Modello di iniezione minimamente invasivo di Cisterna Magna per studi di metastasi leptomeningee nei topi

Riepilogo

Il protocollo descrive un metodo per iniettare cellule tumorali attraverso la via di puntura percutanea nella cisterna magna che induce in modo robusto metastasi leptomeningee nei topi, riducendo il trauma e il carico tumorale extracranico.

Abstract

Le metastasi leptomeningee (LM), la diffusione di cellule tumorali nelle leptomeningi piene di liquido cerebrospinale (CSF), sono una complicanza rara ma devastante dei tumori solidi avanzati. I pazienti con LM hanno spesso una prognosi infausta, con una sopravvivenza misurata in settimane o mesi. Lo sviluppo di modelli in vivo che replichino accuratamente le complessità della LM è essenziale per comprenderne i meccanismi cellulari e patologici e valutare potenziali terapie. I modelli di LM murini sono tipicamente creati attraverso l'iniezione intracardiaca, dell'arteria carotide o della cisterna magna di cellule tumorali. Tuttavia, le iniezioni intracardiache o carotidei spesso provocano un notevole carico di tumori extracranici e cerebrali, complicando l'imaging bioluminescente e portando a mortalità non correlata alla LM. Nel frattempo, l'iniezione convenzionale di cisterna magna richiede procedure invasive, come l'incisione cutanea e la dissezione muscolare, rendendola traumatica e dispendiosa in termini di risorse. Qui, descriviamo una procedura minimamente invasiva per l'iniezione di cellule tumorali nello spazio leptomeningeo attraverso la cisterna magna senza la necessità di un'incisione cutanea. Questo approccio riduce la formazione di tumori extracranici, minimizza il trauma chirurgico e riduce il tempo e le cure postoperatorie necessarie rispetto ad altri metodi chirurgici. È importante sottolineare che induce costantemente LM con una minima infiltrazione del parenchima cerebrale, come confermato dalla microscopia a due fotoni e dall'analisi istologica. Questo approccio semplificato offre un modello efficiente e affidabile per lo studio della LM nella ricerca preclinica.

Introduzione

La malattia metastatica rimane la sfida più grande per i pazienti con tumori avanzati. Le metastasi leptomeningee (LM) si riferiscono alla diffusione delle cellule tumorali nella pia madre, nella madre aracnoidea e nello spazio subaracnoideo. La LM da tumori solidi sta diventando sempre più comune nel cancro del polmone (9%-25%), nel cancro al seno (5%-20%) e nel melanoma (6%-18%)^1,2, in gran parte a causa della sopravvivenza più lunga e del miglioramento delle tecniche diagnostiche. Le cellule tumorali possono invadere lo spazio leptomeningeo attraverso molteplici vie, tra cui 1) invasione diretta attraverso strutture periferiche come dura madre, ossa e nervi; 2) diffusione ematogena attraverso il sistema venoso; e 3) ingresso attraverso la circolazione arteriosa, dove le cellule tumorali scivolano attraverso vasi fenestrati nel plesso coroideo e successivamente nei ventricoli pieni di liquido cerebrospinale ^3,4,5. Le cellule tumorali che entrano nello spazio leptomeningeo incontrano molteplici sfide, tra cui la privazione di fattori di crescita, intermedi metabolici limitati e condizioni ipossiche⁶. Tuttavia, a causa della mancanza di strumenti e tecniche appropriate, il modo in cui le cellule tumorali navigano in questi percorsi e superano condizioni inospitali per colonizzare lo spazio leptomeningeo è poco compreso. Nonostante i progressi nelle terapie multimodali, tra cui la radioterapia, il trattamento sistemico e la terapia iniettiva intratecale, la prognosi per i pazienti con LM rimane sfavorevole, con una sopravvivenza tipicamente compresa tra 2 e 4 mesi 3,7,8,9. Pertanto, c'è un urgente bisogno di una comprensione più profonda della biologia delle metastasi leptomeningee per migliorare i trattamenti attuali e sviluppare nuove terapie mirate. Per raggiungere questo obiettivo è necessario lo sviluppo di modelli in vivo che ricapitolino le complesse caratteristiche della LM.

A differenza delle metastasi in organi come il fegato, le ossa e il cervello, la LM di solito si sviluppa anni dopo la diagnosi del tumore primario 10,11,12. Allo stesso modo, nei modelli murini con metastasi spontanee, la LM è rara a causa della sua bassa incidenza e del fatto che i topi tipicamente soccombono alle metastasi in altri siti. I modelli sperimentali di LM murino possono essere creati attraverso varie metodiche, tra cui l'arteria intracardiaca, intracarotide o, in alternativa, l'iniezione diretta nella cisterna magna o nei ventricoli cerebrali. Sebbene l'iniezione intracardiaca di cellule tumorali sia ampiamente utilizzata⁹, spesso provoca un significativo carico tumorale extracranico, causando mortalità non correlata alla LM. Approcci alternativi, come l'iniezione di cellule tumorali attraverso l'arteria carotide^13,14, richiedono ampie risorse specializzate e provocano grandi incisioni chirurgiche, che sono traumatiche. Inoltre, questo metodo porta principalmente a metastasi all'interno dei tessuti cerebrali stessi, piuttosto che alle leptomeningi, ed è dispendioso in termini di tempo e inefficiente per stabilire i modelli LM¹⁵. L'iniezione nella cisterna magna consente la consegna diretta delle cellule tumorali nello spazio leptomeningeo. Diversi studi hanno utilizzato questo approccio per indagare i meccanismi della LM e valutare nuovi trattamenti ^6,16,17.

In questo manoscritto, presentiamo un comodo protocollo di iniezione trans-cisterna magna che prevede una puntura percutanea diretta per generare rapidamente e stabilmente una maggiore quantità di topi con LM. Questo metodo bypassa la barriera emato-encefalica e, quindi, consente un efficiente xenotrapianto di cellule tumorali nello spazio delle leptomeningi. Riduce inoltre significativamente il trauma chirurgico e il tempo della procedura, inducendo in modo affidabile la LM nei topi. Abbiamo confermato l'insorgenza di LM con minima infiltrazione nel parenchima cerebrale, come verificato dalla microscopia a due fotoni e dall'analisi istologica. Pertanto, il modello risultante replica fedelmente il complesso microambiente della LM, fornendo uno strumento prezioso per studiare i meccanismi cellulari e patologici associati alla malattia e valutare potenziali terapie.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali in questo manoscritto sono state esaminate e approvate dal Comitato di revisione del benessere e dell'etica degli animali da laboratorio ZJU (ZJU20230155). I topi C57BL/6J e NSG sono stati ottenuti e ospitati in condizioni prive di patogeni specifici presso lo ZJU Laboratory Animal Center. Questo protocollo utilizza la linea cellulare di carcinoma polmonare murino, carcinoma polmonare di Lewis (LLC1), e la linea cellulare di carcinoma polmonare umano, A549, entrambe marcate con GFP e luciferasi di lucciola. Entrambe le linee cellulari sono gentilmente fornite dal Dr. Xiang H. F. Zhang (Baylor College of Medicine, USA)¹⁸. Qui, usiamo le celle LLC1 come esempio. La procedura per l'iniezione di cellule A549 è quasi identica, tranne per il fatto che 6 x 10⁴ cellule A549 sono state iniettate in topi NSG.

1. Preparazione delle cellule tumorali per l'iniezione

1. Coltura di 1,0 x 10⁶ cellule LLC1 in DMEM integrata con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 0,1 mg/mL di penicillina-streptomicina a 37 °C in un incubatore al 5% di CO₂ . Quando le cellule raggiungono la confluenza del 70%-90%, tripsinizzarle per 1 minuto utilizzando 2 ml di soluzione di tripsina/EDTA allo 0,25%. Centrifugare le cellule a 300 x g per 3 minuti, lavarle 2 volte con PBS ghiacciato e risospenderle in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Valutare la concentrazione di cellule vitali utilizzando una soluzione di Trypan Blue e un emocitometro¹⁹. Assicurarsi che la vitalità cellulare sia superiore al 90%, con la maggior parte delle cellule singole. Regolare la concentrazione cellulare a 2 x 10⁶ cellule/mL in PBS ghiacciato.
3. Aliquotare 50 μl della sospensione cellulare in provette per microcentrifuga separate per evitare ripetute pipettaggi.
4. Mantenere le sospensioni cellulari in ghiaccio fino al momento dell'iniezione. Iniettare 10 μL di cellule LLC1 marcate con GFP-Luciferasi per topo in questo protocollo, corrispondenti a 2 x 10⁴ cellule per topo.
   NOTA: Regolare il numero di cellule secondo necessità in base alla cinetica metastatica delle linee cellulari iniettate.

2. Preparazione dei topi

NOTA: In questo studio sono stati utilizzati topi maschi C57BL/6J, di età compresa tra 6 e 8 settimane.

1. Autoclavare in autoclave tutti gli strumenti chirurgici e i guanti dotati di teli chirurgici. Igienizzare il banco di lavoro e le apparecchiature non chirurgiche con etanolo al 75%, quindi coprire l'area di lavoro con teli impermeabili.
2. Prepara una gabbia per animali pulita e un cuscinetto riscaldante per il recupero post-procedura.
3. Anestetizzare il topo iniettando per via sottocutanea tribromoetanolo al 2% (200 mg/kg). Controllare la profondità dell'anestesia utilizzando un test di pizzico prima di procedere. Applicare un unguento oftalmico sterile per proteggere gli occhi dai danni corneali una volta che il topo è stato anestetizzato.
4. Radere il pelo dalla regione occipitale posteriore utilizzando un tagliacapelli, quindi applicare creme depilatorie per rimuovere completamente il pelo nella stessa regione.
5. Posizionare il mouse prono con il collo posizionato su una provetta da centrifuga da 15 mL. Fissare la testa e la parte bassa della schiena con del nastro adesivo e palpare lo spazio tra l'occipite e la vertebra C1 con il dito indice (Figura 1).
6. Disinfettare la regione occipitale posteriore con tre cicli di strofinamento con tamponi di cotone sterili imbevuti di etanolo al 75%, seguiti da scrub chirurgico betadine. Coprire le parti non sterili dell'animale con un telo sterile.

3. Iniezione di Cisterna magna

NOTA: Le tecniche asettiche sono necessarie per le seguenti fasi, compreso l'uso di dispositivi di protezione individuale e guanti sterili.

1. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare e aspirare 10 μl per iniezione con una siringa da insulina da 31 G da 8 mm.
2. Palpare l'area tra l'occipite e C1 del topo con il dito indice per individuare il sito preciso della puntura al margine mediano inferiore del cranio occipitale posteriore. Contrassegna questo sito se necessario.
3. Inserire l'ago con un angolo di 45°-50° nella cisterna magna attraverso il sito di puntura identificato, avanzando fino a una profondità di 4 mm. Una netta sensazione di sfondamento indica che l'ago è entrato con successo nella cisterna magna.
   1. Se il sito di puntura è difficile da individuare, praticare una piccola incisione di 3-5 mm all'altezza dell'orecchio per esporre la linea mediana posteriore. Se è necessaria un'incisione chirurgica, somministrare Meloxicam (5 mg/kg/die) e Buprenorfina (0,1 mg/kg) per via sottocutanea 1 ora prima dell'intervento.
4. Iniettare lentamente la sospensione cellulare facendo avanzare lo stantuffo della siringa, mantenendo la siringa ferma con la mano appoggiata sul tavolo.
5. Dopo l'inoculazione, tenere la siringa in posizione per altri 10 secondi per consentire l'equilibrio della pressione intracranica. Quindi, estrarre l'ago e premere il sito di puntura con un batuffolo di cotone sterile per 1-2 minuti.

4. Cura post-iniezione

1. Trasferisci gli animali in gabbie pulite su un termoforo e monitorali attentamente fino a quando non si sono completamente ripresi.
   1. Nel caso in cui venga praticata un'incisione, chiudere la ferita con colla per tessuti e clip. Somministrare ulteriori farmaci antidolorifici per 2-3 giorni dopo l'intervento chirurgico per controllare il dolore e favorire il recupero.
2. Monitorare attentamente i topi per 7 giorni dopo la procedura e controllare quotidianamente le attività fisiche degli animali e l'aspetto che circonda il sito di iniezione.

5. Valutazione della crescita del tumore leptomeningeo

1. Imaging a bioluminescenza
   1. Anestetizzare il topo e somministrare D-luciferina (150 μg/g) nella vena retroorbitale. Posizionare i topi nella camera di imaging, posizionandoli in un cono nasale designato sul collettore di anestesia. Utilizzare deflettori luminosi tra gli animali per ridurre al minimo l'interferenza del segnale.
   2. Fotografare immediatamente gli animali utilizzando il sistema IVIS con un tempo di esposizione compreso tra 0,5 s e 2 min⁶. Confermare il successo dell'inoculazione delle cellule tumorali nello spazio leptomeningeo mediante un segnale bioluminescente dispersivo attraverso la testa e il midollo spinale (Figura 2A).
   3. Monitorare la progressione della LM mediante imaging a bioluminescenza ogni 4 giorni. Regola gli intervalli di imaging in base alla cinetica di crescita del tumore.
2. Analisi istologica
   1. Anestetizzare i topi quando erano significativamente meno attivi o avevano perso il 20% del loro peso corporeo e tagliare la pelle e le costole per esporre la cavità toracica. Inserire con cautela una cannula a punta smussata nel ventricolo sinistro e far avanzare la cannula nell'aorta ascendente. Perfondere lentamente l'animale con 20 mL di PBS attraverso la cannula.
   2. Usa le forbici per rimuovere la testa e fai un'incisione del cuoio capelluto sulla linea mediana per esporre il cranio. Asportare i tessuti molli circostanti. Taglia lungo la cresta orbitale, quindi inserisci le forbici nel forame magno e avanza con cautela lungo la superficie interna del cranio con una pressione verso l'alto per evitare danni ai tessuti.
   3. Rimuovere le ossa craniche, quindi estrarre delicatamente il cervello. Fissare il cervello in paraformaldeide al 4% a 4 °C per 24 ore e poi equilibrarlo in una soluzione di saccarosio PBS al 15% per 24 ore, seguita da una soluzione di saccarosio PBS al 30% per altre 24 ore a 4 °C.
   4. Posizionare il fazzoletto in un criomold riempito con il composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT) e poi conservarlo su ghiaccio secco per 30 minuti^{e 20}.
   5. Tagliare il cervello incorporato nell'OCT in sezioni spesse 10 μm utilizzando un criostato. Conservare le sezioni in un congelatore a -80 °C fino a nuova applicazione.
   6. Eseguire la colorazione con ematossilina/eosina (H&E) sui vetrini cerebrali²¹. La presenza di cellule tumorali ai margini del cervello indica che le metastasi si verificano esclusivamente nello spazio leptomeningeo (Figura 3 e Tabella 1).
3. Microscopia a due fotoni
   1. Anestetizzare i topi con LM. Rimuovere il cuoio capelluto che copre la superficie dorsale del cranio con una pinza e delle forbici. Usa la lama di un bisturi per rimuovere il periostio sottile dalla superficie del cranio.
   2. Assottiglia il cranio con un trapano abrasivo fino a quando i vasi piali sono visibili attraverso il cranio assottigliato. Stabilizzare l'area di osservazione della testa del topo con un copricapo triangolare fissato con adesivo in tessuto^22,23.
   3. Somministrare 0,025 mL di TRITC-destrano al 5% (p/v) in una vena infraorbitale per marcare i vasi sanguigni²².
   4. Eseguire la microscopia a due fotoni attraverso le finestre di imaging e ricostruire lo spazio leptomeningeo (Figura 4). Rileva l'osso mediante fluorescenza di seconda armonica a 450 nm di emissione con eccitazione di 900 nm²⁴. Visualizza le cellule tumorali marcate con GFP e i vasi marcati con destrano raccogliendo segnali di fluorescenza a 507 nm e 572 nm di emissione con eccitazione rispettivamente di 900 nm e 1000 nm.
4. Microscopio a stereofluorescenza
   1. Rimuovere il cervello del topo e metterlo sotto uno stereomicroscopio. Visualizzare le celle marcate con GFP utilizzando un set di filtri specifici per GFP (Figura 5).

Risultati

La Figura 1 illustra il posizionamento del topo per l'iniezione e il sito di puntura dalle viste laterali e frontali. La Figura 2 mostra immagini rappresentative di bioluminescenza in vivo di animali testati per la generazione di LM attraverso diversi approcci. Le cellule LLC1 marcate con GFP-luciferasi sono state iniettate negli animali attraverso diverse vie, seguite da imaging bioluminescente. Come ...

Discussione

La LM è una condizione aggressiva e fatale. Una volta che le cellule tumorali metastatizzano nello spazio pieno di liquido cerebrospinale, si disseminano rapidamente in tutto il sistema nervoso centrale²⁵. Queste cellule si depositano e invadono il cervello, il midollo spinale, il cranio e i nervi spinali, portando infine a un rapido deterioramento neurologico e alla morte¹⁷. Per comprendere meglio i meccanismi fisiopatologici sottostanti ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5ml Eppendorf tubes	Biosharp	BS-15-M-S
15ml centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-15A
31G x 8mm insulin syringe(0.3ml)	Promisemed	/
Abrasive drill	GLOBALEBIO	GEGZ-AM1
Animal heat mat	woggee	/
Cryomold	Supin	SP-AB-7 x 7 x 5
Depilatory creams	Nair	1.00023E+11
D-Luciferin	Gold Biology	LUCK-1G
DMEM	Gibco	C11995500CP
FBS	Gibco	10270-106
IVIS Spectrum	Caliper	/
Optimal Cutting Temperature	Sakura	4583-1
Paraformaldehyde	SCR	80096618
PBS	Servicebio	G4202-500ML
Pen/Strep Amphotericin B	Gibco	15140122
Shaver	Hipidog	2103CGMJ3373-GQ22N526
Stereo fluorescence microscope	Olympus	/
Straight forceps	Beyotime	FS019	Need to be autoclaved
Surgical scissors	Beyotime	FS001	Need to be autoclaved
Triangular mouse fixation head piece	Transcend vivoscope	TVS-FDM-027
Tribromoethanol	Macklin	C14432922
TRITC-dextran, MW 70000	MedChemExpress	HY-158082C
Trypsin/EDTA solution	Gibco	25200056
Two-photon laser scanning microscopy	Olympus	/
Vetbond Tissue Adhesives	3M	1469SB