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Resumo

Descrevemos um procedimento para avaliar a capacidade de agentes farmacológicos gerarem células dendríticas tolerogênicas a partir de células dendríticas derivadas de monócitos virgens in vitro e validar sua potência por geração autóloga de células T reguladoras.

Resumo

As células dendríticas tolerogênicas (tolDCs) são um subconjunto de células dendríticas (DCs) que são conhecidas por influenciar as células T virgens em direção a um fenótipo de células T reguladoras (Treg). As TolDCs estão atualmente sob investigação como terapias para autoimunidade e transplante, tanto como terapia celular quanto como método para induzir tolDCs de DCs endógenas. Até o momento, no entanto, o número de agentes conhecidos para induzir tolDCs de DCs virgens é relativamente pequeno e sua potência para gerar Tregs in vivo tem sido inconsistente, particularmente terapias que induzem tolDCs de DCs endógenas. Isso oferece uma oportunidade de explorar novos compostos para gerar tolerância.

Aqui descrevemos um método para testar novos compostos imunomoduladores em DCs derivadas de monócitos (moDCs) in vitro e validar sua funcionalidade para gerar Tregs autólogas. Primeiro, obtemos PBMCs e isolamos monócitos CD14+ e células T CD3+ usando kits de separação magnética disponíveis comercialmente. Em seguida, diferenciamos monócitos em moDCs, tratamo-los com um imunomodulador estabelecido, como rapamicina, dexametasona, IL-10 ou vitamina D3, por 24 h e testamos sua alteração em marcadores tolerogênicos como validação do protocolo. Finalmente, co-cultivamos as tolDCs induzidas com células T autólogas na presença de estimulação anti-CD3 / CD28 e observamos mudanças nas populações de Treg e proliferação de células T. Prevemos que este protocolo seja usado para avaliar a eficácia de novos agentes imunomoduladores para reprogramar DCs já diferenciadas em direção a tolDC.

Introdução

As células dendríticas (DCs) são mediadores críticos entre a imunidade inata e adaptativa. As DCs, que residem principalmente nas membranas mucosas, pele e tecido linfoide, são as células apresentadoras primárias de antígenos (APCs)1. As DCs captam proteínas estranhas e processam e as apresentam nas principais proteínas de histocompatibilidade (MHC) para células T virgens. As DCs expressam especificamente proteínas MHC classe II, como o antígeno leucocitário humano-DR (HLA-DR) em humanos. O estado de ativação das DCs após a exposição ao antígeno é crítico para a resposta das células T a jusante2. DCs imaturos expressam vários receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que reconhecem classes de moléculas chamadas padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), como o componente da parede bacteriana, lipopolissacarídeo (LPS)3. Após a estimulação de PRR, as DCs tornam-se DCs amadurecidas e regulam positivamente importantes proteínas co-estimuladoras de células T, como CD80, CD86 e CD40, e secretam citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral alfa (TNFα), facilitando a diferenciação de células T virgens em células T efetoras convencionais ou auxiliares2. Pelo contrário, se a maturação das DC for interrompida ou se as DCs se desenvolverem em um ambiente tolerogênico, as DCs podem gerar um estado tolerogênico de DC (tolDCs)4. Os TolDCs regulam negativamente os receptores co-estimuladores clássicos de células T e, em vez disso, regulam positivamente os receptores de tolerância, como o ligante de morte celular programada 1 (PD-L1) e o atenuador de linfócitos B e T (BTLA) e geram citocinas supressivas, como a interleucina 10 (IL-10) e o fator de crescimento transformador beta (TGF-β)4. Esta não é uma lista abrangente de marcadores de tolerância e, de fato, há um consenso limitado sobre quais marcadores tolDC são apropriados para definir o estado tolDC5. Considerando isso, propomos a geração de células T reguladoras (Treg) como um marcador funcional que deve ser usado para comparar a eficácia de vários agentes de indução tolDC.

