JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем процедуру оценки способности фармакологических агентов генерировать толерогенные дендритные клетки из наивных дендритных клеток, полученных из моноцитов, in vitro и подтверждать их активность путем аутологичной регуляторной генерации Т-клеток.

Аннотация

Толерогенные дендритные клетки (толДК) представляют собой подмножество дендритных клеток (ДК), которые, как известно, влияют на наивные Т-клетки в направлении фенотипа регуляторных Т-клеток (Treg). В настоящее время TolDC исследуются в качестве терапии аутоиммунных и трансплантационных препаратов, как в качестве клеточной терапии, так и метода индуцирования толDC из эндогенных DC. На сегодняшний день, однако, количество известных агентов, индуцирующих толДК из наивных ДК, относительно невелико, и их способность генерировать Tregs in vivo была непостоянной, особенно терапии, которая индуцирует толДК из эндогенных ДК. Это дает возможность исследовать новые соединения для получения допусков.

В данной статье мы описываем метод тестирования новых иммуномодулирующих соединений на моноцитарных ДК (moDCs) in vitro и валидации их функциональности для генерации аутологичных Tregs. Во-первых, мы получаем PBMC и выделяем моноциты CD14+ и CD3+ Т-клетки с помощью коммерчески доступных наборов для магнитной сепарации. Затем мы дифференцируем моноциты в moDC, обрабатываем их установленным иммуномодулятором, таким как рапамицин, дексаметазон, IL-10 или витамин D3, в течение 24 ч и проверяем их изменение толерогенных маркеров в качестве валидации протокола. Наконец, мы совместно культивируем индуцированные толДК с аутологичными Т-клетками в присутствии анти-CD3/CD28 стимуляции и наблюдаем изменения в популяциях Treg и пролиферации Т-клеток. Мы предполагаем, что этот протокол будет использоваться для оценки эффективности новых иммуномодулирующих агентов для перепрограммирования уже дифференцированных ДК в сторону толДК.

Введение

Дендритные клетки (ДК) являются важнейшими медиаторами между врожденным и адаптивным иммунитетом. ДК, которые в основном находятся в слизистых оболочках, коже и лимфоидной ткани, являются основными антигенпрезентирующими клетками (АПК)1. ДК поглощают чужеродные белки, обрабатывают и представляют их на белках основной гистосовместимости (МНС) наивным Т-клеткам. ДК специфически экспрессируют белки MHC класса II, такие как человеческий лейкоцитарный антиген-DR (HLA-DR) у человека. Состояние активации ДК при воздействии антигена имеет решающее значение для нисходящего ответа Т-клеток2. Незрелые ДК экспрессируют различные рецепторы распознавания образов (PRR), которые распознают классы молекул, называемые ассоциированными с патогенами молекулярными паттернами (PAMP), такие как компонент бактериальной стенки, липополисахарид (ЛПС)3. При стимуляции PRR ДК становятся зрелыми ДК и активируют важные костимулирующие белки Т-клеток, такие как CD80, CD86 и CD40, и секретируют провоспалительные цитокины, такие как фактор некроза опухоли-альфа (TNFα), способствуя дифференцировке наивных Т-клеток в обычные эффекторные или хелперные Т-клетки2. Напротив, если созревание ДК прерывается или если ДК развиваются в толерогенной среде, ДК могут генерировать толерогенное состояние ДК (толДК)4. TolDC подавляют классические костимулирующие рецепторы Т-клеток и вместо этого активируют рецепторы толерантности, такие как лиганд запрограммированной гибели клеток 1 (PD-L1) и аттенюатор В- и Т-лимфоцитов (BTLA), а также генерируют супрессивные цитокины, такие как интерлейкин 10 (IL-10) и трансформирующий фактор роста бета (TGF-β)4. Это не полный список маркеров допусков, и, на самом деле, существует ограниченный консенсус относительно того, какие маркеры tolDC подходят для определения состояния tolDC5. Учитывая это, мы предлагаем генерацию регуляторных Т-клеток (Treg) в качестве функционального маркера, который следует использовать для сравнения эффективности различных индукционных агентов толДК.

В дополнение к состояниям активации tolDC/зрелых ДК, ДК также могут быть классифицированы на основе их происхождения или расположения тканей, при этом каждая подгруппа демонстрирует немного различную функциональность. В то время как деление tolDC/зрелого DC менее определенно и существует скорее как континуум, линейные подразделения имеют четко определенные маркеры как у человека, так и у мышей. Предшественники ДК образуются в костном мозге, но в зависимости от их происхождения существует два основных подтипа ДК: 1) плазмоцитоидные дендритные клетки (pDCs), которые происходят от лимфоидных линий, и 2) обычные дендритные клетки (cDCs), которые происходят от миелоидных линий. У человека pDC созревают в лимфоидных органах, экспрессируют CD303 и обладают высокой реакцией на вирусные инфекции6. Между тем, CD11c, экспрессирующие cDC, созревают в периферических тканях и существуют в двух различных подтипах: CD1c+ cDC1 и CD141+ cDC2, каждый из которых генерируетразличные ответы Т-клеток. Кроме того, все цДК могут существовать либо в тканевых резидентных (CD103-), либо в мигрирующих (CD103+) подсостояниях8. Наконец, при определенных условиях клетки из моноцитарных линий (CD14+) могут быть индуцированы в направлении фенотипа дендритных клеток и идентифицируются как CD14-, CD141+, CD1c+ 9. Эти клетки, известные как моноцитарные ДК (moDCs), чаще всего используются для анализа ex vivo у человека, поскольку моноциты составляют примерно 10-30% мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC), в то время как pDC составляют только 1-3%10. Это делает moDC привлекательным выбором, но также известно, что moDC более воспалительны, чем типичные cDC, выделенные из первичной ткани9.

В настоящее время существуют две широкие категории усилий по использованию толДК для формирования клинической толерантности. Во-первых, толДК получают из моноцитов для использования в качестве клеточной терапии. В этой парадигме moDC обычно дифференцируются с использованием IL-4/GM-CSF одновременно с иммуномодуляторами, такими как витамин D3, рапамицин (рапа), IL-10, дексаметазон или комбинации этих11,12. Эти толДК были исследованы в качестве аутологичной клеточной терапии для аутоиммунных и трансплантатов13. Другое применение толДК заключается в перепрограммировании эндогенных ДК в сторону толДК с использованием свободных лекарств или наноносителей для доставки как иммуномодулятора, так и антигена, представляющего интерес 14,15,16. Однако индукция уже дифференцированных ДК является более сложной задачей из-за развития устойчивых метаболических фенотипов ДК, которые обычно контрастируют с метаболизмом толДК 17,18. Это высокая планка для большинства фармакологических иммуномодуляторов; по этой причине большинство эндогенных исследований перепрограммирования ДК сообщают об эффективном подавлении ДК и часто о некоторой индукции Treg, но не имеют клинического успеха, часто из-за отсутствия персистенции Т-клеток 15,19,20. Это подчеркивает необходимость разработки стратегий для выявления потенциальных агентов индукции толдк из существующих ДК.

В данной работе представлен метод in vitro оценки иммуномодулирующих агентов в отношении дифференцированных моДХ с конечной метрикой аутологичной индукции Treg. Этот протокол предназначен для оценки эффективности иммуномодулирующих агентов для перепрограммирования уже дифференцированных moDC человека в сторону толерантности. Кроме того, этот протокол проверяет функциональность перепрограммированных толDC для генерации Tregs против аутологичных Т-клеток, выделенных из того же образца PBMC. В отличие от других протоколов, которые индуцируют толерантность во время дифференцировки и/или провоцируют толДК Т-клетками от аллогенных доноров21. В этом протоколе мы используем в качестве примера распространенный толерантный агент рапа, но также демонстрируем ограниченную эффективность обработанных рапой моDC для генерации Tregs. В наших репрезентативных результатах мы также демонстрируем эффективность других распространенных иммуномодулирующих препаратов, таких как IL-10, дексаметазон и витамин D3. Мы предполагаем, что этот протокол будет использоваться для скрининга потенциально более эффективных толDC-индукционных агентов против уже установленных moDC22.

протокол

Все образцы мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMC) были получены из Центра иммунологии человека Университета Пенсильвании от обезличенных доноров с предварительного одобрения Институционального наблюдательного совета (IRB) Университета Пенсильвании с согласия пациента.

Дополнительно: В то время как в этом методе мы использовали свежевыделенные PBMC, полученные из академической лаборатории, PBMC могут быть выделены как из цельной крови, так и из продуктов крови, обогащенных лейкаферезом. Мы рекомендуем использовать метод центрифугирования с градиентом плотности, так как это хорошо зарекомендовавший себя и надежный метод, который описан в другом месте23.

1. Выделение моноцитов/Т-клеток и дифференцировка moDC

  1. Выделение моноцитов и Т-клеток из PBMCs-День 1
    1. Получите 200 миллионов человеческих PBMC от здорового донора. Храните клетки в пробирке объемом 15 мл и перенесите их на лед.
    2. Аликвота 50 мл разделительного буфера (поставляется в коммерчески доступных разделительных комплектах) в конической пробирке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разделительный буфер также может быть заменен DPBS с 2% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА).
    3. Извлеките трубку PBMC изо льда и заполните ее разделительным буфером. Центрифугируйте при 300 х г в течение 5 минут.
    4. Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 4 мл рекомендуемой среды с помощью серологической пипетки.
    5. Разделите суспензию на две разные пробирки по 15 мл, добавив по 2 мл на пробирку (5 × 107 клеток/мл на пробирку). Обозначьте одну пробирку буквой «Т», а другую «Моноциты».
    6. Приобретите набор для выделения моноцитов человека и следуйте протоколу производителя по выделению моноцитов из пробирки, меченной моноцитами.
    7. Возьмите набор для выделения Т-клеток человека и следуйте протоколу производителя для второй пробирки для выделения Т-клеток.
  2. Осаждение моноцитов для дифференцировки и заморозки Т-клеток - День 1
    1. Разогрейте 50 мл питательной среды moDC (Таблица 1) при 37 °C в течение не менее 10 минут.
    2. Центрифугируйте пробирки объемом 15 мл с обогащенными моноцитами и пробирку объемом 15 мл с Т-клетками с этапа 1.1 при дозе 250 × г в течение 5 мин.
    3. Аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте моноциты в 1 мл культуральной среды moDC и Т-клетки в культуральной среде для Т-клеток (табл. 1) путем пипетирования вверх и вниз. Убедитесь, что гранулы правильно диспергированы.
    4. Подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток или ручного гемацитометра с использованием окрашивания Trypan Blue.
      Примечание: Для репрезентативных данных было выделено 10 миллионов Т-клеток и 3 миллиона моноцитов.
    5. Возьмите пробирку с моноцитами и добавьте в суспензию 9 мл теплой среды для культуры moDC до конечного объема 10 мл. Затем добавьте по 100 мкл по 10 мкг/мл GM-CSF и 10 мкг/мл IL-4 для получения конечной концентрации 100 нг/мл как GM-CSF, так и IL-4 в среде. Переложите суспензию в чашку Петри и пометьте как «moDC» (день 1) и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2.
    6. Возьмите трубку с Т-клетками и смешайте 1 мл среды для замораживания Т-клеток (Таблица 1) с 1 мл суспензии Т-клеток. Разделить на две криоялы по 2 мл (1 мл/флакон); плотно запечатать (конечная концентрация 5 миллионов клеток во флаконе). Поместите криовалиалы в морозильную камеру с балансировочными трубками в неиспользуемые лунки. Храните камеру при температуре −80 °C в течение ночи, затем переложите криокамеры в криотанк.
    7. На 4-й день обновите среду, добавив 5 мл свежей питательной среды moDC и добавив по 100 мкл сырья GM-CSF и IL-4. Дифференцированные moDC будут готовы на 7-й день.

2. Добавление иммуномодулирующих препаратов для генерации толерогенных моДЭ

  1. Установите пластину moDC.
    1. На 7-й день извлеките дифференцированные moDC из инкубатора и перенесите клеточную суспензию moDC в пробирку объемом 50 мл.
    2. Центрифугируйте суспензию при 250 × г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клеточную гранулу в 1 мл теплой питательной среды moDC путем пипетирования вверх и вниз. Подсчитайте клетки с помощью гемацитометра и разведите клетки до концентрации 3 × 105 клеток/мл в теплой культуральной среде moDC, содержащей 100 нг/мл GM-CSF и IL-4.
    3. Добавьте 3 × 104 ячейки/лунку в 100 мкл к желаемому количеству лунок в 96-луночном планшете для культуры тканей с плоским дном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения репрезентативных результатов мы использовали в общей сложности 48 скважин (четыре условия, выполненные в трех экземплярах, подготовленных для четырех различных анализов в разделах 3 и 4), но это может быть скорректировано для 60 скважин. Заполните все оставшиеся лунки PBS 100 μл/лунка, чтобы предотвратить высыхание, особенно наружные лунки. Мы рекомендуем готовить разные пластины для каждого метода анализа.
    4. Добавьте 1 μл/лунку иммуномодулирующих препаратов в нужные лунки (здесь 10 нг/мл рапы). Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 °C с 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При включении иммуностимуляции на 8-й день подготовьте лунки для иммуномодулирующего препарата как с иммуностимуляцией, так и без нее. Применение иммуностимуляции зрелых моДК является необязательным.
  2. Размораживание Т-клеток.
    1. На 8-й день извлеките два криовалиала из криотанки и разморозьте криовалиал в горячей ванне с шариками или на водяной бане при температуре 37 °C до тех пор, пока содержимое не начнет плавиться (через <3 минуты).
    2. Когда содержимое начнет плавиться, переложите флаконы в колпак для клеточных культур и нанесите в пробирку 1 мл теплой среды для культуры Т-клеток для быстрого оттаивания. Переложите все содержимое флакона в пробирку объемом 50 мл. Промойте криовиальные клетки 1 мл питательной среды для Т-клеток, чтобы убедиться, что все клетки перенесены в пробирку.
    3. Долейте в суспензию раствор Flow Staining Solution (Таблица 1) до 15 мл. Центрифугируйте при 200 × г в течение 10 мин и отсасывайте надосадочную жидкость. Затем повторно суспендируйте гранулу в 5 мл раствора для окрашивания под воздействием и снова центрифугируйте.
    4. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 1 мл теплой среды для культивирования Т-клеток. Посчитайте клетки с помощью гемацитометра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность должна составлять >70% на данном этапе; если остается большое количество мертвых клеток, переложите в свежую пробирку, добавьте 10 мл раствора для окрашивания клеток, центрифугируйте при 200 × г в течение 5 минут, повторно суспендируйте в 1 мл среды Т-клеток и пересчитайте.
    5. Добавьте 9 мл теплой питательной среды для Т-клеток, чтобы получить окончательный объем 10 мл. Переложите суспензию в чашку Петри. Пометьте его как «Оттаявшие Т-клетки» и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 °C с 5%CO2 , чтобы дать клеткам отдохнуть.
  3. Промойте пластину moDC и при желании добавьте иммуностимулятор.
    1. На 8-й день центрифугируйте планшет moDC (с 7-го дня) при 300 × г в течение 5 минут.
    2. Отсадите надосадочную жидкость, промойте теплой HBSS, повторите центрифугирование, снова аспирируйте и повторно суспендируйте клетки в теплой культуральной среде moDC, содержащей GM-CSF и IL-4 (100 мкл/лунка).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не потревожить клетки. Наклоняйте пластину во время аспирации. В лунке может оставаться около 10 μл.
    3. При использовании иммуностимуляции добавьте 1 μл/лунку 100-кратного запасного ЛПС (или другого иммуностимулирующего средства) в желаемые лунки. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 °C с 5% CO2.

3. Анализ расхода на moDC (валидация + допуск)

  1. Анализ потока для валидации моДК
    1. На 8-й день приготовьте коктейли антител для валидационной панели, нацеленные на следующие маркеры: HLA-DR, CD14, лектин C-типа, специфичный для дендритных клеток (DC-SIGN), CD1c и CD40, как описано в таблице 2. Разведите все антитела раствором проточного красителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Панель была разработана для 7-канального красно-синего лазерного проточного цитометра.
    2. Достаньте планшет moDC из инкубатора. Центрифугируйте планшет при 300 × г в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость. Дополнительно: Сохраните надосадочную жидкость для анализа методом ИФА на цитокины IL-10 и TNFα с помощью коммерчески доступных наборов в соответствии с инструкциями производителя.
    3. Добавьте 200 μл/лунку раствора для окрашивания потоком. Центрифугируйте планшет при 300 × г в течение 5 минут.
    4. Аспирируйте надосадочную жидкость и добавьте 50 мкл/лунку антитела ингибитора связывания Fc-рецептора, разведенного в соотношении 1:200 в растворе для окрашивания в потоке, чтобы блокировать неспецифическое связывание. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут.
    5. Добавьте 50 мкл/лунку приготовленного коктейля антител Validation Panel .
    6. Приготовьте компенсационные регуляторы в планшете или в пробирках объемом 1,5 мл, смешав 50 мкл компенсационных шариков с 50 мкл каждого разведенного антитела. Инкубируйте планшет при температуре 4 °C в течение 1 ч.
      Примечание: Здесь используются компенсационные шарики, а не ячейки для компенсации из-за потенциально низкой экспрессии маркеров на moDC.
    7. Промыть, центрифугируя при 300 × г в течение 5 минут, удаляя надосадочную жидкость и снова суспендируя в 200 μл раствора для окрашивания потоком. Выполните две промывки.
    8. После окончательной промывки снова центрифугируйте и повторно суспендируйте клетки в 110 мкл/лунку раствора для окрашивания под потоком. Теперь образцы готовы к анализу проточной цитометрии.
  2. Анализ расхода на толерогенный moDC (панель допусков)
    1. Аналогично шагу 3.1 на 8-й день приготовьте коктейли антител для панели толерантности, нацеленные на следующие маркеры: CD86, PD-L1, DC-SIGN, CD1c, BTLA и CD40 (Таблица 2).
    2. Повторите шаги 3.1.2-3.1.8, заменив коктейль антител коктейлем Tolerance Panel .

4. Анализ потока Т-клеток

  1. Комбинируйте Т-клетки с обработанными толерогенными моDC.
    1. На 9-й день достаньте из инкубатора размороженную чашку Петри с Т-клетками и перенесите все Т-клетки в пробирку объемом 50 мл. Долейте с помощью раствора для окрашивания Flow.
    2. Дополнительно: При проведении анализа пролиферации Т-клеток разделите Т-клетки на две пробирки.
      1. С помощью первой пробирки уменьшите давление при 250 × г в течение 5 минут и удалите надосадочную жидкость. Окрасьте эту пробирку красителем для пролиферации клеток в соответствии с инструкциями производителя.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Мы использовали краситель Fixable Viability Dye eFluor 670, который требует 30-минутной инкубации с последующим двумя этапами промывки. Мы рекомендуем использовать конические пробирки объемом 50 мл для предотвращения потери клеток и использовать HBSS с 10% HIFBS для стирки после окрашивания.
      2. Используйте вторую пробирку, содержащую неокрашенные Т-клетки, для анализа Treg. Аналогичным образом отверните при 250 × г в течение 5 минут, удалите надосадочную жидкость, повторно суспендируйте в теплой среде для клеточных культур и держите в инкубаторе в процессе окрашивания. Если пролиферация Т-клеток не требуется, раскрутите все Т-клетки и замените их теплой средой для культивирования Т-клеток.
    3. Подсчитайте клетки и получите не менее 4 миллионов (только для анализа Treg) или 8 миллионов (для анализа Treg и T-пролиферации).
    4. Достаньте планшет moDC из инкубатора с оставшимися лунками, центрифугируйте при 300 × г в течение 5 мин и обработайте надосадочную жидкость. Добавьте 200 мкл/лунка Т-клеток в концентрации 1,6 ×10 5 клеток/лунку. Добавьте неокрашенные Т-клетки для аналитических планшетов Treg и окрашенные Т-клетки для пластин пролиферации Т-клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит поддерживать соотношение Т-клеток к moDC 5:1, так как первоначальные 3 ×104 moDC обычно немного расширяются.
    5. Добавьте 25 мкл/мл коктейля антител против CD3/CD28 во все группы, кроме лунок отрицательного контроля, для стимуляции Т-клеток. Инкубируйте планшет в течение 72 часов при 37 °C с 5%CO2 до 12-го дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте окрашенные Т-клетки для анализа пролиферации и неокрашенные для анализа Treg.
  2. Анализ потока Treg
    1. Поверхностное окрашивание маркером
      1. На 12-й день приготовьте коктейли с антителами для панели Treg (табл. 2).
      2. Перенесите все клеточные суспензии из 96-луночного планшета в планшет с V-образным дном с помощью раствора для окрашивания потоком. Сохраните надосадочную жидкость для анализа цитокинов.
      3. Промойте ячейки 2 раза центрифугированием (200 × г в течение 5 минут, а затем 200 мкл раствора для окрашивания Flow). Отложите несколько ячеек для управления компенсацией. Отложите один для окрашивания FOXP3 и для незагрязненных элементов управления.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем расчесывать 10 мкл всех образцов перед окончательным отжимом на шаге 4.2.1.3 для получения необходимых компенсационных контролей. Это обеспечивает репрезентативную выборку экспрессии каждого маркера на поверхностном уровне на клетках.
      4. После второй промывки центрифугируйте при 200 x g в течение 5 минут при комнатной температуре и аспирируйте, затем добавьте 50 μл/лунку антитело ингибитора связывания Fc-рецептора (разведенное 1:200 в растворе для окрашивания потоком). Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут.
      5. Добавьте 50 μл/лунку приготовленного коктейля антител Treg Panel .
      6. Для контроля компенсации смешайте 50 мкл неокрашенных компенсационных клеток с 50 мкл каждого окрашенного антитела.
      7. Инкубируйте планшет и регуляторы компенсации при температуре 4 °C в течение 1 ч. Вымойте пластину один раз раствором Flow Stain Solution и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут.
      8. Окрашивание красителем Live/Dead Near-IR, разведенным в HBSS (1:1,000) в концентрации 200 μл/лунка. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 30 минут.
      9. Промойте пластину один раз раствором для окрашивания потоком (200 μл/лунка) при 300 × г в течение 5 минут.
    2. Запачкайте FoxP3 согласно инструкции производителя, для чего потребуется ночная инкубация. Краткий обзор протокола окрашивания FoxP3 описан ниже.
      1. Приготовьте рабочий раствор для фиксации/пермеабилизации FoxP3 в соответствии с инструкциями производителя. Смешайте 1 часть концентрата фиксации/пермеабилизации FoxP3 с 3 частями разбавителя фиксации/пермеабилизации FoxP3. Приготовьте 200 μл рабочего раствора на образец.
      2. Инкубируйте все образцы в 200 мкл/лунку рабочего раствора для фиксации/пермеабилизации. Оставьте при температуре 4 °C на 1 час.
      3. Приготовьте 1x Пермеабилизационный буфер: Смешайте 1 часть 10x Пермеабилизационного буфера (полученного из коммерческого набора) с 9 частями дистиллированной воды.
      4. Промойте пластину 2 раза с 1x Пермеабилизационным буфером (200 мкл/лунка) при 300 × г в течение 5 минут.
      5. Окрашивание антителом FoxP3 (PE-Cy5.5, разведение 1:300 в 1x буфере для пермеабилизации): добавьте 100 мкл/лунку разбавленного антитела FoxP3 и инкубируйте при 4 °C в течение ночи.
      6. Промойте пластину 2x с 1x Пермеабилизационным буфером (200 μл/лунка) при 300 × г в течение 5 минут.
      7. Ресуспендируйте элементы в 110 мкл/лунку раствора для окрашивания потоком.
      8. Проведите анализ проточной цитометрии.
  3. Анализ пролиферации Т-клеток
    1. Приготовьте коктейли антител для панели Т-пролиферации (табл. 2).
    2. Перенесите все клеточные суспензии из 96-луночного планшета в планшет с V-образным дном с помощью раствора для окрашивания потоком. Сохраняйте надосадочную жидкость для анализа цитокинов.
    3. Промойте ячейки 2 раза центрифугированием (200 × г в течение 5 минут, а затем 200 мкл раствора для окрашивания Flow). Отложите несколько ячеек для управления компенсацией. Отложите один для окрашивания FOXP3 и для незагрязненных элементов управления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем прочесывать 10 мкл всех образцов перед окончательным отжимом на шаге 4.3.3 для получения необходимых компенсационных контролей. Это обеспечивает репрезентативную выборку экспрессии каждого маркера на поверхностном уровне на клетках.
    4. После второго промывки центрифугируйте (200 × г в течение 5 минут при комнатной температуре) и отсадите, затем добавьте антитело к ингибитору Fc-рецепторов, связывающее 50 μл/лунку (разведенное в соотношении 1:200 в растворе для окрашивания в потоке). Выдерживать при комнатной температуре в течение 10 минут.
    5. Добавьте 50 мкл/лунку приготовленного коктейля антител T Proliferation Panel .
    6. Для контроля компенсации смешайте 50 мкл неокрашенных компенсационных клеток с 50 мкл каждого окрашенного антитела.
    7. Инкубируйте планшет и регуляторы компенсации при температуре 4 °C в течение 1 ч. Вымойте пластину один раз раствором Flow Stain Solution и центрифугируйте при 300 × г в течение 5 минут.
    8. Окрашивание красителем Live/Dead Near-IR, разведенным в HBSS (1:1,000) в концентрации 200 μл/лунка. Выдерживать при температуре 4 °C в течение 30 минут.
    9. Промойте пластину один раз раствором для окрашивания Flow Staining Solution (200 μл/лунка) при плотности 300 × г в течение 5 минут.
    10. Проведите анализ проточной цитометрии.

Результаты

Мы описали протокол для PBMC человека, выделили CD3+ Т-клетки и CD14+ моноциты с помощью коммерчески доступных наборов для магнитной сепарации, дифференцировали моноциты на CD14-, HLA-DR+, CD141+, CD1c+ moDCs с помощью GM-CSF и IL-4, обрабатывали их в течение 2...

Обсуждение

В данной работе мы описываем надежный и универсальный метод оценки функциональности иммуномодулирующих агентов для индуцирования толДК из моДК и валидации их функциональности для генерации Tregs из аутогенных Т-клеток ex vivo. В этом протоколе есть несколько важных ...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Центр иммунологии человека (HIC) Университета Пенсильвании за предоставление свежих человеческих PBMC от доноров. HIC частично поддерживается стандартами NIH P30 AI045008 и P30 CA016520.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-158General Cell Culture
1.5 mL Centrifuge TubeVWR77508-358General Cell Culture
10 mL Serological PipetsVWR414004-267General Cell Culture
100-1000 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-164General Cell Culture
15 mL Conical TubeVWR77508-212General Cell Culture
20-200 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-160General Cell Culture
2-MercaptoethanolMP Biomedical194834T Cell Culture
50 mL Conical TubeVWR21008-736General Cell Culture
60 x 15 mm Dish, Nunclon DeltaThermo Fischer150326General Cell Culture
96 Well Conical (V) Bottom Plate, Non-Treated SurfaceThermo Fischer277143General Cell Culture
96 well Flat Bottom PlateThermo Fischer161093General Cell Culture
APC/Cyanine7 anti-human CD272 (BTLA) AntibodyBiolegend344518Flow Cytometry
Attune NxT (Red/Blue Laser, 7 Channel)Thermo FischerA24863Flow Cytometry
BSAThermo Fischer15260-037General Cell Culture
CD14 Monoclonal Antibody (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Flow Cytometry
CD1c Monoclonal Antibody (L161), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42Flow Cytometry
CD209 (DC-SIGN) Monoclonal Antibody (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42Flow Cytometry
CD25 Monoclonal Antibody (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Flow Cytometry
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Flow Cytometry
CD4 Monoclonal Antibody (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Flow Cytometry
CD69 Monoclonal Antibody (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Flow Cytometry
CD86 Monoclonal Antibody (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Flow Cytometry
CD8a Monoclonal Antibody (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42Flow Cytometry
Conical Bottom (V-well) 96 Well PlateThermo Fischer2605Flow Cytometry
Cryogenic Vials, 2 mLThermo Fischer430488T Cell Culture
Dimethylsulfoxide (DMSO), Sequencing GradeThermo Fischer20688General Cell Culture
DPBSThermo Fischer14200166General Cell Culture
EasySep Human Monocyte Isolation KitStem Cell Technologies19359Cell Separation
EasySep Human T Cell Isolation KitStem Cell Technologies17951Cell Separation
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000Cell Separation
EDTAThermo FischerAIM9260GGeneral Cell Culture
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLStem Cell Technologies38025Cell Separation
Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal AntibodyThermo Fischer14-9161-73Flow Cytometry
Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670701General Cell Culture
Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Flow Cytometry
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SetThermo Fischer00-5523-00Flow Cytometry
FOXP3 Monoclonal Antibody (PCH101), PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42Flow Cytometry
HBSSThermo Fischer14170-112General Cell Culture
Heat Inactivated Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670801General Cell Culture
HEPES (1 M)Thermo Fischer15630106moDC Cell Culture
HLA-DR Monoclonal Antibody (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Flow Cytometry
Human CD3/CD28/CD2 T Cell ActivatorStemCell Technologies10970T Cell Culture
Human GM-CSF Recombinant ProteinThermo Fischer300-03moDC Cell Culture
Human IL-10 ELISA Kit, High SensitivityThermo FischerBMS215-2HSELISA
Human IL-4, Animal-Free Recombinant ProteinThermo FischerAF-200-04moDC Cell Culture
Human PBMC (Freshly Isolated)UPenn HICN/ACells
Human TNF alpha ELISA KitThermo FischerBMS223-4ELISA
Light Microscope (DMi1)Lucia391240General Cell Culture
Lipopolysaccaride (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC Cell Culture
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitThermo FischerL34975Flow Cytometry
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fischer11140050T Cell Culture
Penicillin-Streptomycin (100x)Thermo Fischer15140122General Cell Culture
Pipette ControllerVWR77575-370General Cell Culture
Rapamycin, 98+%Thermo FischerJ62473.MFmoDC Cell Culture
RPMI 1640 with GlutamaxThermo Fischer61870-036General Cell Culture
Separation BufferStem Cell Technologies20144Cell Separation
T Cell Stimulation Cocktail (500x)Thermo Fischer00-4970-93T Cell Culture
UltraComp eBead Plus Compensation BeadsThermo Fischer01-3333-41Flow Cytometry
Variable Pipette SetFischer Scientific05-403-152General Cell Culture

Ссылки

  1. Banchereau, J., et al. Immunobiology of dendritic cells. Annu Rev Immunol. 18 (1), 767-811 (2000).
  2. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440 (7085), 808-812 (2006).
  3. Anderson, A. E., et al. LPS activation is required for migratory activity and antigen presentation by tolerogenic dendritic cells. J Leukoc Bio. 85 (2), 243-250 (2009).
  4. Iberg, C. A., Hawiger, D. Natural and induced tolerogenic dendritic cells. J Immunol. 204 (4), 733-744 (2020).
  5. Ness, S., Lin, S., Gordon, J. R. Regulatory dendritic cells, T cell tolerance, and dendritic cell therapy for immunologic disease. Front Immunol. 12, 633436 (2021).
  6. Ali, S., et al. Sources of type I interferons in infectious immunity: Plasmacytoid dendritic cells not always in the driver's seat. Front Immunol. 10, 778 (2019).
  7. Fossum, E., et al. Targeting antigens to different receptors on conventional type 1 dendritic cells impacts the immune response. J Immunol. 205 (3), 661-673 (2020).
  8. Kedl, R. M., et al. Migratory dendritic cells acquire and present lymphatic endothelial cell-archived antigens during lymph node contraction. Nat Comm. 8 (1), 2034 (2017).
  9. Chow, K. V., Sutherland, R. M., Zhan, Y., Lew, A. M. Heterogeneity, functional specialization and differentiation of monocyte-derived dendritic cells. Immun Cell Biol. 95 (3), 244-251 (2017).
  10. Johnson, R. K., Overlee, B. L., Sagen, J. A., Howe, C. L. Peripheral blood mononuclear cell phenotype and function are maintained after overnight shipping of whole blood. Sci Rep. 12 (1), 19920 (2022).
  11. Boks, M. A., et al. IL-10-generated tolerogenic dendritic cells are optimal for functional regulatory T cell induction - A comparative study of human clinical-applicable DC. Clinl Immunol. 142 (3), 332-342 (2012).
  12. Navarro-Barriuso, J., et al. Vitamin D3-induced tolerogenic dendritic cells modulate the transcriptomic profile of T CD4+ cells towards a functional hyporesponsiveness. Front Immunol. 11, 599623 (2021).
  13. Moorman, C. D., Sohn, S. J., Phee, H. Emerging therapeutics for immune tolerance: Tolerogenic vaccines T cell therapy, and IL-2 therapy. Front Immunol. 12, 657768 (2021).
  14. Kenison, J. E., et al. Tolerogenic nanoparticles suppress central nervous system inflammation. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (50), 32017-32028 (2020).
  15. Neshat, S. Y., et al. Improvement of islet engrafts via Treg induction using immunomodulating polymeric tolerogenic microparticles. ACS Biomater Sci Eng. 9 (6), 3522-3534 (2023).
  16. Deak, P., Knight, R., Esser-Kahn, A. Robust tolerogenic dendritic cells via push/pull pairing of toll-like-receptor agonists and immunomodulators reduces EAE. Biomaterials. 286, 121571 (2022).
  17. Møller, S. H., Wang, L., Ho, P. -. C. Metabolic programming in dendritic cells tailors immune responses and homeostasis. Cell Mol Immunoly. 19 (3), 370-383 (2022).
  18. Adamik, J., et al. Distinct metabolic states guide maturation of inflammatory and tolerogenic dendritic cells. Nat Comm. 13 (1), 5184 (2022).
  19. Hals, I. K., et al. Investigating optimal β-cell-preserving treatment in latent autoimmune diabetes in adults: Results from a 21-month randomized trial. Diabetes Obes Metab. 21 (10), 2219-2227 (2019).
  20. Gammon, J. M., et al. Engineering the lymph node environment promotes antigen-specific efficacy in type 1 diabetes and islet transplantation. Nat Comm. 14 (1), 681 (2023).
  21. Sim, W. J., Malinarich, F., Fairhurst, A. -. M., Connolly, J. E. Generation of immature, mature and tolerogenic dendritic cells with differing metabolic phenotypes. J Vis Exp. (112), e54128 (2016).
  22. Jia, S., Kim, J., Esser-Kahn, A. P., Deak, P. High-throughput screening identification of novel immunomodulatory combinations for the generation of tolerogenic dendritic cells. Front Med. 10, 1298424 (2024).
  23. Dinh, B., et al. Isolation and cryopreservation of highly viable human peripheral blood mononuclear cells from whole blood: A guide for beginners. J Vis Exp. (212), e66794 (2024).
  24. Akkaya, B., et al. Regulatory T cells mediate specific suppression by depleting peptide-MHC class II from dendritic cells. Nat Immunol. 20 (2), 218-231 (2019).
  25. Stallone, G., et al. mTOR inhibitors effects on regulatory T cells and on dendritic cells. J Trans Med. 14 (1), 152 (2016).
  26. Dahlqvist, G., et al. Modulatory effect of rapamycin and tacrolimus on monocyte-derived dendritic cells phenotype and function. Immunobiology. 226 (1), 152031 (2021).
  27. Cimen Bozkus, C., Blazquez, A. B., Enokida, T., Bhardwaj, N. A T-cell-based immunogenicity protocol for evaluating human antigen-specific responses. STAR Protoc. 2 (3), 100758 (2021).
  28. Nakayama, M., Michels, A. W. Determining antigen specificity of human islet infiltrating T cells in type 1 diabetes. Front Immunol. 10, 365 (2019).
  29. Gregori, S., et al. Differentiation of type 1 T regulatory cells (Tr1) by tolerogenic DC-10 requires the IL-10-dependent ILT4/HLA-G pathway. Blood. 116 (6), 935-944 (2010).
  30. Taner, T., Hackstein, H., Wang, Z., Morelli, A. E., Thomson, A. W. Rapamycin-treated, alloantigen-pulsed host dendritic cells induce Ag-specific T cell regulation and prolong graft survival. Am J Transpl. 5 (2), 228-236 (2005).
  31. Baroja-Mazo, A., Revilla-Nuin, B., Ramírez, P., Pons, J. A. Immunosuppressive potency of mechanistic target of rapamycin inhibitors in solid-organ transplantation. World J Transplant. 6 (1), 183-192 (2016).
  32. Phillips, B. E., Garciafigueroa, Y., Trucco, M., Giannoukakis, N. Clinical tolerogenic dendritic cells: Exploring therapeutic impact on human autoimmune disease. Front Immunol. 8, 1279 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

218

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены