JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

نصف إجراء لتقييم قدرة العوامل الدوائية على توليد خلايا متغصنة من خلايا شجيرية ساذجة مشتقة من الخلايا الأحادية في المختبر والتحقق من فعاليتها عن طريق توليد الخلايا التائية التنظيمية الذاتية.

Abstract

الخلايا التغصنية التحملية (tolDCs) هي مجموعة فرعية من الخلايا التغصنية (DCs) المعروفة بتأثيرها على الخلايا التائية الساذجة نحو النمط الظاهري للخلية التائية التنظيمية (Treg). تخضع TolDCs حاليا للتحقيق كعلاجات للمناعة الذاتية والزرع ، كعلاج خلوي وطريقة لحث tolDCs من DCs الداخلية. ومع ذلك ، حتى الآن ، فإن عدد العوامل المعروفة لتحفيز tolDCs من DCs الساذجة صغير نسبيا وكانت فعاليتها في توليد Tregs in vivo غير متسقة ، لا سيما العلاجات التي تحفز tolDCs من DCs الداخلية. يوفر هذا فرصة لاستكشاف مركبات جديدة لتوليد التسامح.

نصف هنا طريقة لاختبار المركبات المعدلة للمناعة الجديدة على DCs المشتقة من الخلايا الأحادية (moDCs) في المختبر والتحقق من صحة وظائفها لتوليد Tregs ذاتية المنشأ. أولا ، نحصل على PBMCs ونعزل الخلايا الوحيدة CD14 + والخلايا التائية CD3 + باستخدام مجموعات الفصل المغناطيسي المتوفرة تجاريا. بعد ذلك ، نقوم بتمييز الخلايا الوحيدة إلى moDCs ، ونعالجها باستخدام معدل مناعي راسخ ، مثل الرابامايسين أو الديكساميثازون أو IL-10 أو فيتامين D3 ، لمدة 24 ساعة ونختبر تغييرها في علامات التحمل كتحقق من صحة البروتوكول. أخيرا ، نشارك في زراعة tolDCs المستحثة مع الخلايا التائية الذاتية في وجود تحفيز مضاد ل CD3 / CD28 ونلاحظ التغيرات في مجموعات Treg وتكاثر الخلايا التائية. نتصور استخدام هذا البروتوكول لتقييم فعالية العوامل المناعية الجديدة لإعادة برمجة DCs المتمايزة بالفعل نحو tolDC.

Introduction

الخلايا المتغصنة (DCs) هي وسطاء حاسمون بين المناعة الفطرية والتكيفية. DCs ، التي توجد بشكل أساسي في الأغشية المخاطية والجلد والأنسجة اللمفاوية ، هي الخلايا العارضة للمستضد الأولية (APCs)1. تمتص DCs البروتينات الغريبة وتعالجها وتقدمها على بروتينات التوافق النسيجي الرئيسية (MHC) للخلايا التائية الساذجة. تعبر DCs على وجه التحديد عن بروتينات معقد التوافق النسيجي الكبير من الفئة الثانية ، مثل مستضد الكريات البيض البشرية DR (HLA-DR) في البشر. تعد حالة تنشيط الترابط المستمر عند التعرض للمستضد أمرا بالغ الأهمية لاستجابة الخلايا التائية النهائية2. تعبر DCs غير الناضجة عن مستقبلات التعرف على الأنماط المختلفة (PRRs) التي تتعرف على فئات الجزيئات التي تسمى الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) ، مثل مكون الجدار البكتيري ، عديد السكاريد الدهني (LPS) 3. عند تحفيز PRR ، تصبح DCs ناضجة وتقوم بتنظيم البروتينات التحفيزية المشتركة للخلايا التائية المهمة ، مثل CD80 و CD86 و CD40 ، وتفرز السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل عامل نخر الورم ألفا (TNFα) ، مما يسهل تمايز الخلايا التائية الساذجة إلى مستجيب تقليدي أو خلايا تائية مساعدة2. على العكس من ذلك ، إذا توقف نضج التيار المستمر أو إذا تطورت البلدان النامية في بيئة تحمل ، يمكن للبلدان النامية أن تولد حالة تيار مستمر (tolDCs)4. تقلل TolDCs من تنظيم مستقبلات الخلايا التائية الكلاسيكية المشاركة في تنظيم مستقبلات التسامح مثل ترابط موت الخلايا المبرمج 1 (PD-L1) ومخفف الخلايا الليمفاوية B و T (BTLA) وتوليد السيتوكينات المثبطة مثل الإنترلوكين 10 (IL-10) وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β) 4. هذه ليست قائمة شاملة بعلامات التسامح ، وفي الواقع ، هناك إجماع محدود حول علامات tolDC المناسبة لتحديد حالة tolDC5. بالنظر إلى ذلك ، نقترح توليد الخلايا التائية التنظيمية (Treg) كعلامة وظيفية يجب استخدامها لمقارنة فعالية عوامل الحث المختلفة tolDC.

