نموذج حقن Cisterna Magna طفيف التوغل لدراسات ورم خبيث البريماني السحائي في الفئران

Summary

يصف البروتوكول طريقة لحقن الخلايا السرطانية من خلال طريق البزل عن طريق الجلد في صهريج ماجنا الذي يحفز بقوة ورم خبيث في الفئران ، مما يقلل من الصدمة وعبء الورم خارج الجمجمة.

Abstract

ورم خبيث للسحائية البريمية (LM) ، وهو انتشار الخلايا السرطانية في السائل الدماغي النخاعي المملوء بالسائل النخاعي (CSF) ، هو أحد المضاعفات النادرة والمدمرة للأورام الصلبة المتقدمة. غالبا ما يكون لدى المرضى الذين يعانون من LM تشخيص ضعيف ، حيث يقاس البقاء على قيد الحياة من أسابيع إلى شهور. يعد تطوير نماذج في الجسم الحي التي تكرر بدقة تعقيدات LM أمرا ضروريا لفهم آلياته الخلوية والمرضية وتقييم العلاجات المحتملة. عادة ما يتم إنشاء نماذج الفئران LM من خلال حقن الخلايا السرطانية داخل القلب أو الشريان السباتي أو الصهريج. ومع ذلك ، غالبا ما تؤدي الحقن داخل القلب أو الشريان السباتي إلى عبء كبير من أورام خارج الجمجمة والمخ ، مما يعقد التصوير المضيء بيولوجيا ويؤدي إلى وفيات لا علاقة لها بالمحور المحوري. وفي الوقت نفسه ، يتطلب حقن الصهريج التقليدي إجراءات جراحية ، مثل شق الجلد وتشريح العضلات ، مما يجعله مؤلما وكثيف الموارد. هنا ، نصف إجراء طفيف التوغل لحقن الخلايا السرطانية في الفضاء السحائي البريمي من خلال الصهريج الماغنا دون الحاجة إلى شق جلدي. يقلل هذا النهج من تكوين الورم خارج الجمجمة ، ويقلل من الصدمات الجراحية ، ويقصر الوقت والرعاية المطلوبة بعد الجراحة مقارنة بالطرق الجراحية الأخرى. الأهم من ذلك ، أنه يحفز LM باستمرار مع الحد الأدنى من تسلل حمة الدماغ ، كما يؤكده الفحص المجهري ثنائي الفوتون والتحليل النسيجي. يقدم هذا النهج المبسط نموذجا فعالا وموثوقا لدراسة LM في البحوث قبل السريرية.

Introduction

لا يزال المرض النقيلي هو التحدي الأكبر للمرضى الذين يعانون من السرطانات المتقدمة. يشير ورم خبيث سحائي (LM) إلى انتشار الخلايا السرطانية إلى الأم ، والأم العنكبوتية ، والفضاء تحت العنكبوتية. أصبح LM من الأورام الصلبة شائعا بشكل متزايد في سرطان الرئة (9٪ -25٪) وسرطان الثدي (5٪ -20٪) والورم الميلانيني (6٪ -18٪) ^1،2 ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى البقاء على قيد الحياة لفترة أطول وتقنيات التشخيص المحسنة. يمكن للخلايا السرطانية أن تغزو الفضاء السحائي البريماني بطرق متعددة ، بما في ذلك 1) الغزو المباشر من خلال الهياكل الطرفية مثل الأم الجافية والعظام والأعصاب. 2) انتشار الدم من خلال الجهاز الوريدي. و 3) الدخول من خلال الدورة الدموية الشريانية ، حيث تنزلق الخلايا السرطانية عبر الأوعية المحشوقة إلى الضفيرة المشيمية ثم إلى البطينين المملوءين بالسائل النخاعي^3،4،5. تواجه الخلايا السرطانية التي تدخل الفضاء السحائي البريماني تحديات متعددة ، بما في ذلك الحرمان من عوامل النمو ، والمواد الوسيطة الأيضية المحدودة ، وحالات نقص الأكسجين⁶. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود الأدوات والتقنيات المناسبة ، فإن كيفية تنقل الخلايا السرطانية في هذه المسارات والتغلب على الظروف غير المضيافة لاستعمار الفضاء البريماني السحائي غير مفهومة جيدا. على الرغم من التقدم في العلاجات متعددة الوسائط ، بما في ذلك العلاج الإشعاعي والعلاج الجهازي والعلاج بالحقن داخل القراب ، إلا أن تشخيص مرضى LM لا يزال ضعيفا ، حيث يتراوح البقاء على قيد الحياة عادة من 2 إلى 4 أشهر^3،7،8،9. وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لفهم أعمق لبيولوجيا ورم خبيث البريماني السحائي لتحسين العلاجات الحالية وتطوير علاجات جديدة مستهدفة. يتطلب تحقيق ذلك تطوير نماذج في الجسم الحي تلخص السمات المعقدة ل LM.