Além dos estados de ativação de DC/DC amadurecidos, os DCs também podem ser categorizados com base em sua linhagem ou localização do tecido, com cada subconjunto exibindo funcionalidade ligeiramente diferente. Embora a divisão tolDC/DC amadurecida seja menos definitiva e exista mais como um continuum, as divisões de linhagem têm marcadores bem definidos em humanos e camundongos. Os precursores de DC são formados na medula óssea, mas existem dois subtipos principais de DCs com base em sua linhagem: 1) células dendríticas plasmocitóides (pDCs), que derivam de linhagens linfóides e 2) células dendríticas convencionais (cDCs), que derivam de linhagens mieloides. Em humanos, as pDCs são amadurecidas em órgãos linfóides, expressam CD303 e são altamente responsivas em infecções virais6. As cDCs que expressam CD11c, por sua vez, são amadurecidas em tecidos periféricos e existem em dois subtipos distintos, CD1c + cDC1s e CD141 + cDC2, cada um gerando respostas distintas de células T7. Além disso, todas as cDCs podem existir em subestados residentes no tecido (CD103-) ou migratórios (CD103+)8. Finalmente, sob certas condições, as células de linhagens de monócitos (CD14+) podem ser induzidas em direção a um fenótipo de célula dendrítica e são identificadas como CD14-, CD141+, CD1c+ 9. Essas células, conhecidas como DCs derivadas de monócitos (moDCs), são as mais comumente usadas para análise ex vivo em humanos, pois os monócitos constituem aproximadamente 10-30% das células mononucleares do sangue periférico humano (PBMCs), enquanto as pDCs constituem apenas 1-3%10. Isso torna os moDCs uma escolha atraente, mas também se sabe que os moDCs são mais inflamatórios do que os cDCs típicos isolados do tecido primário9.

Atualmente, existem duas grandes categorias de esforços para empregar tolDCs para gerar tolerância clínica. Primeiro, os tolDCs são gerados a partir de monócitos para uso como terapia celular. Nesse paradigma, as MOCDs são tipicamente diferenciadas usando IL-4/GM-CSF concomitantemente com imunomoduladores como vitamina D3, rapamicina (rapa), IL-10, dexametasona ou combinações destes11,12. Esses tolDCs têm sido explorados como terapias celulares autólogas para autoimunidade e transplantes13. O outro uso de tolDCs é reprogramar DCs endógenas para tolDCs usando drogas livres ou nanocarreadores para fornecer imunomodulador e antígeno de interesse 14,15,16. A indução de DCs já diferenciadas é mais desafiadora, no entanto, devido ao desenvolvimento de fenótipos metabólicos robustos de DCs que normalmente contrastam com o metabolismo tolDC17,18. Este é um nível alto para a maioria dos imunomoduladores farmacológicos; por esse motivo, a maioria dos estudos de reprogramação DC endógena relata supressão eficaz de DC e muitas vezes alguma indução de Treg, mas não tem sucesso clínico, muitas vezes devido à falta de persistência de células T 15,19,20. Isso destaca a necessidade de estratégias para identificar potenciais agentes de indução tolDC de DCs existentes.

Aqui, apresentamos um método para avaliação in vitro de agentes imunomoduladores contra moDCs diferenciados com a métrica final de indução autóloga de Treg. Este protocolo foi desenvolvido para avaliar a eficácia de agentes imunomoduladores para reprogramar moDCs humanos já diferenciados em direção à tolerância. Além disso, este protocolo valida a funcionalidade de tolDCs reprogramados para gerar Tregs contra células T autólogas isoladas da mesma amostra de PBMC. Isso contrasta com outros protocolos que induzem tolerância durante a diferenciação e/ou desafio de DCs com células T de doadores alogênicos21. Neste protocolo, usamos o agente tolerante comum rapa como exemplo, mas também demonstramos a eficácia limitada dos moDCs tratados com rapa para gerar Tregs. Em nossos resultados representativos, também mostramos a eficácia de outros tratamentos imunomoduladores comuns, como IL-10, dexametasona e vitamina D3. Prevemos que este protocolo seja usado para rastrear agentes indutores de tolDC potencialmente mais eficazes contra moDCs já estabelecidos22.