بالإضافة إلى حالات تنشيط التيار المستمر / الناضجة ، يمكن أيضا تصنيف DCs بناء على نسبها أو موقع الأنسجة ، حيث تعرض كل مجموعة فرعية وظائف مختلفة قليلا. في حين أن تقسيم tolDC / DC الناضج أقل تحديدا وموجود أكثر كسلسلة متصلة ، فإن أقسام النسب لها علامات محددة جيدا في كل من الإنسان والفئران. تتشكل سلائف التيار المستمر في نخاع العظام ، ولكن هناك نوعان فرعيان رئيسيان من DCs بناء على نسبها: 1) الخلايا المتغصنة البلازمية (pDCs) ، والتي تستمد من السلالات اللمفاوية و 2) الخلايا المتغصنة التقليدية (cDCs) ، والتي تستمد من السلالات النخاعية. في البشر ، تنضج pDCs في الأعضاء اللمفاوية ، وتعبر عن CD303 ، وتستجيب بشكل كبير للالتهابات الفيروسية6. وفي الوقت نفسه ، تنضج CD11c التي تعبر عن cDCs في الأنسجة المحيطية وتوجد في نوعين فرعيين متميزين ، CD1c + cDC1s و CD141 + cDC2 ، والتي يولد كل منهما استجابات مميزة للخلاياالتائية 7. علاوة على ذلك ، يمكن أن توجد جميع cDCs في الحالات الفرعية المقيمة في الأنسجة (CD103-) أو المهاجرة (CD103 +)8. أخيرا ، في ظل ظروف معينة ، يمكن تحفيز الخلايا من سلالات الخلايا الوحيدة (CD14 +) نحو النمط الظاهري للخلية المتغصنة ويتم تحديدها على أنها CD14- و CD141 + و CD1c + 9. هذه الخلايا ، المعروفة باسم DCs المشتقة من الخلايا الوحيدة (moDCs) ، هي الأكثر استخداما لتحليل خارج الجسم الحي في البشر حيث تشكل الخلايا الوحيدة ما يقرب من 10-30٪ من خلايا الدم المحيطية البشرية أحادية النواة (PBMCs) ، بينما تشكل pDCs 1-3٪ 10 فقط. هذا يجعل moDCs خيارا جذابا ، ولكن من المعروف أيضا أن moDCs أكثر التهابا من cDCs النموذجية المعزولة من الأنسجةالأولية 9.

يوجد حاليا فئتان عريضتان من الجهود المبذولة لتوظيف tolDCs لتوليد التسامح السريري. أولا ، يتم إنشاء tolDCs من الخلايا الوحيدة لاستخدامها كعلاج للخلايا. في هذا النموذج ، يتم تمييز moDCs عادة باستخدام IL-4 / GM-CSF بالتزامن مع معدلات المناعة مثل فيتامين D3 أو الرابامايسين (rapa) أو IL-10 أو ديكساميثازون أو مجموعات من هؤلاء11،12. تم استكشاف tolDCs هذه كعلاجات خلوية ذاتية للمناعة الذاتية وعمليات الزرع13. الاستخدام الآخر ل tolDCs هو إعادة برمجة DCs الداخلية تجاه tolDCs باستخدام الأدوية المجانية أو الناقلات النانوية لتقديم كل من معدل المناعة والمستضد ذي الأهمية14،15،16. ومع ذلك ، فإن تحريض DCs المتمايزة بالفعل هو أكثر صعوبة ، نظرا لتطوير أنماط ظاهرية استقلابية قوية من DCs والتي تتناقض عادة مع استقلاب tolDC17،18. هذا مستوى مرتفع لمعظم معدلات المناعة الدوائية. لهذا السبب ، تشير معظم دراسات إعادة برمجة التيار المستمر الداخلية إلى قمع فعال للتيار المستمر وغالبا ما يكون بعض تحريض Treg ، ولكنها تفتقر إلى النجاح السريري ، غالبا بسبب نقص ثبات الخلايا التائية15،19،20. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى استراتيجيات لتحديد عوامل تحريض tolDC المحتملة من DCs الحالية.

هنا ، نقدم طريقة للتقييم المختبري للعوامل المعدلة للمناعة مقابل moDCs المتمايزة مع المقياس النهائي لتحريض Treg الذاتي. تم تصميم هذا البروتوكول لتقييم فعالية العوامل المعدلة للمناعة لإعادة برمجة moDCs البشرية المتمايزة بالفعل نحو التسامح. علاوة على ذلك ، يتحقق هذا البروتوكول من صحة وظائف tolDCs المعاد برمجتها لإنشاء Tregs مقابل خلايا T ذاتية المنشأ معزولة من نفس عينة PBMC. هذا على عكس البروتوكولات الأخرى التي تحفز التسامح أثناء التمايز و / أو تحدي tolDCs مع الخلايا التائية من المتبرعين الخيفي21. في هذا البروتوكول ، نستخدم عامل التسامح المشترك rapa كمثال ولكننا نوضح أيضا الفعالية المحدودة ل moDCs المعالجة بالرابا لتوليد Tregs. في نتائجنا التمثيلية ، نظهر أيضا فعالية العلاجات المناعية الشائعة الأخرى مثل IL-10 وديكساميثازون وفيتامين D3. نتصور استخدام هذا البروتوكول لفحص عوامل تحريض tolDC التي يحتمل أن تكون أكثر فاعلية مقابل moDCs22 التي تم إنشاؤها بالفعل.

Protocol

تم الحصول على جميع عينات الخلايا أحادية النواة للدم المحيطي البشري (PBMC) من مركز المناعة البشرية بجامعة بنسلفانيا من متبرعين مجهولي الهوية بموافقة مسبقة من مجلس المراجعة المؤسسية بجامعة بنسلفانيا (IRB) بموافقة المريض.

