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  • Divulgaciones
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Resumen

Describimos un procedimiento para evaluar la capacidad de los agentes farmacológicos para generar células dendríticas tolerogénicas a partir de células dendríticas derivadas de monocitos naïve in vitro y validar su potencia mediante la generación de células T reguladoras autólogas.

Resumen

Las células dendríticas tolerogénicas (tolDC) son un subconjunto de células dendríticas (CD) que se sabe que influyen en las células T vírgenes hacia un fenotipo de células T reguladoras (Treg). Los TolDC están actualmente bajo investigación como terapias para la autoinmunidad y el trasplante, tanto como terapia celular como método para inducir TolDC a partir de CD endógenos. Hasta la fecha, sin embargo, el número de agentes conocidos para inducir tolDCs a partir de DC ingenuas es relativamente pequeño y su potencia para generar Tregs in vivo ha sido inconsistente, en particular las terapias que inducen tolDCs a partir de DC endógenas. Esto brinda la oportunidad de explorar nuevos compuestos para generar tolerancia.

En este trabajo describimos un método para probar nuevos compuestos inmunomoduladores en CD derivadas de monocitos (moDCs) in vitro y validar su funcionalidad para generar Tregs autólogas. En primer lugar, obtenemos PBMC y aislamos monocitos CD14+ y linfocitos T CD3+ utilizando kits de separación magnética disponibles en el mercado. A continuación, diferenciamos los monocitos en moDC, los tratamos con un inmunomodulador establecido, como rapamicina, dexametasona, IL-10 o vitamina D3, durante 24 h y probamos su cambio en marcadores tolerogénicos como validación del protocolo. Por último, cocultivamos las tolDCs inducidas con linfocitos T autólogos en presencia de estimulación anti-CD3/CD28 y observamos cambios en las poblaciones de Treg y la proliferación de linfocitos T. Prevemos que este protocolo se utilizará para evaluar la eficacia de nuevos agentes inmunomoduladores para reprogramar las CD ya diferenciadas hacia tolDC.

Introducción

Las células dendríticas (CD) son mediadores críticos entre la inmunidad innata y la adaptativa. Las CD, que residen principalmente en las membranas mucosas, la piel y el tejido linfoide, son las células presentadoras de antígenos primarios (CPA)1. Las CD absorben proteínas extrañas y las procesan y presentan en proteínas de histocompatibilidad mayor (MHC) a las células T vírgenes. Las CD expresan específicamente proteínas MHC de clase II, como el antígeno leucocitario humano-DR (HLA-DR) en humanos. El estado de activación de las CD tras la exposición al antígeno es crítico para la respuesta de las células T aguas abajo2. Las CD inmaduras expresan varios receptores de reconocimiento de patrones (PRR) que reconocen clases de moléculas llamadas patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), como el componente de la pared bacteriana, el lipopolisacárido (LPS)3. Tras la estimulación con PRR, las CD se convierten en DC maduras y regulan al alza importantes proteínas coestimuladoras de células T, como CD80, CD86 y CD40, y secretan citocinas proinflamatorias como el factor de necrosis tumoral alfa (TNFα), lo que facilita la diferenciación de las células T vírgenes en células T efectoras o auxiliares convencionales2. Por el contrario, si se interrumpe la maduración de las CD o si las DC se desarrollan en un entorno tolerogénico, las DC pueden generar un estado de DC tolerogénico (tolDCs)4. Los TolDC regulan a la baja los receptores coestimuladores clásicos de las células T y, en su lugar, regulan al alza los receptores de tolerancia, como el ligando de muerte celular programada 1 (PD-L1) y el atenuador de linfocitos B y T (BTLA), y generan citocinas supresoras como la interleucina 10 (IL-10) y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β)4. Esta no es una lista exhaustiva de marcadores de tolerancia y, de hecho, existe un consenso limitado en cuanto a qué marcadores tolDC son apropiados para definir el estado tolDC5. Teniendo en cuenta esto, proponemos la generación de células T reguladoras (Treg) como un marcador funcional que debe utilizarse para comparar la efectividad de varios agentes de inducción de tolDC.

