un kit de mezcla maestra de qPCR disponible en el mercado. Prepare la solución de mezcla para cada muestra combinando 5 μL de KOD SYBR qPCR Mix, 0,4 μL de cebador directo de 5 μM, 0,4 μL de cebador inverso de 5 μM y 0,2 μL de 50 x ROX en 2 μL de agua sin nucleasa.
   7. Haga una mezcla de 2 μL de solución de ADNc y 8 μL de solución Mix en un tubo de 8 tiras, mezcle bien y centrifuga.
   8. Inicie la reacción de PCR con las siguientes condiciones de ciclo: 98 °C durante 2 min, seguido de 40 ciclos de 98 °C durante 10 s, 60 °C durante 10 s y 68 °C durante 30 s. Realice el paso de análisis de la curva de fusión/disociación utilizando una máquina de qPCR en tiempo real.
   9. Análisis de la expresión de ARNm: Analice el nivel de expresión de ARNm utilizando el método 2-Delta-Delta-Ct, que se realiza por normalización con un gen de limpieza, Gapdh, y luego con el del lado contralateral²³.

Resultados

Para analizar la recuperación de la ruptura de la BHE, se evaluó el nivel de hemorragia en las cortezas cerebrales heridas por arma blanca midiendo el nivel de extravasación de IgG sérica a los 1, 3, 5 y 7 días después de la lesión cerebral. Las imágenes de tinción de IgG en ratones revelaron fugas de sangre y depósitos en las cortezas cerebrales después de una lesión cerebral. Esto se redujo después de más de 7 días, a medida que la BHE se recuperó y la proteína IgG se ...

Discusión

Aquí, se introdujo un protocolo para crear un modelo de ratón con LCT utilizando agujas. Este protocolo permite una evaluación cuantitativa de la recuperación de la ruptura de la BHE y la inflamación después de una lesión cerebral utilizando enfoques histológicos y biológicos moleculares. También se pueden utilizar protocolos alternativos, como el modelo de traumatismo craneoencefálico por conmoción cerebral repetitiva y el modelo de traumatismo craneoencefálico con caída d...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
19 G x 1•1/2" needle	TERUMO	NN-1938R
27 G x 3/4" needle	TERUMO	NN-2719S
anti-GFAP antibody	Sigma-Aldrich	G9269
anti-Iba1 antibody	Wako	019-19741
Atipamezole Hydrochloride	Nippon Zenyaku Kogyo		Product name: Antisedan
Biotin-conjugated mouse IgG antibody	Vector Laboratories	BA-9200
Biotin-conjugated rabbit IgG antibody	Vector Laboratories	BA-1000
Bovine albumin	Nacalai tesque	01860-07
Brain Slicer	Visikol	BSLM-2
Butorphanol Tartrate	Meiji Animal Health		Product name: Vetorphale 5 mg
Confocal microscope	Zeiss	LSM700
Cryostat	Leica	CM1520
DAB	Sigma-Aldrich	D5637-1G
DAPI	Roche	10236276001
Evans blue	Wako	056-04061
Fluorescent-conjugated rabbit IgG antibody	Invitrogen	A-21206
Fluoromount-G	Invitrogen	4958-02	Water-based mounting medium
Isoflurane Inhalation Solution	Viatris	v002139
KOD SYBR qPCR Mix	TOYOBO	QKD-201	qPCR master mix kit
Medetomidine	Nippon Zenyaku Kogyo		Product name: Domitor
Microscope	Olympus	FSX100
Microvolume spectrophotometer	ThermoFisher Scientific	NanoDrop One
Midazolam 10 mg/2 mL	Sandoz	1124401A1060
MOUNT QUICK	Daido Sangyo	DM01	Water insoluble mounting medium
Newborn calf serum	Gibco	16010159
O.C.T. compound	Sakura Finetek Japan	45833	Embedding medium
Peel-A-Way, Truncated 22 mm Square Top	Ted Pella	27118	Tissue embedding mold
Peristaltic perfusion pump	ATTO	SJ-1211
Plate reader	Fisher Scientific	Cytation 3
Real-time qPCR machine	ThermoFisher Scientific	StepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT Kit	TOYOBO	FSQ-101	cDNA synthesis kit
Superfrost Plus Slide Glass	Fisher Scientific	12-550-15	Positive-charged slide glass
Suture with needle	Alfresa	HT2003NA75-KF2
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596026
VECTASTAIN ABC Standard Kit	Vector Laboratories	PK-4000	Avidin/biotin-based peroxidase system kit