اختياري: بينما في هذه الطريقة ، استخدمنا PBMCs المعزولة حديثا التي تم الحصول عليها من مختبر أكاديمي ، يمكن عزل PBMCs إما من الدم الكامل أو منتجات الدم المخصبة بفصادة الكريات الدم. نوصي باستخدام طريقة الطرد المركزي لتدرج الكثافة ، حيث أن هذه طريقة راسخة وموثوقة موصوفة في مكان آخر23.

1. عزل الخلايا الوحيدة / الخلايا التائية وتمايز moDC

  1. عزل الخلايا الوحيدة والخلايا التائية من PBMCs - اليوم 1
    1. الحصول على 200 مليون PBMCs بشرية من متبرع سليم. احتفظ بالخلايا في أنبوب سعة 15 مل وانقلها على الثلج.
    2. Aliquot 50 مل من عازلة الفصل (متوفرة في مجموعات الفصل المتاحة تجاريا) في أنبوب مخروطي الشكل.
      ملاحظة: يمكن أيضا استبدال المخزن المؤقت للفصل ب DPBS بمصل بقري جنيني بنسبة 2٪ (FBS) و 1 ملي مولار حمض إيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
    3. قم بإزالة أنبوب PBMC من الجليد واملأه ب Separation Buffer. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. شفط المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. أعد تعليق حبيبات الخلية في 4 مل من الوسط الموصى به باستخدام ماصة مصلية.
    5. قسم التعليق إلى أنبوبين مختلفين سعة 15 مل ، مع إضافة 2 مل لكل أنبوب (5 × 107 خلايا / مل لكل أنبوب). قم بتسمية أنبوب واحد "T" والآخر "الخلايا الأحادية".
    6. استرجع مجموعة عزل الخلايا الأحادية البشرية واتبع بروتوكول الشركة المصنعة لعزل الخلايا الوحيدة من الأنبوب المسمى أحادي الخلية.
    7. استرجع مجموعة عزل الخلايا التائية البشرية واتبع بروتوكول الشركة المصنعة للأنبوب الثاني لعزل الخلايا التائية.
  2. طلاء الخلايا الوحيدة لتمايز وتجميد الخلايا التائية - اليوم 1
    1. سخن 50 مل من وسط ثقافة moDC (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق على الأقل.
    2. الطرد المركزي الأنابيب سعة 15 مل مع الخلايا الوحيدة المخصبة والأنبوب 15 مل مع الخلايا التائية من الخطوة 1.1 عند 250 × جم لمدة 5 دقائق.
    3. شفط المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا الوحيدة في 1 مل من وسيط ثقافة moDC والخلايا التائية في وسط زراعة الخلايا التائية (الجدول 1) عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. تأكد من تشتيت الحبيبات بشكل صحيح.
    4. عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي أو مقياس الدم اليدوي باستخدام تلطيخ التربان الأزرق.
      ملاحظة: بالنسبة للبيانات التمثيلية ، تم عزل 10 ملايين خلية تائية و 3 ملايين خلية وحيدية.
    5. خذ الأنبوب مع الخلايا الوحيدة وأضف 9 مل من وسيط ثقافة moDC الدافئ إلى التعليق للحصول على حجم نهائي يبلغ 10 مل. ثم أضف 100 ميكرولتر لكل من 10 ميكروغرام / مل من مخزون GM-CSF و 10 ميكروغرام / مل من مخزون IL-4 للحصول على تركيز نهائي قدره 100 نانوغرام / مل من كل من GM-CSF و IL-4 في الوسائط. انقل المعلق إلى طبق بتري وقم بتسميته باسم "moDC" (اليوم 1) واحتضانه عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    6. خذ أنبوب الخلية التائية واخلط 1 مل من وسط تجميد الخلايا التائية (الجدول 1) مع 1 مل من تعليق الخلايا التائية. يقسم إلى اثنين من cryovials سعة 2 مل (1 مل / قارورة) ؛ ختم بإحكام (التركيز النهائي ل 5 ملايين خلية لكل قارورة). ضع المبردات في غرفة تجميد مع أنابيب موازنة في آبار غير مستخدمة. قم بتخزين الحجرة في درجة حرارة -80 درجة مئوية طوال الليل ، ثم انقل المبردات إلى خزان تبريد.
    7. في اليوم 4 ، قم بتحديث الوسط بإضافة 5 مل من وسيط ثقافة moDC الطازج وأضف 100 ميكرولتر لكل من مخزون GM-CSF و IL-4. ستكون moDCs المتمايزة جاهزة في اليوم 7.