Además de los estados de activación de tolDC/DC maduras, las DC también se pueden clasificar en función de su linaje o ubicación del tejido, y cada subconjunto muestra una funcionalidad ligeramente diferente. Mientras que la división tolDC/DC madura es menos definitiva y existe más como un continuo, las divisiones de linaje tienen marcadores bien definidos tanto en humanos como en ratones. Los precursores de DC se forman en la médula ósea, pero hay dos subtipos principales de DC en función de su linaje: 1) células dendríticas plasmocitoides (pDC), que derivan de linajes linfoides y 2) células dendríticas convencionales (cDC), que derivan de linajes mieloides. En los seres humanos, las pDC maduran en los órganos linfoides, expresan CD303 y responden muy bien a las infecciones virales6. Por su parte, las CD11c que expresan cDCs maduran en los tejidos periféricos y existen en dos subtipos distintos, CD1c+ cDC1 y CD141+ cDC2, cada uno de los cuales genera distintas respuestas de células T7. Además, todas las cDC pueden existir en los subestados residentes en los tejidos (CD103-) o migratorios (CD103+)8. Finalmente, bajo ciertas condiciones, las células de linajes de monocitos (CD14+) pueden ser inducidas hacia un fenotipo de célula dendrítica y se identifican como CD14-, CD141+, CD1c+ 9. Estas células, conocidas como CD derivadas de monocitos (moDC), son las más utilizadas para el análisis ex vivo en humanos, ya que los monocitos constituyen aproximadamente el 10-30% de las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC), mientras que las pDC constituyen solo el 1-3%10. Esto hace que las moDC sean una opción atractiva, pero también se sabe que las moDC son más inflamatorias que las cDC típicas aisladas del tejido primario9.

En la actualidad existen dos grandes categorías de esfuerzos para emplear tolDCs para generar tolerancia clínica. En primer lugar, los tolDC se generan a partir de monocitos para su uso como terapia celular. En este paradigma, las moDC se diferencian típicamente utilizando IL-4/GM-CSF simultáneamente con inmunomoduladores como la vitamina D3, la rapamicina (rapa), la IL-10, la dexametasona o combinaciones de estos11,12. Estos tolDCs han sido explorados como terapias celulares autólogas para la autoinmunidad y los trasplantes13. El otro uso de las tolDCs es la reprogramación de las CDs endógenas hacia las tolDCs utilizando fármacos libres o nanotransportadores para administrar tanto el inmunomodulador como el antígeno de interés 14,15,16. Sin embargo, la inducción de CD ya diferenciadas es más desafiante debido al desarrollo de fenotipos metabólicos robustos de DC que suelen estar en contraste con el metabolismo de tolDC17,18. Este es un listón alto para la mayoría de los inmunomoduladores farmacológicos; por esta razón, la mayoría de los estudios de reprogramación endógena de DC informan de una supresión efectiva de las CD y, a menudo, de alguna inducción de Treg, pero carecen de éxito clínico, a menudo debido a la falta de persistencia de las células T 15,19,20. Esto pone de manifiesto la necesidad de estrategias para identificar los posibles agentes de inducción de tolDC a partir de las CD existentes.

Aquí, presentamos un método para la evaluación in vitro de agentes inmunomoduladores frente a moDCs diferenciados con la métrica final de la inducción autóloga de Treg. Este protocolo está diseñado para evaluar la efectividad de los agentes inmunomoduladores para reprogramar los moDC humanos ya diferenciados hacia la tolerancia. Además, este protocolo valida la funcionalidad de los tolDCs reprogramados para generar Tregs contra células T autólogas aisladas de la misma muestra de PBMC. Esto contrasta con otros protocolos que inducen tolerancia durante la diferenciación y/o desafían a los tolDC con células T de donantes alogénicos21. En este protocolo, utilizamos el agente tolerador común rapa como ejemplo, pero también demostramos la eficacia limitada de los moDCs tratados con rapa para generar Tregs. En nuestros resultados representativos, también mostramos la eficacia de otros tratamientos inmunomoduladores comunes como la IL-10, la dexametasona y la vitamina D3. Prevemos que este protocolo se utilizará para examinar agentes inductores de tolDC potencialmente más efectivos contra moDCs ya establecidos22.