Protocolo

Todas as amostras de células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) foram obtidas do Núcleo de Imunologia Humana da Universidade da Pensilvânia de doadores não identificados com aprovação prévia do Conselho de Revisão Institucional (IRB) da Universidade da Pensilvânia com o consentimento do paciente.

Opcional: Enquanto neste método, usamos PBMCs recém-isolados obtidos de um laboratório acadêmico, os PBMCs podem ser isolados de sangue total ou produtos sanguíneos enriquecidos com leucaférese. Recomendamos o uso do método de centrifugação com gradiente de densidade, pois este é um método bem estabelecido e confiável que é descrito em outro lugar23.

1. Isolamento de monócitos/células T e diferenciação de moDC

  1. Isolamento de monócitos e células T de PBMCs-Dia 1
    1. Obtenha 200 milhões de PBMCs humanos de um doador saudável. Mantenha as células em um tubo de 15 mL e transfira-as para o gelo.
    2. Alíquota de 50 mL de tampão de separação (fornecido em kits de separação disponíveis comercialmente) em um tubo cônico.
      NOTA: O tampão de separação também pode ser substituído por DPBS com 2% de soro fetal bovino (FBS) e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1 mM.
    3. Remova o tubo PBMC do gelo e encha-o com tampão de separação. Centrifugue a 300 x g por 5 minutos.
    4. Aspirar o sobrenadante com uma pipeta serológica de 10 ml. Ressuspenda o pellet celular em 4 mL do meio recomendado usando uma pipeta sorológica.
    5. Divida a suspensão em dois tubos diferentes de 15 mL, adicionando 2 mL por tubo (5 × 107 células/mL por tubo). Rotule um tubo como "T" e o outro como "Monócitos".
    6. Recupere o Kit de Isolamento de Monócitos Humanos e siga o protocolo do fabricante para isolar monócitos do tubo marcado com monócitos.
    7. Recupere o Kit de Isolamento de Células T Humanas e siga o protocolo do fabricante para o segundo tubo para isolar as células T.
  2. Plaqueamento de monócitos para diferenciação e congelamento de células T-Dia 1
    1. Pré-aqueça 50 mL de meio de cultura moDC (Tabela 1) a 37 ° C por pelo menos 10 min.
    2. Centrifugue os tubos de 15 ml com monócitos enriquecidos e o tubo de 15 ml com células T do passo 1.1 a 250 × g durante 5 min.
    3. Aspire o sobrenadante. Ressuspenda monócitos em 1 mL de meio de cultura moDC e células T em meio de cultura de células T (Tabela 1) pipetando para cima e para baixo. Certifique-se de que o pellet esteja devidamente disperso.
    4. Conte as células usando um contador de células automatizado ou hemacitômetro manual usando a coloração Trypan Blue.
      NOTA: Para os dados representativos, 10 milhões de células T e 3 milhões de monócitos foram isolados.
    5. Pegue o tubo com monócitos e adicione 9 mL de meio de cultura moDC quente à suspensão para um volume final de 10 mL. Em seguida, adicione 100 μL de 10 μg / mL GM-CSF e 10 μg / mL de estoque de IL-4 para uma concentração final de 100 ng / mL de GM-CSF e IL-4 no meio. Transferir a suspensão para uma placa de Petri e rotular como "moDC" (Dia 1) e incubar a 37 °C com 5% de CO2.
    6. Pegue o tubo de células T e misture 1 mL de meio de congelamento de células T (Tabela 1) com 1 mL de suspensão de células T. Divida em dois criogeniais de 2 mL (1 mL/frasco); selar hermeticamente (concentração final de 5 milhões de células por frasco). Coloque os criogeniais em uma câmara de congelamento com tubos de balanceamento em poços não utilizados. Armazene a câmara a -80 ° C durante a noite e, em seguida, transfira os criogeniais para um tanque criogênico.
    7. No dia 4, atualize o meio com a adição de 5 mL de meio de cultura moDC fresco e adicione 100 μL de estoque de GM-CSF e IL-4. Os moDCs diferenciados estarão prontos no dia 7.