على عكس النقائل في أعضاء مثل الكبد والعظام والدماغ ، عادة ما يتطور LM بعد سنوات من تشخيص الورم الأولي^10،11،12. وبالمثل ، في نماذج الفئران المصابة بالورم الخبيث التلقائي ، فإن LM نادر بسبب انخفاض حدوثه وحقيقة أن الفئران عادة ما تستسلم للنقائل في مواقع أخرى. يمكن إنشاء نماذج LM التجريبية للفئران من خلال طرق مختلفة ، بما في ذلك داخل القلب ، أو الشريان السباتي ، أو بدلا من ذلك ، الحقن المباشر في صهريج الصهريج أو البطينين الدماغيين. بينما يستخدم الحقن داخل القلب للخلايا السرطانية^{على نطاق واسع 9} ، فإنه غالبا ما يؤدي إلى عبء كبير من الورم خارج الجمجمة ، مما يتسبب في وفيات لا علاقة لها بالمحور المحور. تتطلب الأساليب البديلة ، مثل حقن الخلايا السرطانية من خلال الشريان السباتي^{13 ، 14} ، موارد متخصصة واسعة النطاق وتؤدي إلى شقوق جراحية كبيرة ، وهي مؤلمة. علاوة على ذلك ، تؤدي هذه الطريقة أيضا في المقام الأول إلى ورم خبيث داخل أنسجة المخ نفسها ، بدلا من leptomenings ، وتستغرق وقتا طويلا وغير فعالة لإنشاء نماذج LM¹⁵. يتيح الحقن في صهريج ماجنا التوصيل المباشر للخلايا السرطانية إلى الفضاء السحائي البريمي. استخدمت العديد من الدراسات هذا النهج للتحقيق في آليات LM وتقييم العلاجات الجديدة^6،16،17.

في هذه المخطوطة ، نقدم بروتوكول حقن مناسب عبر الصهاريج الماغنا يتضمن ثقبا مباشرا عن طريق الجلد لتوليد كمية أكبر من الفئران ذات المحور المحور وراثيا بسرعة وثبات. تتجاوز هذه الطريقة حاجز الدماغ والدم ، وبالتالي تتيح الطعم الفعال للخلايا السرطانية في مساحة السحيات البريمية. كما أنه يقلل بشكل كبير من الصدمة الجراحية ووقت الإجراء مع تحفيز LM بشكل موثوق في الفئران. أكدنا حدوث LM مع الحد الأدنى من التسلل إلى حمة الدماغ ، كما تم التحقق منه بواسطة الفحص المجهري ثنائي الفوتون والتحليل النسيجي. لذلك ، فإن النموذج الناتج يكرر بأمانة البيئة المكروية المعقدة للمحور المحور ، مما يوفر أداة قيمة لدراسة الآليات الخلوية والمرضية المرتبطة بالأمراض وتقييم العلاجات المحتملة.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه المخطوطة والموافقة عليها من قبل لجنة مراجعة رعاية والأخلاقيات في مختبر ZJU (ZJU20230155). تم الحصول على الفئران C57BL / 6J و NSG من ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض وإيوائها في مركز مختبر ZJU. يستخدم هذا البروتوكول خط خلايا سرطان الرئة الفئران ، وسرطان الرئة لويس (LLC1) ، وخط خلايا سرطان الرئة البشري ، A549 ، وكلاهما مصنف ب GFP و Firefly luciferase. يتم توفير كلا الخطين الخلويين من قبل الدكتور شيانغ إتش إف تشانغ (كلية بايلور للطب ، الولايات المتحدة الأمريكية) ¹⁸. هنا ، نستخدم خلايا LLC1 كمثال. إجراء حقن خلايا A549 متطابق تقريبا ، باستثناء أنه تم حقن 6 × 10⁴ خلايا A549 في فئران NSG.

1. تحضير الخلايا السرطانية للحقن

1. استزراع 1.0 × 10⁶ خلايا LLC1 في DMEM مكملة بمصل بقري جنيني 10٪ و0.1 ملغم/مل بنسلين ستربتومايسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₅ ٪. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 70٪ -90٪ ، قم بتسخينها لمدة دقيقة واحدة باستخدام 2 مل من محلول التربسين / EDTA بنسبة 0.25٪. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 3 دقائق ، واغسلها مرتين باستخدام PBS المثلج ، وأعد تعليقها في 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
2. قم بتقييم تركيز الخلايا القابلة للحياة باستخدام محلول Trypan Blue ومقياس كثافة الدم¹⁹. تأكد من أن صلاحية الخلية أكبر من 90٪ ، مع كون غالبية الخلايا مفردة. اضبط تركيز الخلية على 2 × 10⁶ خلايا / مل في PBS المثلج.
3. Aliquot 50 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنابيب منفصلة للطرد المركزي الدقيق لتجنب سحب العينات بشكل متكرر.
4. احتفظ بتعليق الخلية على الجليد حتى تصبح جاهزة للحقن. حقن 10 ميكرولتر من خلايا LLC1 المسماة GFP-Luciferase لكل فأر في هذا البروتوكول ، بما يعادل 2 × 10⁴ خلايا لكل ماوس.
   ملاحظة: اضبط رقم الخلية حسب الحاجة بناء على الحركية النقيلية لخطوط الخلايا المحقونة.

2. تحضير الفئران

ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم استخدام ذكور الفئران C57BL / 6J ، الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع.

1. الأوتوكلاف جميع الأدوات الجراحية والقفازات المليئة بالستائر الجراحية. قم بتعقيم المعدات غير الجراحية التي توضع على الطاولة بنسبة 75٪ من الإيثانول ، ثم قم بتغطية منطقة العمل بستائر مقاومة للماء.
2. قم بإعداد قفص سكن حيواني نظيف ووسادة تدفئة للتعافي بعد العملية.
3. تخدير الفأر عن طريق حقن 2٪ ثلاثي البروم إيثانول تحت الجلد (200 مجم / كغ). تحقق من عمق التخدير باستخدام اختبار القرص قبل المتابعة. ضع مرهما معقما للعيون لحماية العينين من تلف القرنية بمجرد تخدير الفأر.
4. احلق الفراء من المنطقة القذالية الخلفية باستخدام المقص ، متبوعا بوضع كريمات إزالة الشعر لإزالة الفراء تماما في نفس المنطقة.
5. ضع الماوس عرضة مع وضع رقبته فوق أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بتأمين الرأس وأسفل الظهر بشريط لاصق والمس المسافة بين القفاة والفقرة C1 بإصبع السبابة (الشكل 1).
6. قم بتطهير المنطقة القذالية الخلفية بثلاث جولات من المسح باستخدام 75٪ من القطن المعقم المنقوع بالإيثانول ، متبوعا بمقشر الجراحي من البيتادين. قم بتغطية الأجزاء غير المعقمة من بستارة معقمة.

3. حقن صهريج ماجنا

ملاحظة: التقنيات المعقمة مطلوبة للخطوات التالية ، بما في ذلك استخدام معدات الحماية الشخصية والقفازات المعقمة.

1. قم بسحب معلق الخلية برفق وشفط 10 ميكرولتر للحقن باستخدام حقنة أنسولين 31 جم ، 8 مم.
2. ملامسة المنطقة الواقعة بين القفا و C1 من الفأر بإصبع السبابة لتحديد موقع البزل الدقيق في الهامش المتوسط السفلي للجمجمة القذالية الخلفية. ضع علامة على هذا الموقع إذا لزم الأمر.
3. أدخل الإبرة بزاوية 45 درجة -50 درجة في الصهريج من خلال موقع البزل المحدد ، مع التقدم إلى عمق 4 مم. يشير الإحساس المميز بالاختراق إلى أن الإبرة قد دخلت بنجاح صهريج ماجنا.
   1. إذا كان من الصعب تحديد موقع البزل ، فقم بعمل شق صغير بطول 3-5 مم على مستوى الأذن لكشف خط الوسط الخلفي. في حال الحاجة إلى شق جراحي، يتم تطبيق ميلوكسيكام (5 ملغ/كغ/يوم) وبوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) تحت الجلد قبل ساعة واحدة من الجراحة.
4. قم بحقن تعليق الخلية ببطء عن طريق دفع مكبس المحقنة ، مع الحفاظ على ثبات المحقنة مع وضع اليد على الطاولة.
5. بعد التلقيح ، أمسك المحقنة في مكانها لمدة 10 ثوان إضافية للسماح للضغط داخل الجمجمة بالتوازن. ثم اسحب الإبرة واضغط على موقع البزل بقطعة قطن معقمة لمدة 1-2 دقيقة.

4. رعاية ما بعد الحقن

1. انقل لتنظيف الأقفاص على وسادة التدفئة وراقبها عن كثب حتى تتعافى تماما.
   1. في حالة إجراء شق ، أغلق الجرح باستخدام غراء المناديل والمشابك. قم بإعطاء مسكنات إضافية للألم لمدة 2-3 أيام بعد الجراحة للسيطرة على الألم والمساعدة في الشفاء.
2. راقب الفئران عن كثب لمدة 7 أيام بعد الإجراء وتحقق من الأنشطة البدنية للحيوانات والمظهر المحيط بموقع الحقن يوميا.

5. تقييم نمو الورم السحائي

1. التصوير الحيوي
   1. تخدير الفأر وإعطاء D-luciferin (150 ميكروغرام / جم) في الوريد خلف الحجاج. ضع الفئران في غرفة التصوير ، وضعها في مخروط أنف مخصص على مشعب التخدير. استخدم حواجز الضوء بين لتقليل تداخل الإشارة.
   2. قم بتصوير على الفور باستخدام نظام IVIS مع وقت التعرض بين 0.5 ثانية إلى 2 دقيقة⁶. تأكد من نجاح تلقيح الخلايا السرطانية في الفضاء السحائي البريماني عن طريق إشارة مضيئة بيولوجية مشتتة عبر الرأس والحبل الشوكي (الشكل 2 أ).
   3. مراقبة تطور LM عن طريق التصوير الحيوي كل 4 أيام. اضبط فترات التصوير بناء على حركية نمو الورم.
2. التحليل النسيجي
   1. قم بتخدير الفئران عندما كانت أقل نشاطا بشكل ملحوظ أو فقدت 20٪ من وزن جسمها وقطع الجلد والأضلاع لفضح تجويف الصدر. أدخل قنية ذات رأس حاد بعناية في البطين الأيسر وتقدم القنية إلى الشريان الأورطي الصاعد. قم بتفريف ب 20 مل من PBS من خلال القنية ببطء.
   2. استخدم المقص لإزالة الرأس وعمل شق في خط الوسط لفروة الرأس لكشف الجمجمة. استئصال الأنسجة الرخوة المحيطة. اقطع على طول التلال المدارية ، ثم أدخل المقص في الثقبة العظمى ، وتقدم بعناية على طول السطح الداخلي للجمجمة بضغط تصاعدي لتجنب تلف الأنسجة.
   3. قم بإزالة عظام الجمجمة ، ثم استخرج الدماغ برفق. قم بإصلاح الدماغ في 4٪ بارافورمالدهيد عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة ثم قم بتوازنه في محلول PBS من السكروز بنسبة 15٪ لمدة 24 ساعة ، متبوعا بمحلول PBS من السكروز بنسبة 30٪ لمدة 24 ساعة أخرى عند 4 درجات مئوية.
   4. ضع الأنسجة في مادة كريومولد مملوءة بمركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) ثم قم بتخزينها على الثلج الجاف لمدة 30 دقيقة^{و 20}.
   5. قم بقص الدماغ المضمن في OCT إلى أقسام بسمك 10 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد. قم بتخزين الأقسام في فريزر -80 درجة مئوية حتى مزيد من التطبيق.
   6. قم بإجراء تلطيخ الهيماتوكسيلين / الإيوزين (H & E) على شرائح الدماغ²¹. يشير وجود الخلايا السرطانية على حافة الدماغ إلى أن ورم خبيث يحدث حصريا في الفضاء البريماني السحائي (الشكل 3 والجدول 1).
3. الفحص المجهري ثنائي الفوتون
   1. تخدير الفئران باستخدام LM. قم بإزالة فروة الرأس التي تغطي سطح الجمجمة الظهرية بالملقط والمقص. استخدم شفرة مشرط لإزالة السمحاق الرقيق من سطح الجمجمة.
   2. قم بترقيق الجمجمة باستخدام مثقاب كاشطة حتى تظهر أوعية الحفر من خلال الجمجمة الرقيقة. قم بتثبيت منطقة المراقبة لرأس الماوس بغطاء رأس مثلث مؤمن بمادة لاصقة للأنسجة^22،23.
   3. يجب تطبيق 0.025 مل من 5٪ (وزن/حجم) TRITC-dextran، في الوريد تحت الحجاج لتوسيم الأوعية الدموية²².
   4. قم بإجراء فحص مجهري ثنائي الفوتون من خلال نوافذ التصوير وإعادة بناء الفضاء البريماني السحائي (الشكل 4). اكتشف العظم عن طريق التألق التوافقي الثاني عند انبعاث 450 نانومتر مع إثارة 900 نانومتر²⁴. تصور الخلايا السرطانية المسماة GFP والأوعية المسماة بالديكستران عن طريق جمع إشارات التألق عند انبعاث 507 نانومتر و 572 نانومتر مع إثارة 900 نانومتر و 1000 نانومتر ، على التوالي.
4. مجهر فلوري ستيريو
   1. قم بإزالة دماغ الفأر وضعه تحت مجهر مجسم. تصور الخلايا المسماة ب GFP باستخدام مجموعة مرشحات خاصة ب GFP (الشكل 5).

النتائج

يوضح الشكل 1 وضع الماوس للحقن وموقع البزل من المناظر الجانبية والأمامية. يوضح الشكل 2 صورا تمثيلية للتلألؤ البيولوجي في الجسم الحي للحيوانات التي تم اختبارها لتوليد LM من خلال مناهج مختلفة. تم حقن خلايا LLC1 المسماة GFP-luciferase في ...

Discussion

LM هو حالة عدوانية ومميتة. بمجرد أن تنتشر الخلايا السرطانية إلى الفضاء المملوء بالسائل النخاعي ، فإنها تنتشر بسرعة في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي^{بأكمله 25}. تستقر هذه الخلايا وتغزو الدماغ والحبل الشوكي والأعصاب القحفية والشوكية ، مما يؤدي في النهاية إلى ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5ml Eppendorf tubes	Biosharp	BS-15-M-S
15ml centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-15A
31G x 8mm insulin syringe(0.3ml)	Promisemed	/
Abrasive drill	GLOBALEBIO	GEGZ-AM1
Animal heat mat	woggee	/
Cryomold	Supin	SP-AB-7 x 7 x 5
Depilatory creams	Nair	1.00023E+11
D-Luciferin	Gold Biology	LUCK-1G
DMEM	Gibco	C11995500CP
FBS	Gibco	10270-106
IVIS Spectrum	Caliper	/
Optimal Cutting Temperature	Sakura	4583-1
Paraformaldehyde	SCR	80096618
PBS	Servicebio	G4202-500ML
Pen/Strep Amphotericin B	Gibco	15140122
Shaver	Hipidog	2103CGMJ3373-GQ22N526
Stereo fluorescence microscope	Olympus	/
Straight forceps	Beyotime	FS019	Need to be autoclaved
Surgical scissors	Beyotime	FS001	Need to be autoclaved
Triangular mouse fixation head piece	Transcend vivoscope	TVS-FDM-027
Tribromoethanol	Macklin	C14432922
TRITC-dextran, MW 70000	MedChemExpress	HY-158082C
Trypsin/EDTA solution	Gibco	25200056
Two-photon laser scanning microscopy	Olympus	/
Vetbond Tissue Adhesives	3M	1469SB