Protocolo

Todas las muestras de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se obtuvieron del Núcleo de Inmunología Humana de la Universidad de Pensilvania de donantes no identificados con la aprobación previa de la Junta de Revisión Institucional (IRB) de la Universidad de Pensilvania con el consentimiento del paciente.

Opcional: Mientras que en este método, utilizamos PBMC recién aislados obtenidos de un laboratorio académico, las PBMC se pueden aislar de sangre completa o productos sanguíneos enriquecidos con leucoféresis. Recomendamos utilizar el método de centrifugación en gradiente de densidad, ya que este es un método bien establecido y confiable que se describe en otra parte23.

1. Aislamiento de monocitos/células T y diferenciación de moDC

  1. Aislamiento de monocitos y linfocitos T de PBMCs-Día 1
    1. Obtener 200 millones de PBMC humanas de un donante sano. Mantenga las células en un tubo de 15 ml y transfiéralas a hielo.
    2. Alícuota de 50 mL de tampón de separación (provisto en kits de separación disponibles comercialmente) en un tubo cónico.
      NOTA: El tampón de separación también se puede reemplazar con DPBS con 2% de suero fetal bovino (FBS) y 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA).
    3. Retire el tubo de PBMC del hielo y llénelo con tampón de separación. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos.
    4. Aspirar el sobrenadante con una pipeta serológica de 10 mL. Vuelva a suspender el pellet celular en 4 mL del medio recomendado utilizando una pipeta serológica.
    5. Divida la suspensión en dos tubos diferentes de 15 mL, añadiendo 2 mL por tubo (5 × 107 células/mL por tubo). Etiquete un tubo con una "T" y el otro con "Monocitos".
    6. Recupere el kit de aislamiento de monocitos humanos y siga el protocolo del fabricante para aislar monocitos del tubo marcado con monocitos.
    7. Recupere el kit de aislamiento de células T humanas y siga el protocolo del fabricante para el segundo tubo para aislar las células T.
  2. Siembra de monocitos para diferenciación y congelación de linfocitos T-Día 1
    1. Precalentar 50 mL de medio de cultivo moDC (Tabla 1) a 37 °C durante al menos 10 min.
    2. Centrifugar los tubos de 15 mL con monocitos enriquecidos y el tubo de 15 mL con linfocitos T del paso 1.1 a 250 × g durante 5 min.
    3. Aspirar el sobrenadante. Vuelva a suspender los monocitos en 1 mL de medio de cultivo de moDC y las células T en el medio de cultivo de células T (Tabla 1) pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Asegúrese de que el pellet esté correctamente dispersado.
    4. Cuente las células con un contador de células automatizado o un hemacitómetro manual con tinción con azul de tripano.
      NOTA: Para los datos representativos, se aislaron 10 millones de células T y 3 millones de monocitos.
    5. Tome el tubo con monocitos y agregue 9 mL de medio de cultivo moDC tibio a la suspensión para obtener un volumen final de 10 mL. A continuación, añada 100 μL de 10 μg/mL DE GM-CSF y 10 μg/mL de caldo de IL-4 para obtener una concentración final de 100 ng/mL de GM-CSF e IL-4 en el medio. Transfiera la suspensión a una placa de Petri y etiquétela como "moDC" (Día 1) e incube a 37 °C con 5% de CO2.
    6. Tome el tubo de células T y mezcle 1 mL de medio de congelación de células T (Tabla 1) con 1 mL de suspensión de células T. Dividir en dos crioviales de 2 mL (1 mL/vial); Sellar herméticamente (concentración final de 5 millones de células por vial). Coloque los crioviales en una cámara de congelación con tubos de equilibrio en pozos no utilizados. Almacene la cámara a -80 °C durante la noche, luego transfiera los crioviales a un tanque criogénico.
    7. El día 4, refresque el medio con la adición de 5 mL de medio de cultivo moDC fresco y agregue 100 μL de material GM-CSF e IL-4. Los moDCs diferenciados estarán listos el día 7.