2. Adição de drogas imunomoduladoras para geração de moDCs tolerogênicas

  1. Configure a placa moDC.
    1. No dia 7, recupere os moDCs diferenciados da incubadora e transfira a suspensão de células moDC para um tubo de 50 mL.
    2. Centrifugar a suspensão a 250 × g durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 ml de meios de cultura moDC quentes, pipetando para cima e para baixo. Contar as células com hemacitómetro e diluir as células até uma concentração de 3 × 105 células/ml em meio de cultura moDC quente contendo 100 ng/ml de GM-CSF e IL-4.
    3. Adicione 3 × 104 células/poço em 100 μL ao número desejado de poços em uma placa de cultura de tecidos de fundo plano de 96 poços.
      NOTA: Para resultados representativos, usamos um total de 48 poços (quatro condições feitas em triplicata preparadas para quatro análises diferentes nas seções 3 e 4), mas isso pode ser ajustado para até 60 poços. Encha todos os poços restantes com 100 μL/poço PBS para evitar a secagem, especialmente os poços externos. Recomendamos preparar placas diferentes para cada método de análise.
    4. Adicione 1 μL / poço de drogas imunomoduladoras aos poços desejados (aqui 10 ng / mL de rapa). Incubar a placa durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.
      NOTA: Se incluir imunoestimulação no dia 8, prepare poços para o medicamento imunomodulador com e sem imunoestimulação. O uso de imunoestimulação para amadurecer moDCs é opcional.
  2. Descongele as células T.
    1. No dia 8, recupere dois criotubos do tanque criogênico e descongele os criotubos em um banho de esferas quentes ou banho-maria a 37 ° C até que o conteúdo comece a derreter (em <3 min).
    2. Quando o conteúdo começar a derreter, transfira os frascos para uma capa de cultura de células e pipete 1 mL de meio de cultura de células T quente no frasco para descongelar rapidamente. Transfira todo o conteúdo do frasco para injetáveis para um tubo de 50 ml. Enxágue os criogenianos com 1 mL de meio de cultura de células T para garantir que todas as células sejam transferidas para o tubo.
    3. Complete a suspensão com solução de coloração de fluxo (Tabela 1) para 15 mL. Centrifugar a 200 × g durante 10 min e aspirar o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet em 5 mL de solução de coloração de fluxo e centrifugue novamente.
    4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio de cultura de células T quente. Conte as células usando um hemacitômetro.
      NOTA: A viabilidade deve ser de >70% nesta fase; se restarem grandes quantidades de células mortas, transfira para um tubo novo, adicione 10 mL de solução de coloração celular, centrifugue a 200 × g por 5 min, ressuspenda em 1 mL de meio de células T e reconte.
    5. Adicione 9 mL de meio de cultura de células T quente para fazer um volume final de 10 mL. Transfira a suspensão para uma placa de Petri. Rotule-o como "Células T descongeladas" e incube durante a noite a 37 ° C com 5% de CO2 para deixar as células descansarem.
  3. Lave a placa moDC e adicione o imunoestimulador, se desejar.
    1. No dia 8, centrifugue a placa moDC (a partir do dia 7) a 300 × g por 5 min.
    2. Aspirar o sobrenadante, lavar com HBSS quente, repetir a centrifugação, aspirar novamente e ressuspender as células em meio de cultura moDC quente contendo GM-CSF e IL-4 (100 μL / poço).
      NOTA: Tenha cuidado para não perturbar as células. Incline a placa durante a aspiração. Aproximadamente 10 μL podem permanecer no poço.
    3. Se estiver usando imunoestimulação, adicione 1 μL / poço de LPS 100x estoque (ou outro agente imunoestimulador) aos poços desejados. Incubar a placa durante a noite a 37 °C com 5% de CO2.

3. Análise de fluxo para moDC (Validação + Tolerância)

  1. Análise de fluxo para validação de moDC
    1. No dia 8, prepare coquetéis de anticorpos para o Painel de Validação, visando os seguintes marcadores: HLA-DR, CD14, lectina do tipo C específica de células dendríticas (DC-SIGN), CD1c e CD40, conforme descrito na Tabela 2. Dilua todos os anticorpos com solução de coloração de fluxo.
      NOTA: O painel foi projetado para um citômetro de fluxo a laser vermelho/azul de 7 canais.
    2. Recupere a placa moDC da incubadora. Centrifugue a placa a 300 × g durante 5 min. Remova os sobrenadantes. Opcional: Guarde os sobrenadantes para análise ELISA para citocinas IL-10 e TNFα usando kits disponíveis comercialmente de acordo com as instruções do fabricante.
    3. Adicione 200 μL/poço de solução de coloração de fluxo. Centrifugue a placa a 300 × g durante 5 min.
    4. Aspire o sobrenadante e adicione 50 μL / poço de anticorpo inibidor de ligação ao receptor Fc diluído 1:200 em solução de coloração de fluxo para bloquear a ligação inespecífica. Incubar à temperatura ambiente (RT) durante 30 min.
    5. Adicionar 50 μL/alvéolo do cocktail de anticorpos preparado do Painel de Validação .
    6. Prepare os controles de compensação na placa ou em tubos de 1,5 mL misturando 50 μL de grânulos de compensação com 50 μL de cada anticorpo diluído. Incubar a placa a 4 °C durante 1 h.
      NOTA: Os grânulos de compensação são usados aqui em vez de células para compensação devido à expressão potencialmente baixa de marcadores em moDCs.
    7. Lave centrifugando a 300 × g por 5 min, removendo o sobrenadante e ressuspendendo em 200 μL de solução de coloração de fluxo. Faça duas lavagens.
    8. Após a lavagem final, centrifugue novamente e ressuspenda as células em 110 μL / poço de solução de coloração de fluxo. As amostras agora estão prontas para análise de citometria de fluxo.
  2. Análise de fluxo para moDC tolerogênico (Painel de Tolerância)
    1. Semelhante à etapa 3.1 no dia 8, prepare coquetéis de anticorpos para o Painel de Tolerância, visando os seguintes marcadores: CD86, PD-L1, DC-SIGN, CD1c, BTLA e CD40 (Tabela 2).
    2. Repita as etapas 3.1.2-3.1.8, substituindo o coquetel de anticorpos pelo coquetel Tolerance Panel .

4. Análise de fluxo de células T

  1. Combine células T com moDCs tolerogênicos tratados.
    1. No dia 9, recupere a placa de Petri de células T descongeladas da incubadora e transfira todas as células T para um tubo de 50 mL. Complete com solução de coloração de fluxo.
    2. Opcional: Se estiver realizando a análise de proliferação de células T, divida as células T em dois tubos.
      1. Com o primeiro tubo, gire para baixo a 250 × g por 5 min e remova o sobrenadante. Pinte este tubo com corante de proliferação celular de acordo com as instruções do fabricante.
        NOTA: Usamos o Fixable Viability Dye eFluor 670, que requer uma etapa de incubação de 30 minutos, seguida de duas etapas de lavagem. Sugerimos o uso de tubos cônicos de 50 mL para evitar a perda celular e o uso de HBSS com HIFBS a 10% para lavar após a coloração.
      2. Use o segundo tubo contendo células T não coradas para análise Treg. Da mesma forma, gire a 250 × g por 5 min, remova o sobrenadante, ressuspenda em meio de cultura de células quentes e mantenha na incubadora durante o processo de coloração. Se nenhuma proliferação de células T for necessária, gire todas as células T e substitua-as por meios de cultura de células T quentes.
    3. Conte as células e obtenha pelo menos 4 milhões (apenas para análise de Treg) ou 8 milhões (para análise de proliferação de Treg e T).
    4. Recupere a placa moDC da incubadora com os poços restantes, centrifugue a 300 × g por 5 min e apirate os sobrenadantes. Adicione 200 μL / células T de poço a 1,6 × 105 células / poço. Adicione células T não coradas para placas de análise Treg e células T coradas para placas de proliferação de células T.
      NOTA: Isso manterá uma proporção de células T para moDC de 5:1, já que os 3 ×104 moDCs iniciais normalmente se expandem ligeiramente.
    5. Adicione 25 μL / mL de coquetel de anticorpos anti-CD3 / CD28 a todos os grupos, exceto poços de controle negativo para estimular as células T. Incubar a placa durante 72 h a 37 °C com 5% de CO2 até ao dia 12.
      NOTA: Certifique-se de usar células T coradas para análise de proliferação e não coradas para análise de Treg.
  2. Análise de fluxo Treg
    1. Coloração de marcador de superfície
      1. No dia 12, prepare coquetéis de anticorpos para o Painel Treg (Tabela 2).
      2. Transfira todas as suspensões de células da placa de cultura de 96 poços para uma placa de fundo em V com solução de coloração de fluxo. Reter os sobrenadantes para análise de citocinas.
      3. Lave as células 2x por centrifugação (200 × g por 5 min seguido de 200 μL de solução de coloração Flow). Separe algumas células para controles de compensação. Reserve um para a coloração FOXP3 e para controles não corados.
        NOTA: Sugerimos pentear 10 μL de todas as amostras antes da centrifugação final na etapa 4.2.1.3 para obter os controles de compensação necessários. Isso fornece uma amostra representativa de toda a expressão de nível de superfície de cada marcador nas células.
      4. Após a segunda lavagem, centrifugue a 200 x g por 5 min em temperatura ambiente e aspire, em seguida, adicione 50 μL / poço de anticorpo inibidor de ligação ao receptor Fc (diluído 1:200 em solução de coloração de fluxo). Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
      5. Adicione 50 μL / poço do coquetel de anticorpos Treg Panel preparado.
      6. Para controles de compensação, misture 50 μL de células de compensação não coradas com 50 μL de cada anticorpo corado.
      7. Incubar a placa e os controlos de compensação a 4 °C durante 1 h. Lave a placa uma vez com solução de mancha de fluxo e centrifugue a 300 × g por 5 min.
      8. Coloração com corante Near-IR vivo/morto diluído em HBSS (1:1.000) a 200 μL/poço. Incubar a 4 °C durante 30 min.
      9. Lave a placa uma vez com solução de coloração de fluxo (200 μL / poço) a 300 × g por 5 min.
    2. Manchar com FoxP3 de acordo com as instruções do fabricante, o que exigirá uma incubação durante a noite. Uma breve visão geral do protocolo de coloração FoxP3 é descrita abaixo.
      1. Prepare a solução de trabalho de fixação/permeabilização FoxP3 de acordo com as instruções do fabricante. Misture 1 parte de Concentrado de Fixação/Permeabilização FoxP3 com 3 partes de Diluente de Fixação/Permeabilização FoxP3. Preparar 200 μL da solução de trabalho por amostra.
      2. Incube todas as amostras em 200 μL/poço da solução de fixação/permeabilização de trabalho. Deixar a 4 °C durante 1 h.
      3. Prepare 1x Tampão de Permeabilização: Misture 1 parte de 10x Tampão de Permeabilização (obtido do kit comercial) com 9 partes de água destilada.
      4. Lave a placa 2x com 1x Tampão de Permeabilização (200 μL/poço) a 300 × g por 5 min.
      5. Corar com anticorpo FoxP3 (PE-Cy5.5, diluição 1:300 em tampão de permeabilização 1x): Adicione 100 μL/poço do anticorpo FoxP3 diluído e incube a 4 °C durante a noite.
      6. Lave a placa 2x com 1x Tampão de Permeabilização (200 μL/poço) a 300 × g por 5 min.
      7. Ressuspenda as células em 110 μL / poço de solução de coloração de fluxo.
      8. Realize a análise de citometria de fluxo.
  3. Análise de proliferação de células T
    1. Prepare coquetéis de anticorpos para o Painel de Proliferação T (Tabela 2).
    2. Transfira todas as suspensões de células da placa de cultura de 96 poços para uma placa de fundo em V com solução de coloração de fluxo. Reter sobrenadantes para análise de citocinas.
    3. Lave as células 2x por centrifugação (200 × g por 5 min seguido de 200 μL de solução de coloração Flow). Separe algumas células para controles de compensação. Reserve um para a coloração FOXP3 e para controles não corados.
      NOTA: Sugerimos pentear 10 μL de todas as amostras antes da centrifugação final na etapa 4.3.3 para obter os controles de compensação necessários. Isso fornece uma amostra representativa de toda a expressão de nível de superfície de cada marcador nas células.
    4. Após a segunda lavagem, centrifugue (200 × g por 5 min à temperatura ambiente) e aspire, em seguida, adicione 50 μL / poço de anticorpo inibidor de ligação ao receptor Fc (diluído 1:200 em solução de coloração de fluxo). Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Adicione 50 μL / poço do coquetel de anticorpos T Proliferation Panel preparado.
    6. Para controles de compensação, misture 50 μL de células de compensação não coradas com 50 μL de cada anticorpo corado.
    7. Incubar a placa e os controlos de compensação a 4 °C durante 1 h. Lave a placa uma vez com solução de mancha de fluxo e centrifugue a 300 × g por 5 min.
    8. Coloração com corante Near-IR vivo/morto diluído em HBSS (1:1.000) a 200 μL/poço. Incubar a 4 °C durante 30 min.
    9. Lave a placa uma vez com solução de coloração de fluxo (200 μL / poço) a 300 × g por 5 min.
    10. Realize a análise de citometria de fluxo.

Resultados

Descrevemos um protocolo para PBMCs humanos, isolamos células T CD3+ e monócitos CD14+ usando kits de separação magnética disponíveis comercialmente, diferenciamos monócitos em CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ moDCs usando GM-CSF e IL-4, tratamos por 24 h e co-cultivamos com células T autólogas com estimulação anti-CD3/CD28 por 72 h. Um esquema experimental é mostrado na Figura 1.

...

Discussão

Aqui descrevemos um método confiável e versátil para avaliar a funcionalidade de agentes imunomoduladores para induzir tolDCs a partir de moDCs e validar sua funcionalidade para gerar Tregs a partir de células T autogênicas ex vivo. Existem várias etapas críticas neste protocolo. Primeiro, os monócitos são células notoriamente sensíveis e devem ser obtidos de PBMCs frescos, não previamente congelados, para obter os melhores resultados. Os monócitos devem ser isolado...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Agradecimentos

Gostaríamos de agradecer ao Núcleo de Imunologia Humana (HIC) da Universidade da Pensilvânia por fornecer novos PBMCs humanos de doadores. O HIC é apoiado em parte pelo NIH P30 AI045008 e P30 CA016520.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-158General Cell Culture
1.5 mL Centrifuge TubeVWR77508-358General Cell Culture
10 mL Serological PipetsVWR414004-267General Cell Culture
100-1000 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-164General Cell Culture
15 mL Conical TubeVWR77508-212General Cell Culture
20-200 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-160General Cell Culture
2-MercaptoethanolMP Biomedical194834T Cell Culture
50 mL Conical TubeVWR21008-736General Cell Culture
60 x 15 mm Dish, Nunclon DeltaThermo Fischer150326General Cell Culture
96 Well Conical (V) Bottom Plate, Non-Treated SurfaceThermo Fischer277143General Cell Culture
96 well Flat Bottom PlateThermo Fischer161093General Cell Culture
APC/Cyanine7 anti-human CD272 (BTLA) AntibodyBiolegend344518Flow Cytometry
Attune NxT (Red/Blue Laser, 7 Channel)Thermo FischerA24863Flow Cytometry
BSAThermo Fischer15260-037General Cell Culture
CD14 Monoclonal Antibody (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Flow Cytometry
CD1c Monoclonal Antibody (L161), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42Flow Cytometry
CD209 (DC-SIGN) Monoclonal Antibody (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42Flow Cytometry
CD25 Monoclonal Antibody (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Flow Cytometry
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Flow Cytometry
CD4 Monoclonal Antibody (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Flow Cytometry
CD69 Monoclonal Antibody (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Flow Cytometry
CD86 Monoclonal Antibody (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Flow Cytometry
CD8a Monoclonal Antibody (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42Flow Cytometry
Conical Bottom (V-well) 96 Well PlateThermo Fischer2605Flow Cytometry
Cryogenic Vials, 2 mLThermo Fischer430488T Cell Culture
Dimethylsulfoxide (DMSO), Sequencing GradeThermo Fischer20688General Cell Culture
DPBSThermo Fischer14200166General Cell Culture
EasySep Human Monocyte Isolation KitStem Cell Technologies19359Cell Separation
EasySep Human T Cell Isolation KitStem Cell Technologies17951Cell Separation
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000Cell Separation
EDTAThermo FischerAIM9260GGeneral Cell Culture
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLStem Cell Technologies38025Cell Separation
Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal AntibodyThermo Fischer14-9161-73Flow Cytometry
Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670701General Cell Culture
Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Flow Cytometry
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SetThermo Fischer00-5523-00Flow Cytometry
FOXP3 Monoclonal Antibody (PCH101), PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42Flow Cytometry
HBSSThermo Fischer14170-112General Cell Culture
Heat Inactivated Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670801General Cell Culture
HEPES (1 M)Thermo Fischer15630106moDC Cell Culture
HLA-DR Monoclonal Antibody (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Flow Cytometry
Human CD3/CD28/CD2 T Cell ActivatorStemCell Technologies10970T Cell Culture
Human GM-CSF Recombinant ProteinThermo Fischer300-03moDC Cell Culture
Human IL-10 ELISA Kit, High SensitivityThermo FischerBMS215-2HSELISA
Human IL-4, Animal-Free Recombinant ProteinThermo FischerAF-200-04moDC Cell Culture
Human PBMC (Freshly Isolated)UPenn HICN/ACells
Human TNF alpha ELISA KitThermo FischerBMS223-4ELISA
Light Microscope (DMi1)Lucia391240General Cell Culture
Lipopolysaccaride (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC Cell Culture
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitThermo FischerL34975Flow Cytometry
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fischer11140050T Cell Culture
Penicillin-Streptomycin (100x)Thermo Fischer15140122General Cell Culture
Pipette ControllerVWR77575-370General Cell Culture
Rapamycin, 98+%Thermo FischerJ62473.MFmoDC Cell Culture
RPMI 1640 with GlutamaxThermo Fischer61870-036General Cell Culture
Separation BufferStem Cell Technologies20144Cell Separation
T Cell Stimulation Cocktail (500x)Thermo Fischer00-4970-93T Cell Culture
UltraComp eBead Plus Compensation BeadsThermo Fischer01-3333-41Flow Cytometry
Variable Pipette SetFischer Scientific05-403-152General Cell Culture

Referências

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