Минимально инвазивная инъекционная модель Cisterna Magna для изучения лептоменингеальных метастазов у мышей

Резюме

Протокол описывает метод введения опухолевых клеток через чрескожную пункцию в большую цистерну, который надежно индуцирует лептоменингеальные метастазы у мышей, уменьшая травматическую и экстракраниальную опухолевую нагрузку.

Аннотация

Лептоменингеальное метастазирование (ЛМ), распространение раковых клеток в лептоменинги, наполненные спинномозговой жидкостью (СМЖ), является редким, но разрушительным осложнением прогрессирующих солидных опухолей. Пациенты с ЛМ часто имеют плохой прогноз, при этом выживаемость измеряется от нескольких недель до нескольких месяцев. Разработка моделей in vivo , которые точно воспроизводят сложность ЛМ, имеет важное значение для понимания ее клеточных и патологических механизмов и оценки потенциальных методов лечения. Мышиные модели LM обычно создаются путем внутрисердечной, сонной артерии или большой цистерны опухолевых клеток. Тем не менее, внутрисердечные или сонные инъекции часто приводят к значительной экстракраниальной нагрузке и опухолям головного мозга, осложняя биолюминесцентную визуализацию и приводя к смертности, не связанной с ЛМ. Между тем, обычная инъекция cisterna magna требует инвазивных процедур, таких как разрез кожи и рассечение мышц, что делает ее одновременно травматичной и ресурсоемкой. В данной статье мы описываем минимально инвазивную процедуру введения опухолевых клеток в лептоменингеальное пространство через большую цистерну без необходимости разреза кожи. Такой подход уменьшает образование экстракраниальных опухолей, сводит к минимуму хирургическую травму и сокращает время и необходимый послеоперационный уход по сравнению с другими хирургическими методами. Важно отметить, что он последовательно индуцирует ЛМ с минимальной инфильтрацией паренхимы мозга, что подтверждается двухфотонной микроскопией и гистологическим анализом. Этот оптимизированный подход предлагает эффективную и надежную модель для изучения ЛМ в доклинических исследованиях.

Введение

Метастатическое заболевание остается самой большой проблемой для пациентов с прогрессирующим раком. Лептоменингеальное метастазирование (ЛМ) относится к распространению раковых клеток на пятую мозговую оболочку, паутинную оболочку и субарахноидальное пространство. ЛМ, вызванные солидными опухолями, становятся все более распространенными при раке легких (9–25%), раке молочной железы (5–20%) и меланоме (6–18%)^1,2, в основном благодаря более длительной выживаемости и усовершенствованным методам диагностики. Раковые клетки могут проникать в лептоменингеальное пространство несколькими путями, в том числе: 1) прямой инвазией через периферические структуры, такие как твердая мозговая оболочка, кости и нервы; 2) гематогенное распространение по венозной системе; и 3) попадание через артериальный кровоток, где раковые клетки проскальзывают через фенестрированные сосуды в сосудистое сплетение и впоследствии в наполненные спинномозговой жидкостью желудочки ^3,4,5. Опухолевые клетки, попадающие в лептоменингеальное пространство, сталкиваются с многочисленными проблемами, включая лишение факторов роста, ограниченные метаболические промежуточные продукты и гипоксические условия⁶. Однако из-за отсутствия соответствующих инструментов и методов плохо изучено, как опухолевые клетки ориентируются по этим путям и преодолевают негостеприимные условия для колонизации лептоменингеального пространства. Несмотря на достижения в области мультимодальной терапии, включая лучевую терапию, системное лечение и интратекальную инъекционную терапию, прогноз для пациентов с ЛМ остается плохим, при этом выживаемость обычно составляет от 2 до 4 месяцев 3,7,8,9. Таким образом, существует острая необходимость в более глубоком понимании биологии лептоменингеального метастазирования для улучшения существующих методов лечения и разработки новых, таргетных методов лечения. Достижение этой цели требует разработки моделей in vivo, которые повторяют сложные особенности LM.

В отличие от метастазов в таких органах, как печень, кости и мозг, ЛМ обычно развивается спустя годы после постановки диагноза первичной опухоли 10,11,12. Аналогичным образом, в моделях мышей со спонтанным метастазированием ЛМ встречается редко из-за его низкой частоты и того факта, что мыши обычно поддаются метастазам в других местах. Экспериментальные мышиные модели LM могут быть созданы с помощью различных методов, включая внутрисердечную, внутрисонную артерию или, в качестве альтернативы, прямую инъекцию в большую цистерну или желудочки головного мозга. В то время как внутрисердечная инъекция раковых клеток широко используется⁹, она часто приводит к значительному увеличению экстракраниальной опухолевой нагрузки, вызывая смертность, не связанную с LM. Альтернативные подходы, такие как введение опухолевых клеток через сонную артерию^13,14, требуют обширных специализированных ресурсов и приводят к большим хирургическим разрезам, которые являются травматичными. Более того, этот метод также в первую очередь приводит к метастазированию в самих тканях мозга, а не в лептоменингах, и является трудоемким и неэффективным для^{создания LM-моделей}. Инъекция в большую цистерну обеспечивает прямую доставку опухолевых клеток в лептоменингеальное пространство. В нескольких исследованиях этот подход использовался для изучения механизмов ЛМ и оценки новых методов лечения ^6,16,17.

В этой рукописи мы представляем удобный протокол транс-цистерны magna инъекции, включающий прямую чрескожную пункцию для быстрого и стабильного получения большего количества мышей с ЛМ. Этот метод обходит мозговой барьер и кровь и, следовательно, позволяет эффективно ксенотрансплантировать опухолевые клетки в лептоменинговом пространстве. Это также значительно сокращает хирургическую травму и время процедуры, надежно индуцируя LM у мышей. Нами подтверждена встречаемость ЛМ с минимальной инфильтрацией в паренхиму головного мозга, что подтверждено с помощью двухфотонной микроскопии и гистологического анализа. Таким образом, полученная модель точно воспроизводит сложное микроокружение LM, предоставляя ценный инструмент для изучения связанных с заболеванием клеточных и патологических механизмов и оценки потенциальных методов лечения.

протокол

Все процедуры на животных, описанные в данной рукописи, были проверены и одобрены Комитетом по благополучию и этике лабораторных животных ZJU (ZJU20230155). Мыши C57BL/6J и NSG были получены и размещены в условиях, свободных от специфических патогенов, в Центре лабораторных животных ZJU. В этом протоколе используется клеточная линия рака легких мышей, карцинома легких Льюиса (LLC1), и клеточная линия рака легких человека, A549, обе мечены GFP и люциферазой светлячков. Обе клеточные линии любезно предоставлены доктором Сян Х. Ф. Чжаном (Медицинский колледж Бейлора, США)¹⁸. В качестве примера мы используем ячейки LLC1. Процедура введения клеток A549 практически идентична, за исключением того, что мышам NSG было введено 6 x 10⁴ A549 клеток.

1. Подготовка раковых клеток к инъекциям

1. Культивирование 1,0 x 10⁶ клеток LLC1 в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,1 мг/мл пенициллин-стрептомицина при 37 °C в инкубаторе с 5%_CO2 . Когда клетки достигнут 70%-90% конфлюенции, трипсинизируйте их в течение 1 мин, используя 2 мл 0,25% раствора трипсина/ЭДТА. Центрифугируйте клетки при 300 x g в течение 3 минут, промойте их 2 раза ледяным PBS и повторно суспендируйте в 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
2. Оценивают концентрацию жизнеспособных клеток с помощью раствора Трипана Синего и гемоцитометра¹⁹. Убедитесь, что жизнеспособность клеток превышает 90%, при этом большинство клеток являются одиночными. Отрегулируйте концентрацию клеток до 2 x 10⁶ клеток/мл при ледяном PBS.
3. Аликвотировать 50 мкл клеточной суспензии в отдельные микроцентрифужные пробирки во избежание многократного пипетирования.
4. Держите клеточные суспензии на льду до тех пор, пока они не будут готовы к инъекции. Введите 10 мкл меченых GFP-люциферазой клеток LLC1 на мышь в этом протоколе, что соответствует 2 x 10⁴ клеткам на мышь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости отрегулируйте количество клеток в зависимости от кинетики метастатических линий вводимых клеток.

2. Подготовка мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании использовались самцы мышей C57BL/6J в возрасте 6-8 недель.

1. Автоклав всех хирургических инструментов и перчаток упакован хирургическими простынями. Продезинфицируйте настольное и нехирургическое оборудование с помощью этанола на 75%, затем накройте рабочую зону водонепроницаемыми портьерами.
2. Подготовьте чистую клетку для содержания животных и согревающую подушку для восстановления после процедуры.
3. Обезболивайте мышь путем подкожного введения 2% трибромэтанола (200 мг/кг). Прежде чем продолжить, проверьте глубину анестезии с помощью щипкового теста. Нанесите стерильную офтальмологическую мазь, чтобы защитить глаза от повреждения роговицы после обезболивания мыши.
4. Сбрейте шерсть с задней затылочной области с помощью машинок для стрижки с последующим нанесением кремов для депиляции для полного удаления шерсти в той же области.
5. Расположите мышь в положении лежа так, чтобы ее горлышко было помещено на центрифужную пробирку объемом 15 мл. Зафиксируйте голову и поясницу лентой и пропальпируйте пространство между затылком и позвонком С1 указательным пальцем (рисунок 1).
6. Продезинфицируйте заднюю затылочную область тремя циклами протирания стерильными ватными тампонами, смоченными на 75% этанолом, а затем хирургическим скрабом бетадином. Накройте нестерильные части тела животного стерильной простыней.

3. Инъекция цистерны магна

ПРИМЕЧАНИЕ: Асептические методы необходимы для следующих этапов, включая использование средств индивидуальной защиты и стерильных перчаток.

1. Аккуратно пипетируйте клеточную суспензию и аспирируйте 10 мкл для инъекции с помощью шприца с инсулином 31G, 8 мм.
2. Пальпируйте область между затылком и С1 мыши указательным пальцем, чтобы определить точное место прокола на нижнем срединном крае заднего затылочного черепа. При необходимости отметьте этот сайт.
3. Введите иглу под углом 45°-50° в цистерну через выявленное место прокола, продвигаясь на глубину до 4 мм. Отчетливое ощущение прорыва указывает на то, что игла успешно вошла в цистерну магна.
   1. Если место прокола трудно обнаружить, сделайте небольшой разрез 3-5 мм на уровне уха, чтобы обнажить заднюю среднюю линию. Если требуется хирургический разрез, введите мелоксикам (5 мг/кг/сут) и бупренорфин (0,1 мг/кг) подкожно за 1 ч до операции.
4. Медленно вводите клеточную суспензию, продвигая поршень шприца, удерживая шприц в неподвижном положении рукой, лежащей на столе.
5. После прививки удерживайте шприц на месте еще 10 секунд, чтобы внутричерепное давление сбалансировалось. Затем извлеките иглу и прижмите место прокола стерильным ватным тампоном на 1-2 минуты.

4. Постинъекционный уход

1. Пересадите животных в чистые клетки на грелке и внимательно следите за ними, пока они полностью не выздоровеют.
   1. В случае разреза закройте рану с помощью тканевого клея и зажимов. Принимайте дополнительные обезболивающие препараты в течение 2-3 дней после операции, чтобы контролировать боль и способствовать выздоровлению.
2. Внимательно наблюдайте за мышами в течение 7 дней после процедуры и ежедневно проверяйте физическую активность животных и внешний вид вокруг места инъекции.

5. Оценка роста лептоменингеальной опухоли

1. Биолюминесцентная визуализация
   1. Обезболите мышь и введите D-люциферин (150 мкг/г) в ретроорбитальную вену. Поместите мышей в камеру визуализации, расположив их в специальном носовом конусе на анестезиологическом коллекторе. Используйте световые перегородки между животными, чтобы свести к минимуму помехи сигнала.
   2. Немедленно визуализируйте животных с помощью системы IVIS с временем экспозиции от 0,5 с до 2 мин⁶. Подтвердите успешную инокуляцию опухолевых клеток в лептоменингеальном пространстве с помощью дисперсионного биолюминесцентного сигнала через голову и спинной мозг (рис. 2A).
   3. Контролируйте прогрессирование ЛМ с помощью биолюминесцентной визуализации каждые 4 дня. Корректируйте интервалы визуализации в зависимости от кинетики роста опухоли.
2. Гистологический анализ
   1. Обезболивайте мышей, когда они были значительно менее активны или потеряли 20% массы тела, и разрезали кожу и ребра, чтобы обнажить их грудную полость. Осторожно введите канюлю с тупым концом в левый желудочек и продвигайте канюлю в восходящую аорту. Медленно прополните животное 20 мл PBS через канюлю.
   2. С помощью ножниц удалите голову и сделайте разрез по средней линии кожи головы, чтобы обнажить череп. Иссекаем окружающие мягкие ткани. Разрежьте вдоль орбитального гребня, затем вставьте ножницы в большое затылочное отверстие, и осторожно продвигайтесь вдоль внутренней поверхности черепа с надавливанием вверх, чтобы избежать повреждения тканей.
   3. Удалите кости черепа, а затем аккуратно извлеките мозг. Зафиксируйте мозг в 4% параформальдегиде при 4 °C в течение 24 ч, а затем уравновесьте его в 15% раствор сахарозы PBS на 24 ч, а затем 30% раствор сахарозы PBS еще на 24 ч при 4 °C.
   4. Поместите ткань в криомолд, наполненный составом для оптимальной температуры резки (OCT), а затем храните ее на сухом льду в течение 30 минут²⁰ минут.
   5. Разрежьте встроенный в ОКТ мозг на участки толщиной 10 мкм с помощью криостата. Храните секции в морозильной камере при температуре -80 °C до дальнейшего применения.
   6. Выполнение окрашивания гематоксилином/эозином (H&E) на предметных стеклах головного мозга²¹. Наличие опухолевых клеток на краю мозга свидетельствует о том, что метастазирование происходит исключительно в лептоменингеальном пространстве (рисунок 3 и таблица 1).
3. Двухфотонная микроскопия
   1. Обезболите мышей с помощью LM. Снимите скальпы, покрывающие спинную поверхность черепа, щипцами и ножницами. С помощью лезвия скальпеля удалите тонкую надкостницу с поверхности черепа.
   2. Утончите череп с помощью абразивного сверла до тех пор, пока через истонченный череп не будут видны сосуды пиала. Стабилизируйте зону наблюдения головки мыши с помощью треугольного головного передатчика, закрепленного тканевым клеем^22,23.
   3. Ввести 0,025 мл 5% (w/v) TRITC-декстрана в подглазничную вену для мечения кровеносных сосудов²².
   4. Проведите двухфотонную микроскопию через окна визуализации и реконструируйте лептоменингеальное пространство (рис. 4). Определение кости методом флуоресценции второй гармоники при излучении 450 нм с возбуждением 900 нм²⁴. Визуализируйте меченые GFP опухолевые клетки и меченые декстрана сосуды путем сбора флуоресцентных сигналов с длиной волны 507 нм и 572 нм с возбуждением 900 нм и 1000 нм соответственно.
4. Стереофлуоресцентный микроскоп
   1. Извлеките мозг мыши и поместите его под стереомикроскоп. Визуализируйте ячейки, помеченные GFP, с помощью набора фильтров, специфичного для GFP (рисунок 5).

Результаты

На рисунке 1 показано положение мыши для инъекции и место прокола с бокового и переднего видов. На рисунке 2 представлены репрезентативные биолюминесцентные изображения in vivo животных, протестированных на генерацию LM с по...

Обсуждение

ЛМ является агрессивным и смертельным заболеванием. Как только опухолевые клетки метастазируют в пространство, заполненное спинномозговой жидкостью, они быстро распространяются по всей центральной^{нервной системе.} Эти клетки оседают и проникают в голо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5ml Eppendorf tubes	Biosharp	BS-15-M-S
15ml centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-15A
31G x 8mm insulin syringe(0.3ml)	Promisemed	/
Abrasive drill	GLOBALEBIO	GEGZ-AM1
Animal heat mat	woggee	/
Cryomold	Supin	SP-AB-7 x 7 x 5
Depilatory creams	Nair	1.00023E+11
D-Luciferin	Gold Biology	LUCK-1G
DMEM	Gibco	C11995500CP
FBS	Gibco	10270-106
IVIS Spectrum	Caliper	/
Optimal Cutting Temperature	Sakura	4583-1
Paraformaldehyde	SCR	80096618
PBS	Servicebio	G4202-500ML
Pen/Strep Amphotericin B	Gibco	15140122
Shaver	Hipidog	2103CGMJ3373-GQ22N526
Stereo fluorescence microscope	Olympus	/
Straight forceps	Beyotime	FS019	Need to be autoclaved
Surgical scissors	Beyotime	FS001	Need to be autoclaved
Triangular mouse fixation head piece	Transcend vivoscope	TVS-FDM-027
Tribromoethanol	Macklin	C14432922
TRITC-dextran, MW 70000	MedChemExpress	HY-158082C
Trypsin/EDTA solution	Gibco	25200056
Two-photon laser scanning microscopy	Olympus	/
Vetbond Tissue Adhesives	3M	1469SB