2. Adición de fármacos inmunomoduladores para la generación de moDCs tolerogénicos

  1. Configure la placa moDC.
    1. El día 7, recupere los moDC diferenciados de la incubadora y transfiera la suspensión de la célula moDC a un tubo de 50 mL.
    2. Centrifugar la suspensión a 250 × g durante 5 min. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la célula en 1 mL de medio de cultivo de moDC caliente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Cuente las células con hematitómetro y diluya las células hasta una concentración de 3 × 105 células/mL en medio de cultivo moDC tibio que contenga 100 ng/mL GM-CSF e IL-4.
    3. Agregue 3 × 104 células/pocillo en 100 μL al número deseado de pocillos en una placa de cultivo de tejidos de fondo plano de 96 pocillos.
      NOTA: Para obtener resultados representativos, utilizamos un total de 48 pozos (cuatro condiciones hechas por triplicado preparadas para cuatro análisis diferentes en las secciones 3 y 4), pero esto se puede ajustar hasta para 60 pozos. Llene todos los pocillos restantes con 100 μL/pocillo de PBS para evitar que se sequen, especialmente los pocillos exteriores. Recomendamos preparar placas diferentes para cada método de análisis.
    4. Añadir 1 μL/pocillo de fármacos inmunomoduladores a los pocillos deseados (en este caso, 10 ng/mL de rapa). Incubar la placa durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.
      NOTA: Si incluye inmunoestimulación en el día 8, prepare pocillos para el fármaco inmunomodulador con y sin inmunoestimulación. El uso de la inmunoestimulación para madurar las moDC es opcional.
  2. Refriegue las células T.
    1. El día 8, saque dos crioviales del tanque criogénico y descongele los crioviales en un baño de perlas calientes o baño de agua a 37 °C hasta que el contenido comience a derretirse (en <3 min).
    2. A medida que el contenido comience a derretirse, transfiera los viales a una campana de cultivo celular y pipetee 1 ml de medio de cultivo de células T calientes en el vial para descongelarlo rápidamente. Transfiera todo el contenido del vial a un tubo de 50 ml. Enjuague los crioviales con 1 mL de medio de cultivo de células T para asegurarse de que todas las células se transfieran al tubo.
    3. Rellene la suspensión con una solución de tinción por flujo (Tabla 1) hasta 15 mL. Centrifugar a 200 × g durante 10 min y aspirar el sobrenadante. A continuación, vuelva a suspender el pellet en 5 ml de solución de tinción por flujo y vuelva a centrifugar.
    4. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células en 1 mL de medio de cultivo de células T caliente. Cuente las células con un hematiómetro.
      NOTA: La viabilidad debe ser del >70% en esta etapa; si quedan grandes cantidades de células muertas, transfiéralo a un tubo nuevo, agregue 10 ml de solución de tinción celular, centrifugue a 200 × g durante 5 minutos, vuelva a suspender en 1 ml de medio de células T y vuelva a contar.
    5. Agregue 9 mL de medio de cultivo de células T tibias para hacer un volumen final de 10 mL. Transfiera la suspensión a una placa de Petri. Etiquételo como "Células T redescongeladas" e incube durante la noche a 37 °C con 5% de CO2 para dejar reposar las células.
  3. Lave la placa de moDC y agregue el inmunoestimulador si lo desea.
    1. El día 8, centrifugar la placa de moDC (a partir del día 7) a 300 × g durante 5 min.
    2. Aspirar el sobrenadante, lavar con HBSS tibio, repetir la centrifugación, aspirar de nuevo y volver a suspender las células en un medio de cultivo de moDC tibio que contenga GM-CSF e IL-4 (100 μL/pocillo).
      NOTA: Tenga cuidado de no alterar las celdas. Incline la placa durante la aspiración. Aproximadamente 10 μL pueden permanecer en el pocillo.
    3. Si utiliza inmunoestimulación, agregue 1 μL/pocillo de 100 veces el stock de LPS (u otro agente inmunoestimulador) a los pocillos deseados. Incubar la placa durante la noche a 37 °C con 5% de CO2.