2. إضافة أدوية معدلة للمناعة لتوليد moDCs تحمل المنشأ

  1. قم بإعداد لوحة moDC.
    1. في اليوم 7 ، استرجع moDCs المتمايزة من الحاضنة وانقل تعليق خلية moDC إلى أنبوب سعة 50 مل.
    2. جهاز الطرد المركزي التعليق عند 250 × جم لمدة 5 دقائق. قم بشفط المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسائط ثقافة moDC الدافئة عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وتخفيف الخلايا إلى تركيز 3 × 105 خلايا / مل في وسط ثقافة moDC دافئ يحتوي على 100 نانوغرام / مل GM-CSF و IL-4.
    3. أضف 3 × 104 خلايا / بئر في 100 ميكرولتر إلى العدد المطلوب من الآبار في صفيحة زراعة الأنسجة ذات القاع المسطح 96 بئر.
      ملاحظة: بالنسبة للنتائج التمثيلية، استخدمنا ما مجموعه 48 بئرا (أربعة شروط تم إجراؤها في ثلاث مرات أعدت لأربعة تحليلات مختلفة في القسمين 3 و 4)، ولكن يمكن تعديل ذلك لما يصل إلى 60 بئرا. املأ جميع الآبار المتبقية ب 100 ميكرولتر / بئر PBS لمنع الجفاف ، وخاصة الآبار الخارجية. نوصي بإعداد لوحات مختلفة لكل طريقة من طرق التحليل.
    4. أضف 1 ميكرولتر / بئر من الأدوية المعدلة للمناعة إلى الآبار المرغوبة (هنا 10 نانوغرام / مل رابا). احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: إذا كنت تتضمن التحفيز المناعي في اليوم 8 ، فقم بإعداد الآبار للدواء المناعي مع وبدون التحفيز المناعي. يعد استخدام التحفيز المناعي للناضجين أمرا اختياريا.
  2. إعادة إذابة الخلايا التائية.
    1. في اليوم 8 ، استرجع اثنين من cryovials من خزان التبريد وقم بإذابة الجليد في حمام حبة ساخن أو حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى تبدأ المحتويات في الذوبان (في <3 دقائق).
    2. عندما تبدأ المحتويات في الذوبان ، انقل القوارير إلى غطاء مزرعة الخلايا وأنبوب 1 مل من وسائط زراعة الخلايا التائية الدافئة في القارورة لإذابة الجليد بسرعة. انقل محتويات القارورة بالكامل إلى أنبوب سعة 50 مل. اشطف المبردات ب 1 مل من وسط زراعة الخلايا التائية لضمان نقل جميع الخلايا إلى الأنبوب.
    3. قم بتعبئة التعليق بمحلول تلطيخ التدفق (الجدول 1) إلى 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 10 دقائق وشفط المادة الطافية. ثم, أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من محلول تلطيخ التدفق وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.
    4. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط زراعة الخلايا التائية الدافئة. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم.
      ملاحظة: يجب أن تكون الجدوى >70٪ في هذه المرحلة؛ إذا بقيت كميات كبيرة من الخلايا الميتة ، فقم بنقلها إلى أنبوب جديد ، وأضف 10 مل من محلول صبغة الخلية ، وجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق ، وأعد تعليقها في 1 مل من وسائط الخلايا التائية ، وأعد العد.
    5. أضف 9 مل من وسط زراعة الخلايا التائية الدافئة لعمل حجم نهائي يبلغ 10 مل. انقل المعلق إلى طبق بتري. قم بتسميته على أنه "الخلايا التائية المعاد إذابتها" واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 للسماح للخلايا بالراحة.
  3. اغسل لوحة moDC وأضف المحفز المناعي إذا رغبت في ذلك.
    1. في اليوم 8 ، قم بالطرد المركزي للوحة moDC (من اليوم 7) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. شفط المادة الطافية ، واغسلها باستخدام HBSS الدافئ ، وكرر الطرد المركزي ، والشفط مرة أخرى ، وأعد تعليق الخلايا في وسط ثقافة moDC دافئ يحتوي على GM-CSF و IL-4 (100 ميكرولتر / بئر).
      ملاحظة: احرص على عدم إزعاج الخلايا. قم بإمالة اللوحة أثناء الشفط. يمكن أن يبقى ما يقرب من 10 ميكرولتر في البئر.
    3. في حالة استخدام التحفيز المناعي ، أضف 1 ميكرولتر / بئر من 100x مخزون LPS (أو عامل محفز مناعي آخر) إلى الآبار المرغوبة. احتضان اللوحة طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.

3. تحليل التدفق ل moDC (التحقق + التسامح)

  1. تحليل التدفق للتحقق من صحة moDC
    1. في اليوم 8 ، قم بإعداد كوكتيلات الأجسام المضادة للجنة التحقق من الصحة ، مستهدفة العلامات التالية: HLA-DR و CD14 و الليكتين من النوع C الخاص بالخلايا المتغصنة (DC-SIGN) و CD1c و CD40 كما هو موضح في الجدول 2. تمييع جميع الأجسام المضادة بمحلول صبغة التدفق.
      ملاحظة: تم تصميم اللوحة لمقياس تدفق الليزر الأحمر / الأزرق ذو 7 قنوات.
    2. استرجع لوحة moDC من الحاضنة. الطرد المركزي للوحة على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة المواد الطافية. اختياري: احتفظ بالمواد الطفية لتحليل ELISA للسيتوكينات IL-10 و TNFα باستخدام المجموعات المتوفرة تجاريا وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
    3. أضف 200 ميكرولتر / بئر من محلول تلطيخ التدفق. جهاز الطرد المركزي للوحة على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. شفط المادة الطافية وأضف 50 ميكرولتر / بئر من الجسم المضاد المثبط لربط مستقبلات Fc المخفف 1: 200 في محلول تلطيخ التدفق لمنع الارتباط غير المحدد. احتضان في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة.
    5. أضف 50 ميكرولتر / بئر من كوكتيل الأجسام المضادة للوحة التحقق من الصحة المحضر.
    6. قم بإعداد أدوات التحكم في التعويض في اللوحة أو في أنابيب سعة 1.5 مل عن طريق خلط 50 ميكرولتر من حبات التعويض مع 50 ميكرولتر من كل جسم مضاد مخفف. احتضان اللوحة عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
      ملاحظة: يتم استخدام حبات التعويض هنا بدلا من الخلايا للتعويض بسبب التعبير المنخفض المحتمل عن العلامات على moDCs.
    7. يغسل عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة التعليق في 200 ميكرولتر من محلول تلطيخ التدفق. قم بغسلتين.
    8. بعد الغسيل النهائي ، قم بجهاز الطرد المركزي مرة أخرى وأعد تعليق الخلايا في 110 ميكرولتر / بئر من محلول تلطيخ التدفق. العينات جاهزة الآن لتحليل قياس التدفق الخلوي.
  2. تحليل التدفق ل moDC (لوحة التسامح)
    1. على غرار الخطوة 3.1 في اليوم 8 ، قم بإعداد كوكتيلات الأجسام المضادة للوحة التسامح ، مستهدفة العلامات التالية: CD86 و PD-L1 و DC-SIGN و CD1c و BTLA و CD40 (الجدول 2).
    2. كرر الخطوات 3.1.2-3.1.8 ، واستبدل كوكتيل الأجسام المضادة بكوكتيل لوحة التسامح .

4. تحليل تدفق الخلايا التائية

  1. اجمع بين الخلايا التائية وخلايا التحمل المعالجة.
    1. في اليوم 9 ، استرجع طبق بتري الخلية التائية المعاد إذابته من الحاضنة وانقل جميع الخلايا التائية إلى أنبوب سعة 50 مل. قم بتعبئة محلول تلطيخ التدفق.
    2. اختياري: في حالة إجراء تحليل تكاثر الخلايا التائية ، قسم الخلايا التائية إلى أنبوبين.
      1. باستخدام الأنبوب الأول ، قم بالدوران لأسفل عند 250 × جم لمدة 5 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية. تلطخ هذا الأنبوب بصبغة تكاثر الخلايا وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
        ملاحظة: استخدمنا صبغة قابلة للإصلاح eFluor 670 ، والتي تتطلب خطوة حضانة مدتها 30 دقيقة ، متبوعة بخطوتي غسيل. نقترح استخدام أنابيب مخروطية سعة 50 مل لمنع فقدان الخلايا واستخدام HBSS مع 10٪ HIFBS للغسيل بعد التلوين.
      2. استخدم الأنبوب الثاني الذي يحتوي على خلايا تائية غير ملطخة لتحليل Treg. وبالمثل ، قم بالدوران عند 250 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليقها في وسط زراعة الخلايا الدافئة ، واحتفظ بها في الحاضنة أثناء عملية التلوين. إذا لم تكن هناك حاجة إلى تكاثر الخلايا التائية ، فقم بتدوير جميع الخلايا التائية واستبدلها بوسائط زراعة الخلايا التائية الدافئة.
    3. عد الخلايا واحصل على ما لا يقل عن 4 ملايين (لتحليل Treg فقط) أو 8 ملايين (لتحليل انتشار Treg و T).
    4. استرجع لوحة moDC من الحاضنة مع الآبار المتبقية ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وقم بتقطيع المواد الطاففة. أضف 200 ميكرولتر / خلايا تائية بئر عند 1.6 × 105 خلايا / بئر. أضف الخلايا التائية غير الملوثة للوحات تحليل Treg والخلايا التائية الملطخة لألواح تكاثر الخلايا التائية.
      ملاحظة: سيحافظ هذا على نسبة خلية T إلى moDC تبلغ 5: 1 ، حيث تتوسع وحدات moDCs الأولية 3 ×104 بشكل طفيف.
    5. أضف 25 ميكرولتر / مل من كوكتيل الأجسام المضادة المضادة ل CD3 / CD28 إلى جميع المجموعات باستثناء آبار التحكم السلبية لتحفيز الخلايا التائية. احتضان اللوحة لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 حتى اليوم 12.
      ملاحظة: تأكد من استخدام الخلايا التائية الملطخة لتحليل التكاثر وغير ملوثة لتحليل Treg.
  2. تحليل تدفق Treg
    1. تلطيخ علامة السطح
      1. في اليوم 12 ، قم بإعداد كوكتيلات الأجسام المضادة للوحة Treg (الجدول 2).
      2. انقل جميع معلقات الخلايا من لوحة الثقافة المكونة من 96 بئرا إلى لوحة قاع على شكل حرف V مع محلول تلطيخ التدفق. احتفظ بالمواد الطافية لتحليل السيتوكين.
      3. اغسل الخلايا 2x عن طريق الطرد المركزي (200 × جم لمدة 5 دقائق متبوعا ب 200 ميكرولتر من محلول بقع التدفق). خصص بعض الخلايا لضوابط التعويض. ضع واحدة جانبا لتلوين FOXP3 وأدوات التحكم غير الملطخة.
        ملاحظة: نقترح تمشيط 10 ميكرولتر من جميع العينات قبل الدوران النهائي في الخطوة 4.2.1.3 للحصول على ضوابط التعويض اللازمة. يوفر هذا عينة تمثيلية لجميع تعبيرات مستوى السطح لكل علامة على الخلايا.
      4. بعد الغسيل الثاني ، قم بجهاز الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة والشفق ، ثم أضف 50 ميكرولتر / بئر الجسم المضاد المثبط لربط مستقبلات Fc (مخفف 1: 200 في محلول تلطيخ التدفق). احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
      5. أضف 50 ميكرولتر / بئر من كوكتيل الأجسام المضادة Treg Panel المحضر.
      6. لعناصر التحكم في التعويض ، امزج 50 ميكرولتر من خلايا التعويض غير الملوثة مع 50 ميكرولتر من كل جسم مضاد ملطخ.
      7. احتضان اللوحة وأدوات التحكم في التعويض عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. اغسل الطبق مرة واحدة باستخدام محلول Flow Stain Solution وجهاز الطرد المركزي على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق.
      8. وصمة عار مع صبغة حية / ميتة قريبة من الأشعة تحت الحمراء مخففة في HBSS (1: 1,000) عند 200 ميكرولتر / بئر. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
      9. اغسل الطبق مرة واحدة بمحلول تلطيخ التدفق (200 ميكرولتر / بئر) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    2. وصمة عار مع FoxP3 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، الأمر الذي سيتطلب حضانة بين عشية وضحاها. لمحة موجزة عن بروتوكول تلطيخ FoxP3 موصوفة أدناه .
      1. قم بإعداد حل عمل التثبيت / النفاذية FoxP3 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. امزج جزءا واحدا من تركيز التثبيت / النفاذية FoxP3 مع 3 أجزاء من تخفيف التثبيت / النفاذية FoxP3. تحضير 200 ميكرولتر من محلول العمل لكل عينة.
      2. احتضان جميع العينات في 200 ميكرولتر / بئر من محلول التثبيت / النفاذية العاملة. اتركيه عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
      3. تحضير 1x النفاذية عازلة: امزج جزءا واحدا من 10x نفاذية المخزن المؤقت (تم الحصول عليه من مجموعة تجارية) مع 9 أجزاء من الماء المقطر.
      4. اغسل الطبق 2x باستخدام 1x permeabilization Buffer (200 ميكرولتر / بئر) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
      5. وصمة عار بالجسم المضاد FoxP3 (PE-Cy5.5 ، تخفيف 1: 300 في 1x النفاذية عازلة): أضف 100 ميكرولتر / بئر من الجسم المضاد FoxP3 المخفف واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
      6. اغسل الطبق 2x باستخدام 1x permeabilization Buffer (200 ميكرولتر / بئر) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
      7. أعد تعليق الخلايا في 110 ميكرولتر / بئر من محلول تلطيخ التدفق.
      8. إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.
  3. تحليل تكاثر الخلايا التائية
    1. قم بإعداد كوكتيلات الأجسام المضادة للوحة انتشار T (الجدول 2).
    2. انقل جميع معلقات الخلايا من لوحة الثقافة المكونة من 96 بئرا إلى لوحة قاع على شكل حرف V مع محلول تلطيخ التدفق. احتفظ بالمواد الطاففية لتحليل السيتوكين.
    3. اغسل الخلايا 2x عن طريق الطرد المركزي (200 × جم لمدة 5 دقائق متبوعا ب 200 ميكرولتر من محلول بقع التدفق). خصص بعض الخلايا لضوابط التعويض. ضع واحدة جانبا لتلوين FOXP3 وأدوات التحكم غير الملطخة.
      ملاحظة: نقترح تمشيط 10 ميكرولتر من جميع العينات قبل الدوران النهائي في الخطوة 4.3.3 للحصول على ضوابط التعويض اللازمة. يوفر هذا عينة تمثيلية لجميع تعبيرات مستوى السطح لكل علامة على الخلايا.
    4. بعد الغسيل الثاني ، جهاز الطرد المركزي (200 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة) والشفط ، ثم أضف 50 ميكرولتر / بئر الجسم المضاد لمثبط ربط مستقبلات Fc (مخفف 1: 200 في محلول تلطيخ التدفق). احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    5. أضف 50 ميكرولتر / بئر من كوكتيل الأجسام المضادة للوحة T Proliferation المحضرة.
    6. لعناصر التحكم في التعويض ، امزج 50 ميكرولتر من خلايا التعويض غير الملوثة مع 50 ميكرولتر من كل جسم مضاد ملطخ.
    7. احتضان اللوحة وأدوات التحكم في التعويض عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. اغسل الطبق مرة واحدة باستخدام محلول Flow Stain Solution وجهاز الطرد المركزي على حرارة 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    8. وصمة عار مع صبغة حية / ميتة قريبة من الأشعة تحت الحمراء مخففة في HBSS (1: 1,000) عند 200 ميكرولتر / بئر. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
    9. اغسل الطبق مرة واحدة بمحلول تلطيخ التدفق (200 ميكرولتر / بئر) عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    10. إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.

النتائج

لقد وصفنا بروتوكولا ل PBMCs البشرية ، وعزل كل من خلايا CD3 + T والخلايا الوحيدة CD14 + باستخدام مجموعات الفصل المغناطيسي المتاحة تجاريا ، وتمييز الخلايا الوحيدة إلى CD14- و HLA-DR + و CD141 + و CD1c + moDCs باستخدام GM-CSF و IL-4 ، ومعالجتها لمدة 24 ساعة ، والزراعة ...

Discussion

نصف هنا طريقة موثوقة ومتعددة الاستخدامات لتقييم وظائف العوامل المعدلة للمناعة لحث tolDCs من moDCs والتحقق من صحة وظائفها لتوليد Tregs من الخلايا التائية الذاتية خارج الجسم الحي. هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أولا ، الخلايا الوحيدة هي خلايا حساسة معروفة...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

Acknowledgements

نود أن نشكر مركز المناعة البشرية (HIC) بجامعة بنسلفانيا على توفير PBMCs بشرية جديدة من المتبرعين. يتم دعم التحالف الدولي للموئل جزئيا من قبل AI045008 المعاهد الوطنية للصحة P30 و P30 CA016520.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-158General Cell Culture
1.5 mL Centrifuge TubeVWR77508-358General Cell Culture
10 mL Serological PipetsVWR414004-267General Cell Culture
100-1000 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-164General Cell Culture
15 mL Conical TubeVWR77508-212General Cell Culture
20-200 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-160General Cell Culture
2-MercaptoethanolMP Biomedical194834T Cell Culture
50 mL Conical TubeVWR21008-736General Cell Culture
60 x 15 mm Dish, Nunclon DeltaThermo Fischer150326General Cell Culture
96 Well Conical (V) Bottom Plate, Non-Treated SurfaceThermo Fischer277143General Cell Culture
96 well Flat Bottom PlateThermo Fischer161093General Cell Culture
APC/Cyanine7 anti-human CD272 (BTLA) AntibodyBiolegend344518Flow Cytometry
Attune NxT (Red/Blue Laser, 7 Channel)Thermo FischerA24863Flow Cytometry
BSAThermo Fischer15260-037General Cell Culture
CD14 Monoclonal Antibody (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Flow Cytometry
CD1c Monoclonal Antibody (L161), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42Flow Cytometry
CD209 (DC-SIGN) Monoclonal Antibody (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42Flow Cytometry
CD25 Monoclonal Antibody (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Flow Cytometry
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Flow Cytometry
CD4 Monoclonal Antibody (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Flow Cytometry
CD69 Monoclonal Antibody (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Flow Cytometry
CD86 Monoclonal Antibody (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Flow Cytometry
CD8a Monoclonal Antibody (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42Flow Cytometry
Conical Bottom (V-well) 96 Well PlateThermo Fischer2605Flow Cytometry
Cryogenic Vials, 2 mLThermo Fischer430488T Cell Culture
Dimethylsulfoxide (DMSO), Sequencing GradeThermo Fischer20688General Cell Culture
DPBSThermo Fischer14200166General Cell Culture
EasySep Human Monocyte Isolation KitStem Cell Technologies19359Cell Separation
EasySep Human T Cell Isolation KitStem Cell Technologies17951Cell Separation
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000Cell Separation
EDTAThermo FischerAIM9260GGeneral Cell Culture
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLStem Cell Technologies38025Cell Separation
Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal AntibodyThermo Fischer14-9161-73Flow Cytometry
Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670701General Cell Culture
Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Flow Cytometry
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SetThermo Fischer00-5523-00Flow Cytometry
FOXP3 Monoclonal Antibody (PCH101), PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42Flow Cytometry
HBSSThermo Fischer14170-112General Cell Culture
Heat Inactivated Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670801General Cell Culture
HEPES (1 M)Thermo Fischer15630106moDC Cell Culture
HLA-DR Monoclonal Antibody (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Flow Cytometry
Human CD3/CD28/CD2 T Cell ActivatorStemCell Technologies10970T Cell Culture
Human GM-CSF Recombinant ProteinThermo Fischer300-03moDC Cell Culture
Human IL-10 ELISA Kit, High SensitivityThermo FischerBMS215-2HSELISA
Human IL-4, Animal-Free Recombinant ProteinThermo FischerAF-200-04moDC Cell Culture
Human PBMC (Freshly Isolated)UPenn HICN/ACells
Human TNF alpha ELISA KitThermo FischerBMS223-4ELISA
Light Microscope (DMi1)Lucia391240General Cell Culture
Lipopolysaccaride (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC Cell Culture
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitThermo FischerL34975Flow Cytometry
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fischer11140050T Cell Culture
Penicillin-Streptomycin (100x)Thermo Fischer15140122General Cell Culture
Pipette ControllerVWR77575-370General Cell Culture
Rapamycin, 98+%Thermo FischerJ62473.MFmoDC Cell Culture
RPMI 1640 with GlutamaxThermo Fischer61870-036General Cell Culture
Separation BufferStem Cell Technologies20144Cell Separation
T Cell Stimulation Cocktail (500x)Thermo Fischer00-4970-93T Cell Culture
UltraComp eBead Plus Compensation BeadsThermo Fischer01-3333-41Flow Cytometry
Variable Pipette SetFischer Scientific05-403-152General Cell Culture

