Farelerde Leptomeningeal Metastaz Çalışmaları için Minimal İnvaziv Sarnıç Magna Enjeksiyon Modeli

Özet

Protokol, farelerde leptomeningeal metastazı sağlam bir şekilde indükleyen, travmayı ve ekstrakraniyal tümör yükünü azaltan, tümör hücrelerinin perkütan ponksiyon yolu yoluyla cisterna magna'ya enjekte edilmesi için bir yöntemi tanımlar.

Özet

Kanser hücrelerinin beyin omurilik sıvısı (BOS) dolu leptomeninglere yayılması olan leptomeningeal metastaz (LM), ilerlemiş solid tümörlerin nadir fakat yıkıcı bir komplikasyonudur. LM'li hastalar genellikle kötü bir prognoza sahiptir ve sağkalım haftalar ila aylar arasında ölçülür. LM'nin karmaşıklıklarını doğru bir şekilde kopyalayan in vivo modellerin geliştirilmesi, hücresel ve patolojik mekanizmalarını anlamak ve potansiyel tedavileri değerlendirmek için çok önemlidir. Murin LM modelleri tipik olarak tümör hücrelerinin intrakaryak, karotis arter veya cisterna magna enjeksiyonu yoluyla oluşturulur. Bununla birlikte, intrakardiyak veya karotis enjeksiyonları sıklıkla önemli ekstrakraniyal ve beyin tümörü yüküne neden olur, bu da biyolüminesan görüntülemeyi zorlaştırır ve LM ile ilgisi olmayan mortaliteye yol açar. Bu arada, geleneksel cisterna magna enjeksiyonu, cilt insizyonu ve kas diseksiyonu gibi invaziv prosedürler gerektirir ve bu da onu hem travmatik hem de kaynak yoğun hale getirir. Burada, cilt insizyonuna gerek kalmadan cisterna magna yoluyla leptomeningeal boşluğa tümör hücresi enjeksiyonu için minimal invaziv bir prosedürü tarif ediyoruz. Bu yaklaşım, diğer cerrahi yöntemlere kıyasla ekstrakraniyal tümör oluşumunu azaltır, cerrahi travmayı en aza indirir ve gereken süreyi ve ameliyat sonrası bakımı kısaltır. Daha da önemlisi, iki foton mikroskobu ve histolojik analiz ile onaylandığı gibi, minimal beyin parankimi infiltrasyonu ile LM'yi tutarlı bir şekilde indükler. Bu kolaylaştırılmış yaklaşım, klinik öncesi araştırmalarda LM'yi incelemek için verimli ve güvenilir bir model sunar.

Giriş

Metastatik hastalık, ilerlemiş kanserli hastalar için en büyük zorluk olmaya devam etmektedir. Leptomeningeal metastaz (LM), kanser hücrelerinin pia materyal, araknoid materyal ve subaraknoid boşluğa yayılmasını ifade eder. Katı tümörlerden kaynaklanan LM, akciğer kanserinde (%9-%25), meme kanserinde (%5-%20) ve melanomda (%6-%18)^1,2, büyük ölçüde daha uzun sağkalım ve gelişmiş tanı teknikleri nedeniyle giderek daha yaygın hale gelmektedir. Kanser hücreleri, leptomeningeal boşluğu aşağıdakiler de dahil olmak üzere birçok yolla istila edebilir: 1) dura mater, kemik ve sinirler gibi periferik yapılar yoluyla doğrudan istila; 2) venöz sistem yoluyla hematojen yayılım; ve 3) kanser hücrelerinin fenestre damarlardan koroid pleksusa ve ardından beyin omurilik sıvısı dolu ventriküllere^kaydığı arteriyel dolaşım yoluyla giriş ^3,4,5. Leptomeningeal boşluğa giren tümör hücreleri, büyüme faktörlerinin yoksunluğu, sınırlı metabolik ara ürünler ve hipoksik durumlar dahil olmak üzere birçok zorlukla karşılaşır⁶. Bununla birlikte, uygun araç ve tekniklerin eksikliği nedeniyle, tümör hücrelerinin bu yolaklarda nasıl gezindiği ve leptomeningeal boşluğu kolonize etmek için elverişsiz koşulların üstesinden nasıl geldiği tam olarak anlaşılamamıştır. Radyoterapi, sistemik tedavi ve intratekal enjeksiyon tedavisi dahil olmak üzere multimodal tedavilerdeki gelişmelere rağmen, LM hastaları için prognoz kötüdür ve sağkalım tipik olarak 2 ila 4 ay arasında değişmektedir 3,7,8,9. Bu nedenle, mevcut tedavileri iyileştirmek ve yeni, hedefe yönelik tedaviler geliştirmek için leptomeningeal metastaz biyolojisinin daha derin bir şekilde anlaşılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bunu başarmak, LM'nin karmaşık özelliklerini özetleyen in vivo modellerin geliştirilmesini gerektirir.

Karaciğer, kemik ve beyin gibi organlardaki metastazların aksine, LM genellikle primer tümörün teşhisinden yıllar sonra gelişir 10,11,12. Benzer şekilde, spontan metastazı olan fare modellerinde, düşük insidansı ve farelerin tipik olarak diğer bölgelerdeki metastazlara yenik düşmesi nedeniyle LM nadirdir. Deneysel murin LM modelleri, intrakardiyak, intrakarotis arter veya alternatif olarak cisterna magna veya serebral ventriküllere doğrudan enjeksiyon dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle oluşturulabilir. Kanser hücrelerinin intrakardiyak enjeksiyonu yaygın^{olarak kullanılmakla} birlikte9, sıklıkla önemli bir ekstrakraniyal tümör yükü ile sonuçlanır ve LM ile ilişkili olmayan mortaliteye neden olur. Tümör hücrelerinin karotis arter^13,14 yoluyla enjekte edilmesi gibi alternatif yaklaşımlar, kapsamlı özel kaynaklar gerektirir ve travmatik olan büyük cerrahi insizyonlarla sonuçlanır. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda leptomeninglerden ziyade öncelikle beyin dokularının kendi içinde metastaza yol açar ve LM modellerinin oluşturulması için zaman alıcı ve verimsizdir¹⁵. Cisterna magna'ya enjeksiyon, tümör hücrelerinin leptomeningeal boşluğa doğrudan verilmesini sağlar. LM mekanizmalarını araştırmak ve yeni tedavileri değerlendirmek için bu yaklaşımı kullanan birçok çalışma^{vardır 6,16,17}.

Bu yazıda, LM'li farelerde hızlı ve stabil bir şekilde daha fazla miktarda fare oluşturmak için doğrudan perkütan ponksiyon içeren uygun bir trans-cisterna magna enjeksiyon protokolü sunuyoruz. Bu yöntem beyin-kan bariyerini atlar ve bu nedenle leptomeninges boşluğundaki tümör hücrelerinin verimli bir şekilde ksenogreftlenmesini sağlar. Ayrıca, farelerde LM'yi güvenilir bir şekilde indüklerken cerrahi travma ve prosedür süresini önemli ölçüde azaltır. İki foton mikroskobu ve histolojik analiz ile doğrulandığı gibi, beyin parankimine minimal infiltrasyon ile LM oluşumunu doğruladık. Bu nedenle, ortaya çıkan model, hastalıkla ilişkili hücresel ve patolojik mekanizmaları incelemek ve potansiyel tedavileri değerlendirmek için değerli bir araç sağlayarak, LM'nin karmaşık mikro ortamını sadık bir şekilde çoğaltır.

Protokol

Bu makaledeki tüm hayvan prosedürleri, ZJU-Laboratuvar Hayvanları Refahı ve Etik İnceleme Komitesi (ZJU20230155) tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır. C57BL / 6J ve NSG fareleri, ZJU Laboratuvar Hayvanları Merkezi'ndeki spesifik patojen içermeyen koşullardan elde edildi ve barındırıldı. Bu protokol, her ikisi de GFP ve ateşböceği lusiferaz ile etiketlenmiş murin akciğer kanseri hücre hattı, Lewis akciğer karsinomu (LLC1) ve insan akciğer kanseri hücre hattı, A549'u kullanır. Her iki hücre hattı da Dr. Xiang H. F. Zhang (Baylor Tıp Fakültesi, ABD) tarafından nazikçe ^{sağlanmaktadır18}. Burada örnek olarak LLC1 hücrelerini kullanıyoruz. A549 hücrelerinin enjeksiyonu için prosedür, 6 x 10⁴ A549 hücrelerinin NSG farelerine enjekte edilmesi dışında hemen hemen aynıdır.

1. Kanser hücrelerinin enjeksiyon için hazırlanması

1. % 5 CO₂ inkübatörinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve 37 ° C'de 0.1 mg / mL penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM'de kültür 1.0 x^{10 6} LLC1 hücreleri. Hücreler% 70 -% 90 birleşmeye ulaştığında, 2 mL% 0.25 Tripsin / EDTA çözeltisi kullanarak 1 dakika boyunca tripsinize edin. Hücreleri 3 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, 2 kez buz gibi soğuk PBS ile yıkayın ve 1 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde tekrar süspanse edin.
2. Bir Tripan Mavisi çözeltisi ve bir hemositometre¹⁹ kullanarak canlı hücrelerin konsantrasyonunu değerlendirin. Hücre canlılığının %90'dan büyük olduğundan ve hücrelerin çoğunluğunun tek olduğundan emin olun. Buz gibi soğuk PBS'de hücre konsantrasyonunu 2 x 10⁶ hücre / mL'ye ayarlayın.
3. Tekrar tekrar pipetlemeyi önlemek için 50 μL hücre süspansiyonunu ayrı mikrosantrifüj tüplerine koyun.
4. Hücre süspansiyonlarını enjeksiyona hazır olana kadar buz üzerinde tutun. Bu protokolde fare başına 10 μL GFP-Luciferaz etiketli LLC1 hücresi enjekte edin, bu da fare başına 2 x 10⁴ hücreye karşılık gelir.
   NOT: Enjekte edilen hücre hatlarının metastatik kinetiğine bağlı olarak hücre numarasını gerektiği gibi ayarlayın.

2. Fare hazırlama

NOT: Bu çalışmada, 6-8 haftalık erkek C57BL / 6J fareleri kullanıldı.

1. Cerrahi örtülerle dolu tüm cerrahi aletleri ve eldivenleri otoklavlayın. Tezgah üstü ve cerrahi olmayan ekipmanı %75 etanol ile sterilize edin, ardından çalışma alanını su geçirmez perdelerle kaplayın.
2. İşlem sonrası iyileşme için temiz bir hayvan barınağı kafesi ve bir ısıtma pedi hazırlayın.
3. Deri altına %2 tribromoetanol (200 mg / kg) enjekte ederek fareyi uyuşturun. Devam etmeden önce bir tutam testi kullanarak anestezi derinliğini kontrol edin. Fare uyuşturulduktan sonra gözleri kornea hasarından korumak için steril oftalmik merhem sürün.
4. Arka oksipital bölgedeki kürkü makas kullanarak tıraş edin, ardından aynı bölgedeki tüyleri tamamen çıkarmak için tüy dökücü kremler uygulayın.
5. Fareyi, boynu 15 mL'lik bir santrifüj tüpünün üzerine yerleştirilmiş olarak yüzüstü konumlandırın. Başı ve alt sırtı bantla sabitleyin ve oksiput ile C1 omuru arasındaki boşluğu işaret parmağınızla palpe edin (Şekil 1).
6. Posterior oksipital bölgeyi% 75 etanol ile ıslatılmış steril pamuklu çubuklarla üç tur silme ile dezenfekte edin, ardından betadin cerrahi fırçalama yapın. Hayvanın steril olmayan kısımlarını steril bir örtü ile örtün.

3. Sarnıç magna enjeksiyonu

NOT: Kişisel koruyucu ekipman ve steril eldiven kullanımı da dahil olmak üzere aşağıdaki adımlar için aseptik teknikler gereklidir.

1. Hücre süspansiyonunu nazikçe pipetleyin ve 31G, 8 mm'lik bir insülin şırıngası ile enjeksiyon için 10 μL'yi aspire edin.
2. Posterior oksipital kafatasının alt medyan kenarındaki kesin ponksiyon bölgesini bulmak için farenin oksiputu ile C1 arasındaki alanı işaret parmağınızla palpe edin. Gerekirse bu siteyi işaretleyin.
3. İğneyi 45°-50° açıyla cisterna magna'ya belirlenen delinme bölgesinden geçirin ve 4 mm derinliğe kadar ilerletin. Belirgin bir atılım hissi, iğnenin cisterna magna'ya başarıyla girdiğini gösterir.
   1. Delinme bölgesinin yerini belirlemek zorsa, arka orta hattı ortaya çıkarmak için kulak hizasında 3-5 mm'lik küçük bir kesi yapın. Cerrahi bir insizyon gerekiyorsa, ameliyattan 1 saat önce Meloksikam (5 mg / kg / gün) ve Buprenorfin (0.1 mg / kg) deri altına uygulayın.
4. Şırınga pistonunu ilerleterek hücre süspansiyonunu yavaşça enjekte edin, şırıngayı masanın üzerine yerleştirilen el ile sabit tutun.
5. Aşılamadan sonra, kafa içi basıncın dengelenmesine izin vermek için şırıngayı 10 saniye daha yerinde tutun. Ardından iğneyi geri çekin ve delinme bölgesine steril bir pamuklu çubukla 1-2 dakika bastırın.

4. Enjeksiyon sonrası bakım

1. Hayvanları bir ısıtma yastığı üzerindeki temiz kafeslere aktarın ve tamamen iyileşene kadar yakından izleyin.
   1. Bir kesi yapılması durumunda, yarayı doku yapıştırıcısı ve klipsler kullanarak kapatın. Ağrıyı kontrol etmek ve iyileşmeye yardımcı olmak için ameliyattan 2-3 gün sonra ek ağrı kesici ilaçlar uygulayın.
2. İşlemi takip eden 7 gün boyunca fareleri yakından izleyin ve hayvanların fiziksel aktivitelerini ve enjeksiyon bölgesini çevreleyen görünümü günlük olarak kontrol edin.

5. Leptomeningeal tümör büyümesinin değerlendirilmesi

1. Biyolüminesans görüntüleme
   1. Fareyi uyuşturun ve retroorbital vende D-lusiferin (150 μg / g) uygulayın. Fareleri görüntüleme odasına yerleştirin ve onları anestezi manifoldu üzerinde belirlenmiş bir burun konisine yerleştirin. Sinyal parazitini en aza indirmek için hayvanlar arasında ışık bölmeleri kullanın.
   2. Maruz kalma süresi 0,5 s ile 2 dk⁶ arasında olan IVIS sistemini kullanarak hayvanları hemen görüntüleyin. Baş ve omurilik boyunca dağıtıcı bir biyolüminesan sinyali ile leptomeningeal boşlukta başarılı tümör hücresi inokülasyonunu doğrulayın (Şekil 2A).
   3. Her 4 günde bir biyolüminesans görüntüleme ile LM'nin ilerlemesini izleyin. Tümör büyüme kinetiğine dayalı olarak görüntüleme aralıklarını ayarlayın.
2. Histolojik analiz
   1. Fareleri önemli ölçüde daha az aktif olduklarında veya vücut ağırlıklarının %20'sini kaybettiklerinde uyuşturun ve göğüs boşluklarını ortaya çıkarmak için cildi ve kaburgaları kesin. Künt uçlu bir kanülü dikkatlice sol ventriküle yerleştirin ve kanülü çıkan aorta ilerletin. Hayvanı kanülden yavaşça 20 mL PBS ile perfüze edin.
   2. Kafayı çıkarmak için makas kullanın ve kafatasını ortaya çıkarmak için orta hat kafa derisi kesisi yapın. Çevredeki yumuşak dokuları eksize edin. Orbital sırt boyunca kesin, ardından foramen magnum'a makas sokun ve doku hasarını önlemek için kafatasının iç yüzeyi boyunca yukarı doğru basınçla dikkatlice ilerleyin.
   3. Kafatası kemiklerini çıkarın ve ardından beyni yavaşça çıkarın. Beyni 24 saat boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehit içinde sabitleyin ve daha sonra 24 saat boyunca% 15 sükroz PBS çözeltisine, ardından 4 ° C'de 24 saat daha% 30 sükroz PBS çözeltisine dengeleyin.
   4. Dokuyu Optimum Kesme Sıcaklığı (OCT) bileşiği ile doldurulmuş bir kriyokalıba yerleştirin ve ardından 30 dakika²⁰ kuru buz üzerinde saklayın.
   5. OCT gömülü beyni bir kriyostat kullanarak 10 μm kalınlığında bölümler halinde kesin. Bölümleri daha fazla uygulamaya kadar -80 °C'lik bir dondurucuda saklayın.
   6. Beyin slaytları²¹ üzerinde Hematoksilen / Eozin (H & E) boyaması yapın. Beyin kenarında tümör hücrelerinin varlığı, metastazın sadece leptomeningeal boşlukta meydana geldiğini gösterir (Şekil 3 ve Tablo 1).
3. İki foton mikroskobu
   1. Fareleri LM ile uyuşturun. Sırt kafatası yüzeyini kaplayan kafa derisini forseps ve makasla çıkarın. İnce periosteuumu kafatasının yüzeyinden çıkarmak için bir neşter bıçağı kullanın.
   2. İnceltilmiş kafatasından piyal damarlar görünene kadar kafatasını aşındırıcı bir matkapla inceltin. Fare kafasının gözlem alanını, doku yapıştırıcısı^22,23 ile sabitlenmiş üçgen bir başlık ile sabitleyin.
   3. Kan damarlarını etiketlemek için infraorbital bir damarda 0.025 mL% 5 (a/h) TRITC-dekstran uygulayın²².
   4. Görüntüleme pencerelerinden iki foton mikroskobu yapın ve leptomeningeal boşluğu yeniden yapılandırın (Şekil 4). 900 nm uyarma ile 450 nm emisyonda ikinci harmonik floresan ile kemiği tespit edin²⁴. Sırasıyla 900 nm ve 1000 nm uyarma ile 507 nm ve 572 nm emisyonda floresan sinyalleri toplayarak GFP etiketli tümör hücrelerini ve dekstran etiketli damarları görselleştirin.
4. Stereo floresan mikroskobu
   1. Fare beynini çıkarın ve bir stereomikroskop altına yerleştirin. GFP'ye özgü bir filtre seti kullanarak GFP etiketli hücreleri görselleştirin (Şekil 5).

Sonuçlar

Şekil 1, farenin enjeksiyon için yerleşimini ve delinme bölgesini yanal ve önden görünümlerden göstermektedir. Şekil 2 , farklı yaklaşımlarla LM üretmek için test edilen hayvanların temsili in vivo biyolüminesans görüntülerini göstermektedir. GFP-lusiferaz etiketli LLC1 hücreleri hayvanlara farklı yollardan enjekte edildi ve ardından biyolüminesan görüntüleme yapıldı.

Tartışmalar

LM agresif ve ölümcül bir durumdur. Tümör hücreleri beyin omurilik sıvısı dolu boşluğa metastaz yaptıktan sonra, tüm merkezi sinir sistemi boyunca hızla yayılırlar²⁵. Bu hücreler beyin, omurilik, kraniyal ve omurilik sinirlerine yerleşir ve istila eder, sonuçta hızlı nörolojik bozulmaya ve nihayetinde ölüme yol açar¹⁷. Altta yatan patofizyolojik mekanizmaları daha iyi anlamak ve potansiyel terapötik stratejileri d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5ml Eppendorf tubes	Biosharp	BS-15-M-S
15ml centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-15A
31G x 8mm insulin syringe(0.3ml)	Promisemed	/
Abrasive drill	GLOBALEBIO	GEGZ-AM1
Animal heat mat	woggee	/
Cryomold	Supin	SP-AB-7 x 7 x 5
Depilatory creams	Nair	1.00023E+11
D-Luciferin	Gold Biology	LUCK-1G
DMEM	Gibco	C11995500CP
FBS	Gibco	10270-106
IVIS Spectrum	Caliper	/
Optimal Cutting Temperature	Sakura	4583-1
Paraformaldehyde	SCR	80096618
PBS	Servicebio	G4202-500ML
Pen/Strep Amphotericin B	Gibco	15140122
Shaver	Hipidog	2103CGMJ3373-GQ22N526
Stereo fluorescence microscope	Olympus	/
Straight forceps	Beyotime	FS019	Need to be autoclaved
Surgical scissors	Beyotime	FS001	Need to be autoclaved
Triangular mouse fixation head piece	Transcend vivoscope	TVS-FDM-027
Tribromoethanol	Macklin	C14432922
TRITC-dextran, MW 70000	MedChemExpress	HY-158082C
Trypsin/EDTA solution	Gibco	25200056
Two-photon laser scanning microscopy	Olympus	/
Vetbond Tissue Adhesives	3M	1469SB