3. Análisis de flujo para moDC (Validación + Tolerancia)

  1. Análisis de flujo para la validación de moDC
    1. El día 8, prepare cócteles de anticuerpos para el Panel de Validación, dirigidos a los siguientes marcadores: HLA-DR, CD14, lectina tipo C específica de células dendríticas (DC-SIGN), CD1c y CD40 como se describe en la Tabla 2. Diluya todos los anticuerpos con una solución de tinción de flujo.
      NOTA: El panel fue diseñado para un citómetro de flujo láser rojo/azul de 7 canales.
    2. Recupere la placa moDC de la incubadora. Centrifugar la placa a 300 × g durante 5 min. Retire los sobrenadantes. Opcional: Conserve los sobrenadantes para el análisis ELISA para las citocinas IL-10 y TNFα utilizando kits disponibles comercialmente de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    3. Agregue 200 μL/pocillo de solución de tinción por flujo. Centrifugar la placa a 300 × g durante 5 min.
    4. Aspirar el sobrenadante y añadir 50 μL/pocillo de anticuerpo inhibidor de la unión al receptor Fc diluido 1:200 en solución de tinción de flujo para bloquear la unión inespecífica. Incubar a temperatura ambiente (RT) durante 30 min.
    5. Añadir 50 μL/pocillo del cóctel de anticuerpos preparado por el Panel de Validación .
    6. Prepare controles de compensación en la placa o en tubos de 1,5 mL mezclando 50 μL de perlas de compensación con 50 μL de cada anticuerpo diluido. Incubar la placa a 4 °C durante 1 h.
      NOTA: Aquí se utilizan cuentas de compensación en lugar de celdas para la compensación debido a la expresión potencialmente baja de marcadores en los moDC.
    7. Lavar centrifugando a 300 × g durante 5 min, eliminando el sobrenadante y resuspendiendo en 200 μL de solución de tinción por flujo. Realiza dos lavados.
    8. Después del lavado final, centrifugar de nuevo y resuspender las células en 110 μL/pocillo de solución de tinción de flujo. Las muestras ya están listas para el análisis por citometría de flujo.
  2. Análisis de caudal para moDC tolerogénico (Panel de tolerancia)
    1. De forma similar al paso 3.1 del día 8, prepare cócteles de anticuerpos para el Panel de Tolerancia, dirigidos a los siguientes marcadores: CD86, PD-L1, DC-SIGN, CD1c, BTLA y CD40 (Tabla 2).
    2. Repita los pasos 3.1.2-3.1.8, sustituyendo el cóctel de anticuerpos por el cóctel del panel de tolerancia .

4. Análisis de flujo de células T

  1. Combine las células T con las moDC tolerogénicas tratadas.
    1. El día 9, recupere la placa de Petri de células T descongeladas de la incubadora y transfiera todas las células T a un tubo de 50 ml. Rellene con la solución de tinción por flujo.
    2. Opcional: Si realiza un análisis de proliferación de células T, divida las células T en dos tubos.
      1. Con el primer tubo, gire a 250 × g durante 5 min y retire el sobrenadante. Tiña este tubo con tinte para la proliferación celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
        NOTA: Utilizamos el tinte de viabilidad fijable eFluor 670, que requiere un paso de incubación de 30 minutos, seguido de dos pasos de lavado. Sugerimos usar tubos cónicos de 50 mL para evitar la pérdida de células y usar HBSS con 10% de HIFBS para lavar después de la tinción.
      2. Utilice el segundo tubo que contiene células T sin teñir para el análisis de Treg. Del mismo modo, centrifugar a 250 × g durante 5 minutos, retirar el sobrenadante, volver a suspender en medios de cultivo celular tibios y mantener en la incubadora durante el proceso de tinción. Si no se requiere proliferación de células T, reduzca la intensidad de todas las células T y reemplácelas con medios de cultivo de células T calientes.
    3. Cuente las células y obtenga al menos 4 millones (solo para el análisis de Treg) u 8 millones (para el análisis de proliferación de Treg y T).
    4. Recupere la placa de moDC de la incubadora con los pocillos restantes, centrifugue a 300 × g durante 5 minutos y apire los sobrenadantes. Agregue 200 μL/pocillo de células T a 1,6 × 105 células/pocillo. Agregue células T sin teñir para las placas de análisis Treg y células T teñidas para las placas de proliferación de células T.
      NOTA: Esto mantendrá una relación de células T a moDC de 5:1, ya que los 3 ×104 moDC iniciales suelen expandirse ligeramente.
    5. Añadir 25 μL/mL de cóctel de anticuerpos anti-CD3/CD28 a todos los grupos, excepto a los pocillos de control negativos, para estimular las células T. Incubar la placa durante 72 h a 37 °C con 5% de CO2 hasta el día 12.
      NOTA: Asegúrese de utilizar células T teñidas para el análisis de proliferación y sin tinción para el análisis de Treg.
  2. Análisis de flujo Treg
    1. Tinción de marcadores de superficie
      1. El día 12, prepare cócteles de anticuerpos para el Panel Treg (Tabla 2).
      2. Transfiera todas las suspensiones celulares de la placa de cultivo de 96 pocillos a una placa inferior en V con solución de tinción por flujo. Conserve los sobrenadantes para el análisis de citocinas.
      3. Lave las células 2 veces por centrifugación (200 × g durante 5 minutos seguidos de 200 μL de solución de tinción Flow). Reserve algunas celdas para los controles de compensación. Reserve uno para la tinción FOXP3 y para los controles sin teñir.
        NOTA: Sugerimos peinar 10 μL de todas las muestras antes del centrifugado final en el paso 4.2.1.3 para obtener los controles de compensación necesarios. Esto proporciona una muestra representativa de toda la expresión a nivel de superficie de cada marcador en las celdas.
      4. Después del segundo lavado, centrifugar a 200 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar, luego agregar 50 μL/pocillo de anticuerpo inhibidor de la unión al receptor Fc (diluido 1:200 en solución de tinción de flujo). Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
      5. Añadir 50 μL/pocillo del cóctel de anticuerpos Treg Panel preparado.
      6. Para los controles de compensación, mezcle 50 μL de células de compensación no teñidas con 50 μL de cada uno de los anticuerpos teñidos.
      7. Incubar la placa y los controles de compensación a 4 °C durante 1 h. Lave la placa una vez con Flow Stain Solution y centrifugue a 300 × g durante 5 min.
      8. Tinción con colorante vivo/muerto en infrarrojo cercano diluido en HBSS (1:1.000) a 200 μL/pocillo. Incubar a 4 °C durante 30 min.
      9. Lave la placa una vez con solución de tinción por flujo (200 μL/pocillo) a 300 × g durante 5 min.
    2. Teñir con FoxP3 de acuerdo con las instrucciones del fabricante, lo que requerirá una incubación nocturna. A continuación se describe una breve descripción general del protocolo de tinción FoxP3.
      1. Prepare la solución de trabajo de fijación/permeabilización FoxP3 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezcle 1 parte de concentrado de fijación/permeabilización FoxP3 con 3 partes de diluyente de fijación/permeabilización FoxP3. Prepare 200 μL de la solución de trabajo por muestra.
      2. Incubar todas las muestras en 200 μL/pocillo de la solución de fijación/permeabilización de trabajo. Dejar a 4 °C durante 1 h.
      3. Prepare 1x Tampón de permeabilización: Mezcle 1 parte de 10x Tampón de permeabilización (obtenido del kit comercial) con 9 partes de agua destilada.
      4. Lave la placa 2 veces con 1x tampón de permeabilización (200 μL/pocillo) a 300 × g durante 5 min.
      5. Tinción con anticuerpo FoxP3 (PE-Cy5.5, dilución 1:300 en tampón de permeabilización 1x): Añadir 100 μL/pocillo del anticuerpo FoxP3 diluido e incubar a 4 °C durante la noche.
      6. Lave la placa 2 veces con 1x tampón de permeabilización (200 μL/pocillo) a 300 × g durante 5 min.
      7. Vuelva a suspender las células en 110 μL/pocillo de solución de tinción por flujo.
      8. Realizar análisis de citometría de flujo.
  3. Análisis de proliferación de linfocitos T
    1. Preparar cócteles de anticuerpos para el Panel de Proliferación T (Tabla 2).
    2. Transfiera todas las suspensiones celulares de la placa de cultivo de 96 pocillos a una placa inferior en V con solución de tinción por flujo. Retenga sobrenadantes para el análisis de citocinas.
    3. Lave las células 2 veces por centrifugación (200 × g durante 5 minutos seguidos de 200 μL de solución de tinción Flow). Reserve algunas celdas para los controles de compensación. Reserve uno para la tinción FOXP3 y para los controles sin teñir.
      NOTA: Sugerimos peinar 10 μL de todas las muestras antes del centrifugado final en el paso 4.3.3 para obtener los controles de compensación necesarios. Esto proporciona una muestra representativa de toda la expresión a nivel de superficie de cada marcador en las celdas.
    4. Después del segundo lavado, centrifugar (200 × g durante 5 min a temperatura ambiente) y aspirar, luego agregar 50 μL/pocillo de anticuerpo inhibidor de la unión al receptor Fc (diluido 1:200 en solución de tinción de flujo). Incubar a temperatura ambiente durante 10 min.
    5. Añadir 50 μL/pocillo del cóctel de anticuerpos T Proliferation Panel preparado.
    6. Para los controles de compensación, mezcle 50 μL de células de compensación no teñidas con 50 μL de cada uno de los anticuerpos teñidos.
    7. Incubar la placa y los controles de compensación a 4 °C durante 1 h. Lave la placa una vez con Flow Stain Solution y centrifugue a 300 × g durante 5 min.
    8. Tinción con colorante vivo/muerto en infrarrojo cercano diluido en HBSS (1:1.000) a 200 μL/pocillo. Incubar a 4 °C durante 30 min.
    9. Lave la placa una vez con solución de tinción por flujo (200 μL/pocillo) a 300 × g durante 5 min.
    10. Realizar análisis de citometría de flujo.

Resultados

Hemos descrito un protocolo para PBMCs humanas, aislar tanto las células T CD3+ como los monocitos CD14+ utilizando kits de separación magnética disponibles en el mercado, diferenciar los monocitos en CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ moDCs utilizando GM-CSF e IL-4, tratarlos durante 24 h y cocultivar con células T autólogas con estimulación anti-CD3/CD28 durante 72 h. En la Figura 1 se mues...

Discusión

En este trabajo describimos un método fiable y versátil para evaluar la funcionalidad de agentes inmunomoduladores para inducir tolDCs a partir de moDCs y validar su funcionalidad para generar Tregs a partir de células T autógenas ex vivo. Hay varios pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, los monocitos son células notoriamente sensibles y deben obtenerse de PBMC frescas, no previamente congeladas, para obtener los mejores resultados. Los monocitos deben aislars...

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer al Centro de Inmunología Humana (HIC) de la Universidad de Pensilvania por proporcionar PBMC humanos frescos de los donantes. El HIC está respaldado en parte por los AI045008 P30 y P30 CA016520 de los NIH.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-158General Cell Culture
1.5 mL Centrifuge TubeVWR77508-358General Cell Culture
10 mL Serological PipetsVWR414004-267General Cell Culture
100-1000 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-164General Cell Culture
15 mL Conical TubeVWR77508-212General Cell Culture
20-200 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-160General Cell Culture
2-MercaptoethanolMP Biomedical194834T Cell Culture
50 mL Conical TubeVWR21008-736General Cell Culture
60 x 15 mm Dish, Nunclon DeltaThermo Fischer150326General Cell Culture
96 Well Conical (V) Bottom Plate, Non-Treated SurfaceThermo Fischer277143General Cell Culture
96 well Flat Bottom PlateThermo Fischer161093General Cell Culture
APC/Cyanine7 anti-human CD272 (BTLA) AntibodyBiolegend344518Flow Cytometry
Attune NxT (Red/Blue Laser, 7 Channel)Thermo FischerA24863Flow Cytometry
BSAThermo Fischer15260-037General Cell Culture
CD14 Monoclonal Antibody (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Flow Cytometry
CD1c Monoclonal Antibody (L161), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42Flow Cytometry
CD209 (DC-SIGN) Monoclonal Antibody (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42Flow Cytometry
CD25 Monoclonal Antibody (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Flow Cytometry
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Flow Cytometry
CD4 Monoclonal Antibody (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Flow Cytometry
CD69 Monoclonal Antibody (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Flow Cytometry
CD86 Monoclonal Antibody (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Flow Cytometry
CD8a Monoclonal Antibody (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42Flow Cytometry
Conical Bottom (V-well) 96 Well PlateThermo Fischer2605Flow Cytometry
Cryogenic Vials, 2 mLThermo Fischer430488T Cell Culture
Dimethylsulfoxide (DMSO), Sequencing GradeThermo Fischer20688General Cell Culture
DPBSThermo Fischer14200166General Cell Culture
EasySep Human Monocyte Isolation KitStem Cell Technologies19359Cell Separation
EasySep Human T Cell Isolation KitStem Cell Technologies17951Cell Separation
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000Cell Separation
EDTAThermo FischerAIM9260GGeneral Cell Culture
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLStem Cell Technologies38025Cell Separation
Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal AntibodyThermo Fischer14-9161-73Flow Cytometry
Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670701General Cell Culture
Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Flow Cytometry
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SetThermo Fischer00-5523-00Flow Cytometry
FOXP3 Monoclonal Antibody (PCH101), PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42Flow Cytometry
HBSSThermo Fischer14170-112General Cell Culture
Heat Inactivated Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670801General Cell Culture
HEPES (1 M)Thermo Fischer15630106moDC Cell Culture
HLA-DR Monoclonal Antibody (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Flow Cytometry
Human CD3/CD28/CD2 T Cell ActivatorStemCell Technologies10970T Cell Culture
Human GM-CSF Recombinant ProteinThermo Fischer300-03moDC Cell Culture
Human IL-10 ELISA Kit, High SensitivityThermo FischerBMS215-2HSELISA
Human IL-4, Animal-Free Recombinant ProteinThermo FischerAF-200-04moDC Cell Culture
Human PBMC (Freshly Isolated)UPenn HICN/ACells
Human TNF alpha ELISA KitThermo FischerBMS223-4ELISA
Light Microscope (DMi1)Lucia391240General Cell Culture
Lipopolysaccaride (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC Cell Culture
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitThermo FischerL34975Flow Cytometry
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fischer11140050T Cell Culture
Penicillin-Streptomycin (100x)Thermo Fischer15140122General Cell Culture
Pipette ControllerVWR77575-370General Cell Culture
Rapamycin, 98+%Thermo FischerJ62473.MFmoDC Cell Culture
RPMI 1640 with GlutamaxThermo Fischer61870-036General Cell Culture
Separation BufferStem Cell Technologies20144Cell Separation
T Cell Stimulation Cocktail (500x)Thermo Fischer00-4970-93T Cell Culture
UltraComp eBead Plus Compensation BeadsThermo Fischer01-3333-41Flow Cytometry
Variable Pipette SetFischer Scientific05-403-152General Cell Culture

Referencias

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