References

  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson, A. E., et al. LPS activation is required for migratory activity and antigen presentation by tolerogenic dendritic cells. J Leukoc Bio. 85 (2), 243-250 (2009).
  4. Iberg, C. A., Hawiger, D. Natural and induced tolerogenic dendritic cells. J Immunol. 204 (4), 733-744 (2020).
  5. Ness, S., Lin, S., Gordon, J. R. Regulatory dendritic cells, T cell tolerance, and dendritic cell therapy for immunologic disease. Front Immunol. 12, 633436 (2021).
  6. Ali, S., et al. Sources of type I interferons in infectious immunity: Plasmacytoid dendritic cells not always in the driver's seat. Front Immunol. 10, 778 (2019).
  7. Fossum, E., et al. Targeting antigens to different receptors on conventional type 1 dendritic cells impacts the immune response. J Immunol. 205 (3), 661-673 (2020).
  8. Kedl, R. M., et al. Migratory dendritic cells acquire and present lymphatic endothelial cell-archived antigens during lymph node contraction. Nat Comm. 8 (1), 2034 (2017).
  9. Chow, K. V., Sutherland, R. M., Zhan, Y., Lew, A. M. Heterogeneity, functional specialization and differentiation of monocyte-derived dendritic cells. Immun Cell Biol. 95 (3), 244-251 (2017).
  10. Johnson, R. K., Overlee, B. L., Sagen, J. A., Howe, C. L. Peripheral blood mononuclear cell phenotype and function are maintained after overnight shipping of whole blood. Sci Rep. 12 (1), 19920 (2022).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction - A comparative study of human clinical-applicable DC. Clinl Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Navarro-Barriuso, J., et al. Vitamin D3-induced tolerogenic dendritic cells modulate the transcriptomic profile of T CD4+ cells towards a functional hyporesponsiveness. Front Immunol. 11, 599623 (2021).
  13. Moorman, C. D., Sohn, S. J., Phee, H. Emerging therapeutics for immune tolerance: Tolerogenic vaccines T cell therapy, and IL-2 therapy. Front Immunol. 12, 657768 (2021).
  14. Kenison, J. E., et al. Tolerogenic nanoparticles suppress central nervous system inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (50), 32017-32028 (2020).
  15. Neshat, S. Y., et al. Improvement of islet engrafts via Treg induction using immunomodulating polymeric tolerogenic microparticles. ACS Biomater Sci Eng. 9 (6), 3522-3534 (2023).
  16. Deak, P., Knight, R., Esser-Kahn, A. Robust tolerogenic dendritic cells via push/pull pairing of toll-like-receptor agonists and immunomodulators reduces EAE. Biomaterials. 286, 121571 (2022).
  17. Møller, S. H., Wang, L., Ho, P. -. C. Metabolic programming in dendritic cells tailors immune responses and homeostasis. Cell Mol Immunoly. 19 (3), 370-383 (2022).
  18. Adamik, J., et al. Distinct metabolic states guide maturation of inflammatory and tolerogenic dendritic cells. Nat Comm. 13 (1), 5184 (2022).
  19. Hals, I. K., et al. Investigating optimal β-cell-preserving treatment in latent autoimmune diabetes in adults: Results from a 21-month randomized trial. Diabetes Obes Metab. 21 (10), 2219-2227 (2019).
  20. Gammon, J. M., et al. Engineering the lymph node environment promotes antigen-specific efficacy in type 1 diabetes and islet transplantation. Nat Comm. 14 (1), 681 (2023).
  21. Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A. -. M., Connolly, J. E. Generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes. J Vis Exp. (112), e54128 (2016).
  22. Jia, S., Kim, J., Esser-Kahn, A. P., Deak, P. High-throughput screening identification of novel immunomodulatory combinations for the generation of tolerogenic dendritic cells. Front Med. 10, 1298424 (2024).
  23. Dinh, B., et al. Isolation and cryopreservation of highly viable human peripheral blood mononuclear cells from whole blood: A guide for beginners. J Vis Exp. (212), e66794 (2024).
  24. Akkaya, B., et al. Regulatory T cells mediate specific suppression by depleting peptide-MHC class II from dendritic cells. Nat Immunol. 20 (2), 218-231 (2019).
  25. Stallone, G., et al. mTOR inhibitors effects on regulatory T cells and on dendritic cells. J Trans Med. 14 (1), 152 (2016).
  26. Dahlqvist, G., et al. Modulatory effect of rapamycin and tacrolimus on monocyte-derived dendritic cells phenotype and function. Immunobiology. 226 (1), 152031 (2021).
  27. Cimen Bozkus, C., Blazquez, A. B., Enokida, T., Bhardwaj, N. A T-cell-based immunogenicity protocol for evaluating human antigen-specific responses. STAR Protoc. 2 (3), 100758 (2021).
  28. Nakayama, M., Michels, A. W. Determining antigen specificity of human islet infiltrating T cells in type 1 diabetes. Front Immunol. 10, 365 (2019).
  29. Gregori, S., et al. Differentiation of type 1 T regulatory cells (Tr1) by tolerogenic DC-10 requires the IL-10-dependent ILT4/HLA-G pathway. Blood. 116 (6), 935-944 (2010).
  30. Taner, T., Hackstein, H., Wang, Z., Morelli, A. E., Thomson, A. W. Rapamycin-treated, alloantigen-pulsed host dendritic cells induce Ag-specific T cell regulation and prolong graft survival. Am J Transpl. 5 (2), 228-236 (2005).
  31. Baroja-Mazo, A., Revilla-Nuin, B., Ramírez, P., Pons, J. A. Immunosuppressive potency of mechanistic target of rapamycin inhibitors in solid-organ transplantation. World J Transplant. 6 (1), 183-192 (2016).
  32. Phillips, B. E., Garciafigueroa, Y., Trucco, M., Giannoukakis, N. Clinical tolerogenic dendritic cells: Exploring therapeutic impact on human autoimmune disease. Front Immunol. 8, 1279 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved