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摘要

我们描述了一种程序，用于评估药物在 体外 从幼稚单核细胞衍生的树突状细胞产生耐受性树突状细胞的能力，并通过自体调节性 T 细胞生成验证其效力。

摘要

致耐受性树突状细胞 （tolDC） 是树突状细胞 （DC） 的一个亚群，已知会影响初始 T 细胞向调节性 T 细胞 （Treg） 表型发展。TolDC 目前正在作为自身免疫和移植的疗法进行研究，既作为细胞疗法，也作为从内源性 DC 诱导 tolDC 的方法。然而，迄今为止，已知的从幼稚 DC 诱导 tolDC 的药物数量相对较少，并且它们在 体内 产生 Treg 的效力一直不一致，尤其是从内源性 DC 诱导 tolDC 的疗法。这为探索产生耐受性的新型化合物提供了机会。

在这里，我们描述了一种 在体外 单核细胞衍生的 DC （moDC） 上测试新型免疫调节化合物并验证其生成自体 Treg 的功能的方法。首先，我们获得 PBMC 并使用市售的磁性分离试剂盒分离 CD14 + 单核细胞和 CD3 + T 细胞。接下来，我们将单核细胞分化为 moDC，用已建立的免疫调节剂（如雷帕霉素、地塞米松、IL-10 或维生素 D3）处理它们 24 小时，并测试它们在耐受性标志物中的变化作为对方案的验证。最后，我们在抗 CD3/CD28 刺激存在下将诱导的 tolDC 与自体 T 细胞共培养，并观察 Treg 群体和 T 细胞增殖的变化。我们设想该协议用于评估新型免疫调节剂将已经分化的 DC 重新编程为 tolDC 的疗效。

引言

树突状细胞 （DC） 是先天免疫和适应性免疫之间的关键介质。DC 主要存在于粘膜、皮肤和淋巴组织中，是主要的抗原呈递细胞 （APC）1。DC 摄取外来蛋白质并加工并呈递到幼稚 T 细胞的主要组织相容性 （MHC） 蛋白上。DC 特异性表达 MHC II 类蛋白，例如人类中的人类白细胞抗原 DR （HLA-DR）。抗原暴露时 DC 的激活状态对于下游 T 细胞反应至关重要2。未成熟的树突状细胞表达各种模式识别受体 （PRR），这些受体识别称为病原体相关分子模式 （PAMP） 的分子类别，例如细菌壁成分脂多糖 （LPS）3。PRR 刺激后，树突状细胞变成成熟的树突状细胞，上调重要的 T 细胞共刺激蛋白，如 CD80、CD86 和 CD40，并分泌促炎细胞因子，如肿瘤坏死因子-α （TNFα），促进初始 T 细胞分化为常规效应 T 细胞或辅助性 T 细胞2。相反，如果 DC 成熟中断或 DC 在耐受性环境中发育，则 DC 可以产生耐受性 DC 状态 （tolDC）4。TolDC 下调经典 T 细胞共刺激受体，上调程序性细胞死亡配体 1 （PD-L1） 和 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞衰减剂 （BTLA） 等耐受受体，并产生白细胞介素 10 （IL-10） 和转化生长因子 β （TGF-β）4 等抑制性细胞因子。这不是一个完整的公差标记列表，事实上，对于哪些 tolDC 标记适合定义 tolDC 状态5，共识有限。考虑到这一点，我们建议调节性 T 细胞 （Treg） 生成作为功能标志物，应用于比较各种 tolDC 诱导剂的有效性。

除了 tolDC/成熟 DC 激活状态外，还可以根据其谱系或组织位置对 DC 进行分类，每个子集显示的功能略有不同。虽然 tolDC/成熟 DC 分裂不太明确，并且更多地作为一个连续体存在，但谱系分裂在人和小鼠中都有明确的标志物。DC 前体在骨髓中形成，但根据其谱系，DC 有两种主要亚型：1） 浆细胞样树突状细胞 （pDC），来源于淋巴系，和 2） 常规树突状细胞 （cDC），来源于骨髓谱系。在人类中，pDC 在淋巴器官中成熟，表达 CD303，并且在病毒感染中具有高度反应性6。同时，表达 CD11c 的 cDC 在外周组织中成熟，并存在于两种不同的亚型中，即 CD1c+ cDC1 和 CD141+ cDC2，它们各自产生不同的 T 细胞反应7。此外，所有 cDC 都可以存在于组织驻留 （CD103-） 或迁移 （CD103+） 亚状态8 中。最后，在某些条件下，来自单核细胞谱系 （CD14+） 的细胞可以被诱导成树突状细胞表型，并被鉴定为 CD14-、CD141+、CD1c+ 9。这些细胞被称为单核细胞衍生的 DC （moDC），是人类 离体 分析最常用的细胞，因为单核细胞约占人类外周血单核细胞 （PBMC） 的 10-30%，而 pDC 仅占 1-3%10。这使得 moDC 成为一个有吸引力的选择，但众所周知，moDC 比从原代组织中分离的典型 cDC 更具炎症性 9。

目前有两大类努力使用 tolDC 来产生临床耐受性。首先，tolDC 由单核细胞产生，用作细胞疗法。在这种范式中，moDC 通常使用 IL-4/GM-CSF 与免疫调节剂（如维生素 D3、雷帕霉素 （rapa）、IL-10、地塞米松或这些11,12 的组合）进行区分。这些 tolDC 已被探索为自身免疫和移植的自体细胞疗法13。tolDC 的另一个用途是使用游离药物或纳米载体将内源性 DC 重编程为 tolDC，以递送免疫调节剂和目标抗原 14,15,16。然而，由于通常与 tolDC 代谢相反的 DC 的稳健代谢表型的发展，已经分化的 DC 的诱导更具挑战性17,18。对于大多数药物免疫调节剂来说，这是一个很高的标准;出于这个原因，大多数内源性 DC 重编程研究报告了有效的 DC 抑制和一些 Treg 诱导，但缺乏临床成功，通常是由于缺乏 T 细胞持久性 15,19,20。这突出了从现有 DC 中识别潜在 tolDC 诱导剂的策略的必要性。

在这里，我们提出了一种针对分化 moDC 的 免疫 调节剂体外评估方法，其最终指标为自体 Treg 诱导。该协议旨在评估免疫调节剂对已经分化的人类 moDC 进行重编程以实现耐受性的有效性。此外，该协议验证了重编程的 tolDC 的功能，以针对从同一 PBMC 样品中分离的自体 T 细胞产生 Treg。这与在分化过程中诱导耐受性和/或用来自同种异体供体的 T 细胞攻击 tolDC 的其他方案形成鲜明对比21。在该协议中，我们使用常见的耐受剂 rapa 作为示例，但也证明了 rapa 处理的 moDC 产生 Tregs 的有效性有限。在我们的代表性结果中，我们还显示了其他常见免疫调节治疗的疗效，例如 IL-10、地塞米松和维生素 D3。我们设想该协议用于筛选针对已建立的 moDC 的潜在更有效的 tolDC 诱导剂22。

研究方案

所有人外周血单核细胞 （PBMC） 样本均来自宾夕法尼亚大学人类免疫学核心，来自身份不明的供体，事先获得宾夕法尼亚大学机构审查委员会 （IRB） 的批准并征得患者同意。

可选：虽然在这种方法中，我们使用了从学术实验室获得的新鲜分离的 PBMC，但 PBMC 可以从全血或富含白细胞去除术的血液制品中分离出来。我们建议使用密度梯度离心法，因为这是一种成熟且可靠的方法，将在别处描述23。

1. 单核细胞/T 细胞的分离和 moDC 分化

  1. 从 PBMC 中分离单核细胞和 T 细胞 - 第 1 天
    1. 从健康供体获得 2 亿个人 PBMC。将细胞保存在 15 mL 试管中，并在冰上转移。
    2. 将 50 mL 分离缓冲液（在市售分离试剂盒中提供）分装在锥形管中。
      注：分离缓冲液也可以用含 2% 胎牛血清 （FBS） 和 1 mM 乙二胺四乙酸 （EDTA） 的 DPBS 代替。
    3. 从冰中取出 PBMC 管，并加入分离缓冲液。以 300 x g 离心 5 分钟。
    4. 使用 10 mL 血清移液管吸出上清液。使用血清移液管将细胞沉淀重悬于 4 mL 推荐培养基中。
    5. 将悬浮液分成两个不同的 15 mL 试管，每管添加 2 mL（每管 5 × 107 个细胞/mL）。将一根管标记为“T”，将另一根标记为“单核细胞”。
    6. 检索 人单核细胞分离试剂盒 并按照制造商的方案从单核细胞标记的试管中分离单核细胞。
    7. 检索 人 T 细胞分离试剂盒 ，并按照制造商的第二管方案分离 T 细胞。
  2. 用于 T 细胞分化和冷冻的单核细胞铺板 - 第 1 天
    1. 在 37 °C 下预热 50 mL moDC 培养基（表 1）至少 10 分钟。
    2. 将 15 mL 管中富含单核细胞的管子和步骤 1.1 中含有 T 细胞的 15 mL 管以 250 × g 离心 5 分钟。
    3. 吸出上清液。通过上下吹打，将单核细胞重悬于 1 mL moDC 培养基中，重悬于 T 细胞培养基中的 T 细胞（表 1）。确保颗粒正确分散。
    4. 使用自动细胞计数仪或手动血细胞计数器和台盼蓝染色对细胞进行计数。
      注：对于代表性数据，分离了 1000 万个 T 细胞和 300 万个单核细胞。
    5. 取含有单核细胞的试管，向悬浮液中加入 9 mL 温热的 moDC 培养基，最终体积为 10 mL。然后，加入 10 μg/mL GM-CSF 和 10 μg/mL IL-4 储备液各 100 μL，使培养基中 GM-CSF 和 IL-4 的最终浓度为 100 ng/mL。将悬浮液转移到培养皿中，并标记为“moDC”（第 1 天），并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育。
    6. 取 T 细胞管，将 1 mL T 细胞冷冻培养基（表 1）与 1 mL T 细胞悬液混合。分成两个 2 mL 冻存管（1 mL/小瓶）;密封（终浓度为每瓶 500 万个细胞）。将冻存管放入冷冻室中，并在未使用的孔中放置平衡管。将腔室在 −80 °C 下储存过夜，然后将冻存管转移到冻存管中。
    7. 第 4 天，加入 5 mL 新鲜 moDC 培养基刷新培养基，并添加 100 μL GM-CSF 和 IL-4 储备液。差异化的 moDC 将在第 7 天准备就绪。

2. 添加免疫调节药物以产生耐受性 moDC

  1. 设置 moDC 板。
    1. 第 7 天，从培养箱中取回分化的 moDC，并将 moDC 细胞悬液转移到 50 mL 试管中。
    2. 将悬浮液以 250 × g 离心 5 分钟。吸出上清液，并通过上下吹打将细胞沉淀重悬于 1 mL 温热的 moDC 培养基中。用血细胞计数器计数细胞，并在含有 100 ng/mL GM-CSF 和 IL-4 的温热 moDC 培养基中将细胞稀释至 3 ×10 5 个细胞/mL 的浓度。
    3. 在平底 96 孔组织培养板中，将 3 × 10 个4 个细胞/孔的 100 μL 加入到所需孔数中。
      注意：对于代表性结果，我们总共使用了 48 个孔（四个条件一式三份，为第 3 节和第 4 节中的四种不同分析准备），但这最多可以调整为 60 个孔。用 100 μL/孔 PBS 填充所有剩余的孔，以防止干燥，尤其是外孔。我们建议为每种分析方法准备不同的板。
    4. 向所需的孔中加入 1 μL/孔的免疫调节药物（这里为 10 ng/mL rapa）。将板在 37 °C 和 5% CO2 下孵育过夜。
      注意：如果在第 8 天包括免疫刺激，请为有和没有免疫刺激的免疫调节药物准备孔。使用免疫刺激来成熟 moDC 是可选的。
  2. 解冻 T 细胞。
    1. 第 8 天，从低温槽中取出两个冷冻管，并在 37 °C 的热珠浴或水浴中解冻冷冻管，直到内容物开始熔化（<3 分钟）。
    2. 当内容物开始熔化时，将样品瓶转移到细胞培养罩中，将 1 mL 温热的 T 细胞培养基移入样品瓶中以快速解冻。将样品瓶中的所有内容物转移到 50 mL 试管中。用 1 mL T 细胞培养基冲洗冻存管，以确保所有细胞都转移到试管中。
    3. 用流式染色液（表 1）将悬浮液加满至 15 mL。以 200 × g 离心 10 分钟并吸出上清液。然后，将沉淀重悬于 5 mL 流式染色溶液中并再次离心。
    4. 吸出上清液，并将细胞重悬于 1 mL 温热的 T 细胞培养基中。使用血细胞计数器计数细胞。
      注：现阶段的存活率应为 >70%;如果残留大量死细胞，则转移到新试管中，加入 10 mL 细胞染色溶液，以 200 × g 离心 5 分钟，重悬于 1 mL T 细胞培养基中，然后重新计数。
    5. 加入 9 mL 温热的 T 细胞培养基，使最终体积为 10 mL。将悬浮液转移到培养皿中。将其标记为“解冻的 T 细胞”，并在 37 °C 和 5% CO2 下孵育过夜，让细胞休息。
  3. 如果需要，清洗 moDC 板并添加免疫刺激剂。
    1. 在第 8 天，将 moDC 板（从第 7 天开始）以 300 × g 离心 5 分钟。
    2. 吸出上清液，用温热的 HBSS 洗涤，重复离心，再次吸出，并将细胞重悬于含有 GM-CSF 和 IL-4（100 μL/孔）的温热 moDC 培养基中。
      注意：小心不要打扰细胞。吸液过程中倾斜板。孔中可保留约 10 μL。
    3. 如果使用免疫刺激，则向所需孔中加入 1 μL/孔的 100x 原液 LPS（或其他免疫刺激剂）。将板在 37 °C 和 5% CO2 下孵育过夜。

3. moDC 的流分析（验证 + 容差）

  1. 用于验证 moDC 的流分析
    1. 第 8 天，为 验证组合准备抗体混合物，靶向以下标志物：HLA-DR、CD14、树突状细胞特异性 C 型凝集素 （DC-SIGN）、CD1c 和 CD40，如 表 2 所述。用流染剂溶液稀释所有抗体。
      注：该面板专为 7 通道红/蓝激光流式细胞仪而设计。
    2. 从培养箱中取出 moDC 板。将板以 300 × g 离心 5 分钟。去除上清液。 可选：根据制造商的说明，使用市售试剂盒保留上清液，用于细胞因子 IL-10 和 TNFα 的 ELISA 分析。
    3. 添加 200 μL/孔的流式染色溶液。将板以 300 × g 离心 5 分钟。
    4. 吸出上清液，加入 50 μL/孔的 Fc 受体结合抑制剂抗体，以 1：200 稀释于流式染色溶液中，以阻断非特异性结合。在室温 （RT） 下孵育 30 分钟。
    5. 加入 50 μL/孔的制备好的 Validation Panel 抗体混合物。
    6. 通过将 50 μL 补偿珠与 50 μL 每种稀释抗体混合，在板或 1.5 mL 试管中制备补偿对照。将板在 4 °C 下孵育 1 小时。
      注：此处使用补偿珠而不是细胞进行补偿，因为 moDC 上的标记物表达可能较低。
    7. 以 300 × g 离心 5 分钟，去除上清液，然后重悬于 200 μL 流式染色溶液中进行洗涤。执行两次洗涤。
    8. 最后一次洗涤后，再次离心并将细胞重悬于 110 μL/孔的流式染色液中。样品现在可用于流式细胞术分析。
  2. 耐受性 moDC 的流量分析（公差面板）
    1. 与第 8 天的步骤 3.1 类似，为 耐受性面板准备抗体混合物，靶向以下标志物：CD86、PD-L1、DC-SIGN、CD1c、BTLA 和 CD40（表 2）。
    2. 重复步骤 3.1.2-3.1.8，用 Tolerance Panel 混合物替换抗体混合物。

4. T 细胞的流式分析

  1. 将 T 细胞与处理的致耐受性 moDC 结合。
    1. 第 9 天，从培养箱中取出解冻的 T 细胞培养皿，并将所有 T 细胞转移到 50 mL 试管中。用流式染色液加满。
    2. 可选：如果进行 T 细胞增殖分析，请将 T 细胞分成两管。
      1. 使用第一根试管，以 250 × g 离心 5 分钟，然后去除上清液。根据制造商的说明用细胞增殖染料对该管进行染色。
        注：我们使用了 Fixable Viability Dye eFluor 670，它需要 30 分钟的孵育步骤，然后是两个洗涤步骤。我们建议使用 50 mL 锥形管来防止细胞丢失，并在染色后使用含 10% HIFBS 的 HBSS 进行洗涤。
      2. 使用含有未染色 T 细胞的第二支试管进行 Treg 分析。同样，以 250 × g 离心 5 分钟，去除上清液，重悬于温热的细胞培养基中，并在染色过程中保存在培养箱中。如果不需要 T 细胞增殖，则离心所有 T 细胞并用温热的 T 细胞培养基替换它们。
    3. 对细胞进行计数并获得至少 400 万个（仅用于 Treg 分析）或 800 万个（用于 Treg 和 T 增殖分析）。
    4. 从培养箱中取出带有剩余孔的 moDC 板，以 300 × g 离心 5 分钟，并加入上清液。以 1.6 × 105 个细胞/孔的密度添加 200 μL/孔 T 细胞。添加未染色的 T 细胞用于 Treg 分析板，添加染色的 T 细胞用于 T 细胞增殖板。
      注意：这将保持 T 细胞与 moDC 的比率为 5：1，因为最初的 3 ×104 moDC 通常会略微膨胀。
    5. 向除阴性对照孔外的所有组添加 25 μL/mL 抗 CD3/CD28 抗体混合物以刺激 T 细胞。将板在 37 °C 和 5% CO2 下孵育 72 小时，直至第 12 天。
      注：确保使用染色的 T 细胞进行增殖分析，使用未染色的 T 细胞进行 Treg 分析。
  2. Treg 流分析
    1. 表面标记物染色
      1. 第 12 天，为 Treg 检测组合准备抗体混合物（表 2）。
      2. 将所有细胞悬液从 96 孔培养板转移到含有流式染色液的 V 形底板中。保留上清液用于细胞因子分析。
      3. 通过离心洗涤细胞 2 次（200 × g 5 分钟，然后加入 200 μL Flow 染色溶液）。留出一些单元格用于补偿控制。将一个留作 FOXP3 染色和未染色的对照。
        注：我们建议在步骤 4.2.1.3 的最终离心之前梳理 10 μL 所有样品，以获得必要的补偿对照。这提供了细胞上每个标记物的所有表面水平表达的代表性样品。
      4. 第二次洗涤后，在室温下以 200 x g 离心 5 分钟并吸出，然后加入 50 μL/孔 Fc 受体结合抑制剂抗体（在流式染色溶液中以 1：200 稀释）。在室温下孵育 10 分钟。
      5. 加入 50 μL/孔制备好的 Treg Panel 抗体混合物。
      6. 对于补偿对照，将 50 μL 未染色的补偿池与 50 μL 每种单一染色抗体混合。
      7. 将板和补偿对照在 4 °C 下孵育 1 小时。用 Flow Stain 溶液洗涤板一次，并以 300 × g 离心 5 分钟。
      8. 使用用 HBSS （1：1,000） 稀释的 Live/Dead 近红外染料以 200 μL/孔进行染色。在 4 °C 孵育 30 分钟。
      9. 用 300 × g 的流式染色液（200 μL/孔）洗涤板一次，持续 5 分钟。
    2. 根据制造商的说明用 FoxP3 染色，这需要过夜孵育。下面介绍了 FoxP3 染色方案的简要概述。
      1. 根据制造商的说明准备 FoxP3 固定/透化工作溶液 。将 1 份 FoxP3 固定/透化浓缩液与 3 份 FoxP3 固定/透化稀释剂混合。每个样品准备 200 μL 的工作溶液。
      2. 将所有样品在 200 μL/孔的工作固定/透化溶液中孵育。在 4 °C 下放置 1 小时。
      3. 制备 1x 透化缓冲液：将 1 份 10x 透化缓冲液（从商业试剂盒中获得）与 9 份蒸馏水混合。
      4. 用 1x 透化缓冲液（200 μL/孔）以 300 × g 洗涤板 2 次，持续 5 分钟。
      5. 用 FoxP3 抗体（PE-Cy5.5，在 1x 透化缓冲液中以 1：300 稀释）染色：加入 100 μL/孔稀释的 FoxP3 抗体，并在 4 °C 下孵育过夜。
      6. 用 1x 透化缓冲液（200 μL/孔）以 300 × g 洗涤板 2 次，持续 5 分钟。
      7. 将细胞重悬于 110 μL/孔的流式染色溶液中。
      8. 进行流式细胞术分析。
  3. T 细胞增殖分析
    1. 为 T 增殖检测组合 准备抗体混合物（表 2）。
    2. 将所有细胞悬液从 96 孔培养板转移到含有流式染色液的 V 形底板中。保留上清液用于细胞因子分析。
    3. 通过离心洗涤细胞 2 次（200 × g 5 分钟，然后加入 200 μL Flow 染色溶液）。留出一些单元格用于补偿控制。将一个留作 FOXP3 染色和未染色的对照。
      注：我们建议在步骤 4.3.3 的最终离心之前梳理 10 μL 所有样品，以获得必要的补偿对照。这提供了细胞上每个标记物的所有表面水平表达的代表性样品。
    4. 第二次洗涤后，离心（室温下 200 × g，5 分钟）并吸出，然后加入 50 μL/孔 Fc 受体结合抑制剂抗体（在流式染色溶液中以 1：200 稀释）。在室温下孵育 10 分钟。
    5. 加入 50 μL/孔制备好的 T 增殖检测组合 抗体混合物。
    6. 对于补偿对照，将 50 μL 未染色的补偿池与 50 μL 每种单一染色抗体混合。
    7. 将板和补偿对照在 4 °C 下孵育 1 小时。用 Flow Stain 溶液洗涤板一次，并以 300 × g 离心 5 分钟。
    8. 使用用 HBSS （1：1,000） 稀释的 Live/Dead 近红外染料以 200 μL/孔进行染色。在 4 °C 孵育 30 分钟。
    9. 用 300 × g 的流式染色液（200 μL/孔）洗涤板一次，持续 5 分钟。
    10. 进行流式细胞术分析。

结果

我们已经描述了一种人 PBMC 的方案，使用市售磁性分离试剂盒分离 CD3 + T 细胞和 CD14 + 单核细胞，使用 GM-CSF 和 IL-4 将单核细胞分化为 CD14 - 、HLA-DR +、CD141 +、CD1c + moDC，处理它们 24 小时，并与抗 CD3/CD28 刺激的自体 T 细胞共培养 72 小时。实验原理图如图 1 所示。

单核细胞/T ...

讨论

在这里，我们描述了一种可靠且通用的方法，用于评估免疫调节剂从 moDC 诱导 tolDC 的功能，并验证它们从体外自体 T 细胞产生 Tregs 的功能。该协议有几个关键步骤。首先，单核细胞是众所周知的敏感细胞，必须从新鲜的、而不是先前冷冻的 PBMC 中获得，以获得最佳结果。应尽快分离单核细胞并置于分化混合物中。通常，前 24 小时内单核细胞产量低或单核细胞死亡...

披露声明

作者没有需要披露的利益冲突。

致谢

我们要感谢宾夕法尼亚大学人类免疫学核心 （HIC） 提供来自供体的新鲜人类 PBMC。HIC 部分由 NIH P30 AI045008 和 P30 CA016520 支持。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-10 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-158General Cell Culture
1.5 mL Centrifuge TubeVWR77508-358General Cell Culture
10 mL Serological PipetsVWR414004-267General Cell Culture
100-1000 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-164General Cell Culture
15 mL Conical TubeVWR77508-212General Cell Culture
20-200 µL Filtered Pipet tipsVWR76322-160General Cell Culture
2-MercaptoethanolMP Biomedical194834T Cell Culture
50 mL Conical TubeVWR21008-736General Cell Culture
60 x 15 mm Dish, Nunclon DeltaThermo Fischer150326General Cell Culture
96 Well Conical (V) Bottom Plate, Non-Treated SurfaceThermo Fischer277143General Cell Culture
96 well Flat Bottom PlateThermo Fischer161093General Cell Culture
APC/Cyanine7 anti-human CD272 (BTLA) AntibodyBiolegend344518Flow Cytometry
Attune NxT (Red/Blue Laser, 7 Channel)Thermo FischerA24863Flow Cytometry
BSAThermo Fischer15260-037General Cell Culture
CD14 Monoclonal Antibody (61D3), PEThermo Fischer12-0149-42Flow Cytometry
CD1c Monoclonal Antibody (L161), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0015-42Flow Cytometry
CD209 (DC-SIGN) Monoclonal Antibody (eB-h209), PerCP-Cyanine5.5Thermo Fischer45-2099-42Flow Cytometry
CD25 Monoclonal Antibody (CD25-4E3), APCThermo Fischer17-0257-42Flow Cytometry
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH1), PEThermo Fischer12-5983-42Flow Cytometry
CD4 Monoclonal Antibody (RPA-T4), Alexa Fluor 488Thermo Fischer53-0049-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APCThermo Fischer17-0409-42Flow Cytometry
CD40 Monoclonal Antibody (5C3), APC-eFluor 780Thermo Fischer47-0409-42Flow Cytometry
CD69 Monoclonal Antibody (FN50), PEThermo FischerMA1-10276Flow Cytometry
CD86 Monoclonal Antibody (BU63), FITCThermo FischerMHCD8601Flow Cytometry
CD8a Monoclonal Antibody (RPA-T8), PE-Cyanine7Thermo Fischer25-0088-42Flow Cytometry
Conical Bottom (V-well) 96 Well PlateThermo Fischer2605Flow Cytometry
Cryogenic Vials, 2 mLThermo Fischer430488T Cell Culture
Dimethylsulfoxide (DMSO), Sequencing GradeThermo Fischer20688General Cell Culture
DPBSThermo Fischer14200166General Cell Culture
EasySep Human Monocyte Isolation KitStem Cell Technologies19359Cell Separation
EasySep Human T Cell Isolation KitStem Cell Technologies17951Cell Separation
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000Cell Separation
EDTAThermo FischerAIM9260GGeneral Cell Culture
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mLStem Cell Technologies38025Cell Separation
Fc Receptor Binding Inhibitor Polyclonal AntibodyThermo Fischer14-9161-73Flow Cytometry
Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670701General Cell Culture
Fixable Viability Dye eFluor 780Thermo Fischer65-0865-18Flow Cytometry
Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer SetThermo Fischer00-5523-00Flow Cytometry
FOXP3 Monoclonal Antibody (PCH101), PE-Cyanine5.5Thermo Fischer35-4776-42Flow Cytometry
HBSSThermo Fischer14170-112General Cell Culture
Heat Inactivated Fetal Bovine SerumThermo FischerA5670801General Cell Culture
HEPES (1 M)Thermo Fischer15630106moDC Cell Culture
HLA-DR Monoclonal Antibody (L243), Alexa Fluor 488Thermo FischerA51009Flow Cytometry
Human CD3/CD28/CD2 T Cell ActivatorStemCell Technologies10970T Cell Culture
Human GM-CSF Recombinant ProteinThermo Fischer300-03moDC Cell Culture
Human IL-10 ELISA Kit, High SensitivityThermo FischerBMS215-2HSELISA
Human IL-4, Animal-Free Recombinant ProteinThermo FischerAF-200-04moDC Cell Culture
Human PBMC (Freshly Isolated)UPenn HICN/ACells
Human TNF alpha ELISA KitThermo FischerBMS223-4ELISA
Light Microscope (DMi1)Lucia391240General Cell Culture
Lipopolysaccaride (LPS)Invivogentlrl-eblpsmoDC Cell Culture
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitThermo FischerL34975Flow Cytometry
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Thermo Fischer11140050T Cell Culture
Penicillin-Streptomycin (100x)Thermo Fischer15140122General Cell Culture
Pipette ControllerVWR77575-370General Cell Culture
Rapamycin, 98+%Thermo FischerJ62473.MFmoDC Cell Culture
RPMI 1640 with GlutamaxThermo Fischer61870-036General Cell Culture
Separation BufferStem Cell Technologies20144Cell Separation
T Cell Stimulation Cocktail (500x)Thermo Fischer00-4970-93T Cell Culture
UltraComp eBead Plus Compensation BeadsThermo Fischer01-3333-41Flow Cytometry
Variable Pipette SetFischer Scientific05-403-152General Cell Culture

参考文献

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