מודל הזרקת Cisterna Magna זעיר פולשני למחקרי גרורות לפטומנינגיאליות בעכברים

Summary

הפרוטוקול מתאר שיטה להזרקת תאי גידול דרך מסלול הניקוב המלעורי לתוך ציסטרנה מגנה הגורמת בעוצמה לגרורות לפטומנינגיאליות בעכברים, ומפחיתה את הטראומה ואת עומס הגידול החוץ-גולגולתי.

Abstract

גרורות לפטומנינגיאליות (LM), התפשטות תאים סרטניים לתוך לפטומנינגים מלאים בנוזל המוח השדרתי (CSF), היא סיבוך נדיר אך הרסני של גידולים מוצקים מתקדמים. לחולים עם LM יש לעתים קרובות פרוגנוזה גרועה, כאשר ההישרדות נמדדת בשבועות עד חודשים. פיתוח מודלים in vivo המשכפלים במדויק את המורכבות של LM חיוני להבנת המנגנונים התאיים והפתולוגיים שלו ולהערכת טיפולים פוטנציאליים. מודלים של LM עכברים נוצרים בדרך כלל באמצעות הזרקת תאי גידול תוך-לבביים, עורק הצוואר או ציסטרנה מגנה. עם זאת, זריקות תוך לב או קרוטיד גורמות לרוב לעומס משמעותי על גידולים חוץ-גולגולתיים ומוחיים, מה שמסבך את ההדמיה הביולוגית ומוביל לתמותה שאינה קשורה ל-LM. בינתיים, הזרקת סיטרנה מגנה קונבנציונלית דורשת הליכים פולשניים, כגון חתך בעור ודיסקציה של שרירים, מה שהופך אותה לטראומטית ועתירת משאבים. כאן אנו מתארים הליך זעיר פולשני להזרקת תאי גידול לחלל הלפטומנינגיאלי דרך בור המים ללא צורך בחתך בעור. גישה זו מפחיתה היווצרות גידול חוץ-גולגולתי, ממזערת טראומה כירורגית ומקצרת את הזמן והטיפול לאחר הניתוח הנדרשים בהשוואה לשיטות כירורגיות אחרות. חשוב לציין, הוא גורם באופן עקבי ל-LM עם חדירת פרנכימה מוחית מינימלית, כפי שאושר על ידי מיקרוסקופיה דו-פוטונית וניתוח היסטולוגי. גישה יעילה זו מציעה מודל יעיל ואמין לחקר LM במחקר פרה-קליני.

Introduction

המחלה הגרורתית נותרה האתגר הגדול ביותר עבור חולים עם סרטן מתקדם. גרורות לפטומנינגיאליות (LM) מתייחסות להתפשטות של תאים סרטניים ל-pia mater, ל-arachnoid mater ולחלל התת-עכבישי. LM מגידולים מוצקים הופך נפוץ יותר ויותר בסרטן ריאות (9%-25%), סרטן השד (5%-20%) ומלנומה (6%-18%)^1,2, בעיקר בשל הישרדות ארוכה יותר וטכניקות אבחון משופרות. תאי סרטן יכולים לפלוש למרחב הלפטומנינגיאלי במספר דרכים, כולל 1) פלישה ישירה דרך מבנים היקפיים כגון דורה, עצם ועצבים; 2) התפשטות המטוגנית דרך מערכת הוורידים; ו-3) כניסה דרך מחזור הדם העורקי, שבו תאים סרטניים מחליקים דרך כלי דם מנופחים לתוך מקלעת הכורואיד ולאחר מכן לחדרים המלאים בנוזל המוח^{השדרתי 3,4,5}. תאי גידול הנכנסים לחלל הלפטומנינגיאלי נתקלים באתגרים מרובים, כולל מחסור בגורמי גדילה, מתווכים מטבוליים מוגבלים ומצבים היפוקסיים⁶. עם זאת, בשל היעדר כלים וטכניקות מתאימות, כיצד תאי הגידול מנווטים במסלולים אלה ומתגברים על תנאים לא מסבירי פנים כדי ליישב את המרחב הפטומנינגיאלי אינו מובן היטב. למרות ההתקדמות בטיפולים רב-מודאליים, כולל רדיותרפיה, טיפול מערכתי וטיפול בהזרקה תוך-תקלית, הפרוגנוזה עבור חולי LM נותרה גרועה, כאשר ההישרדות נעה בדרך כלל בין 2 ל-4 חודשים 3,7,8,9. לפיכך, יש צורך דחוף בהבנה עמוקה יותר של הביולוגיה של גרורות לפטומנינגיאליות כדי לשפר את הטיפולים הקיימים ולפתח טיפולים חדשים וממוקדים. השגת מטרה זו דורשת פיתוח של מודלים in vivo המסכמים את התכונות המורכבות של LM.

בניגוד לגרורות באיברים כמו כבד, עצם ומוח, LM מתפתח בדרך כלל שנים לאחר אבחון הגידול הראשוני 10,11,12. באופן דומה, במודלים של עכברים עם גרורות ספונטניות, LM נדיר בשל השכיחות הנמוכה שלו והעובדה שעכברים בדרך כלל נכנעים לגרורות באתרים אחרים. ניתן ליצור מודלים ניסיוניים של LM עכברים בשיטות שונות, כולל עורק תוך-לבבי, עורק תוך-צוואר, או לחילופין, הזרקה ישירה לבור המים או לחדרי המוח. בעוד שהזרקה תוך-קרדיולוגית של תאים סרטניים נמצאת בשימוש נרחב⁹, היא גורמת לעתים קרובות לעומס גידול חוץ-גולגולתי משמעותי, הגורם לתמותה שאינה קשורה ל-LM. גישות חלופיות, כגון הזרקת תאי גידול דרך עורק הצוואר^13,14, דורשות משאבים מיוחדים נרחבים וגורמות לחתכים כירורגיים גדולים, שהם טראומטיים. יתר על כן, שיטה זו מובילה בעיקר לגרורות בתוך רקמות המוח עצמן, ולא לפטומנינג, והיא גוזלת זמן ולא יעילה לביסוס מודלים של LM¹⁵. הזרקה לבור המגנה מאפשרת העברה ישירה של תאי הגידול לחלל הלפטומנינגיאל. מספר מחקרים השתמשו בגישה זו כדי לחקור מנגנוני LM ולהעריך טיפולים חדשים ^6,16,17.

בכתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול נוח להזרקת מגנה טרנס-ציסטרנה הכולל ניקור מלעורי ישיר כדי ליצור במהירות וביציבות כמות גדולה יותר של עכברים עם LM. שיטה זו עוקפת את מחסום המוח-דם ולכן מאפשרת קסנוגרפט יעיל של תאי הגידול בחלל הלפטומנינג. זה גם מפחית משמעותית את הטראומה הכירורגית ואת זמן ההליך תוך גרימת LM באופן אמין בעכברים. אישרנו את התרחשות LM עם חדירה מינימלית לפרנכימה של המוח, כפי שאומת על ידי מיקרוסקופ דו-פוטוני וניתוח היסטולוגי. לכן, המודל המתקבל משכפל נאמנה את המיקרו-סביבה המורכבת של LM, ומספק כלי רב ערך לחקר מנגנונים תאיים ופתולוגיים הקשורים למחלה ולהערכת טיפולים פוטנציאליים.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בכתב יד זה נבדקו ואושרו על ידי הוועדה לסקירת רווחת בעלי חיים ואתיקה במעבדה (ZJU20230155). עכברי C57BL/6J ו-NSG התקבלו ושוכנו בתנאים נטולי פתוגנים ספציפיים במרכז חיות המעבדה של ZJU. פרוטוקול זה משתמש בקו תאי סרטן הריאה של העכברים, קרצינומה של ריאות לואיס (LLC1), וקו תאי סרטן ריאה אנושיים, A549, שניהם מסומנים ב-GFP ובלוציפראז גחלילית. שני קווי התאים מסופקים באדיבות על ידי ד"ר שיאנג ה. פ. ז'אנג (מכללת ביילור לרפואה, ארה"ב)¹⁸. כאן, אנו משתמשים בתאי LLC1 כדוגמה. הליך הזרקת תאי A549 כמעט זהה, פרט לכך ש-6 x 10⁴ תאי A549 הוזרקו לעכברי NSG.

1. הכנת תאים סרטניים להזרקה

1. תרבית 1.0 x 10⁶ תאי LLC1 ב-DMEM בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ו-0.1 מ"ג/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין ב-37 מעלות צלזיוס באינקובטור של 5% CO₂ . כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%-90%, נסה אותם למשך דקה אחת באמצעות 2 מ"ל של תמיסת טריפסין/EDTA של 0.25%. צנטריפוגה של התאים ב-300 x גרם למשך 3 דקות, שטפו אותם פי 2 עם PBS קר כקרח, והשעו אותם מחדש ב-1 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS).
2. להעריך את ריכוז התאים ברי קיימא באמצעות תמיסת טריפאן בלו והמוציטומטר¹⁹. ודא שחיוניות התא גדולה מ-90%, כאשר רוב התאים הם יחידים. התאם את ריכוז התאים ל-2 x 10⁶ תאים/מ"ל ב-PBS קר כקרח.
3. יש לשים 50 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינורות מיקרו-צנטריפוגה נפרדים כדי למנוע פיפטינג חוזר ונשנה.
4. שמור את תרחיפי התאים על קרח עד שהם מוכנים להזרקה. הזרקו 10 מיקרוליטר של תאי LLC1 עם תווית GFP-Luciferase לכל עכבר בפרוטוקול זה, המתאימים ל-2 x 10⁴ תאים לעכבר.
   הערה: התאם את מספר התא לפי הצורך על סמך הקינטיקה הגרורתית של קווי התאים המוזרקים.

2. הכנת עכברים

הערה: במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6J זכרים, בגילאי 6-8 שבועות.

1. חיטוי כל המכשירים הכירורגיים והכפפות ארוזים בווילונות כירורגיים. חטאו את הספסל והציוד הלא כירורגי עם 75% אתנול, ולאחר מכן כסו את אזור העבודה בווילונות עמידים למים.
2. הכינו כלוב מגורים נקי לבעלי חיים וכרית חימום להתאוששות לאחר ההליך.
3. להרדים את העכבר על ידי הזרקה תת עורית של 2% טריברומו-אתנול (200 מ"ג/ק"ג). בדוק את עומק ההרדמה באמצעות בדיקת צביטה לפני שתמשיך. יש למרוח משחת עיניים סטרילית כדי להגן על העיניים מפני נזק לקרנית לאחר הרדמת העכבר.
4. לגלח את הפרווה מאזור העורף האחורי באמצעות קוצץ, ולאחר מכן למרוח קרמים להסרת הפרווה לחלוטין באותו אזור.
5. מקם את העכבר על הבטן כשצווארו מונח מעל צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. אבטח את הראש והגב התחתון עם סרט וממשש את הרווח בין העורף לחוליה C1 עם האצבע המורה (איור 1).
6. יש לחטא את אזור העורף האחורי בשלושה סבבי ניגוב עם 75% צמר גפן סטרילי ספוג אתנול, ולאחר מכן קרצוף כירורגי בטאדין. מכסים את החלקים הלא סטריליים של החיה בווילון סטרילי.

3. הזרקת Cisterna magna

הערה: טכניקות אספטיות נדרשות לשלבים הבאים, כולל שימוש בציוד מגן אישי וכפפות סטריליות.

1. צנרת בעדינות את תרחיף התא ושואבת 10 מיקרוליטר להזרקה עם מזרק אינסולין 31G, 8 מ"מ.
2. משש את האזור שבין העורף ל-C1 של העכבר באצבע המורה כדי לאתר את אתר הניקוב המדויק בשוליים החציוניים התחתונים של הגולגולת העורפית האחורית. סמן אתר זה במידת הצורך.
3. הכנס את המחט בזווית של 45°-50° לתוך בור המים דרך אתר הניקוב המזוהה, והתקדם לעומק של 4 מ"מ. תחושת פריצת דרך מובהקת מצביעה על כך שהמחט נכנסה בהצלחה לבור המים.
   1. אם קשה לאתר את אתר הניקוב, בצע חתך קטן של 3-5 מ"מ בגובה האוזן כדי לחשוף את קו האמצע האחורי. אם נדרש חתך כירורגי, יש לתת מלוקסיקם (5 מ"ג/ק"ג/יום) ובופרנורפין (0.1 מ"ג/ק"ג) תת עורית שעה אחת לפני הניתוח.
4. הזרקו לאט את מתלה התאים על ידי קידום בוכנת המזרק, תוך שמירה על יציבות המזרק כשהיד מונחת על השולחן.
5. לאחר החיסון, החזק את המזרק במקומו למשך 10 שניות נוספות כדי לאפשר ללחץ התוך גולגולתי להתאזן לאחר מכן, משוך את המחט ולחץ על מקום הניקוב בעזרת צמר גפן סטרילי למשך 1-2 דקות.

4. טיפול לאחר הזרקה

1. העבירו את בעלי החיים לכלובים נקיים על כרית חימום ועקבו אחריהם מקרוב עד שיתאוששו לחלוטין.
   1. במקרה שנעשה חתך, סגור את הפצע באמצעות דבק רקמות וקליפסים. יש לתת תרופות נוספות לשיכוך כאבים במשך 2-3 ימים לאחר הניתוח כדי לשלוט בכאב ולסייע בהחלמה.
2. יש לעקוב מקרוב אחר העכברים במשך 7 ימים לאחר ההליך ולבדוק את הפעילות הגופנית של בעלי החיים ואת המראה סביב מקום ההזרקה מדי יום.

5. הערכת צמיחת גידול לפטומנינגיאלי

1. הדמיית ביולומינסנציה
   1. להרדים את העכבר ולתת D-לוציפרין (150 מיקרוגרם/גרם) בווריד הרטרואורביטלי. הנח את העכברים בתא ההדמיה, ומקם אותם בקונוס אף ייעודי על סעפת ההרדמה. השתמש בבלבולי אור בין בעלי חיים כדי למזער את הפרעות האות.
   2. דמיינו את בעלי החיים מיד באמצעות מערכת IVIS עם זמן חשיפה בין 0.5 שניות ל-2 דקות⁶. אשר חיסון מוצלח של תאי גידול בחלל הלפטומנינגיאלי על ידי אות ביולומינסנט מפוזר על פני הראש וחוט השדרה (איור 2A).
   3. עקוב אחר התקדמות LM על ידי הדמיית ביולומינסנציה כל 4 ימים. התאמת מרווחי הדמיה על סמך קינטיקה של צמיחת הגידול.
2. ניתוח היסטולוגי
   1. להרדים את העכברים כאשר הם היו פחות פעילים באופן משמעותי או איבדו 20% ממשקל גופם ולחתוך את העור והצלעות כדי לחשוף את חלל בית החזה שלהם. הכנס בזהירות צינורית קהה לחדר השמאלי וקדם את הצינורית לתוך אבי העורקים העולה. החדרו את החיה עם 20 מ"ל PBS דרך הצינורית לאט.
   2. השתמש במספריים כדי להסיר את הראש ולבצע חתך בקרקפת בקו האמצע כדי לחשוף את הגולגולת. כרתו את הרקמות הרכות שמסביב. חותכים לאורך רכס המסלול, ואז מכניסים מספריים לתוך הפורמן מגנום, ומתקדמים בזהירות לאורך המשטח הפנימי של הגולגולת בלחץ כלפי מעלה כדי למנוע נזק לרקמות.
   3. הסר את עצמות הגולגולת, ולאחר מכן חלץ בעדינות את המוח. קבע את המוח ב-4% פרפורמלדהיד ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות ולאחר מכן אזן אותו לתמיסת PBS סוכרוז של 15% למשך 24 שעות, ואחריה תמיסת PBS סוכרוז 30% למשך 24 שעות נוספות ב-4 מעלות צלזיוס.
   4. הניחו את הטישו בקריומולד מלא בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) ולאחר מכן אחסנו אותה על קרח יבש למשך 30 דקות²⁰.
   5. חותכים את המוח המוטבע ב-OCT למקטעים בעובי 10 מיקרומטר באמצעות קריוסטט. אחסן את החלקים במקפיא של -80 מעלות צלזיוס עד ליישום נוסף.
   6. בצע צביעת המטוקסילין/אאוזין (H&E) על שקופיות המוח²¹. נוכחותם של תאי גידול בקצה המוח מצביעה על כך שגרורות מתרחשות אך ורק בחלל הלפטומנינגיאלי (איור 3 וטבלה 1).
3. מיקרוסקופיה דו-פוטונית
   1. להרדים את העכברים עם LM. הסר את הקרקפות המכסות את משטח הגולגולת הגבי בעזרת מלקחיים ומספריים. השתמש בלהב אזמל כדי להסיר את הפריאוסטאום הדק מפני השטח של הגולגולת.
   2. דק את הגולגולת בעזרת מקדחה שוחקת עד שכלי הפיאל נראים דרך הגולגולת הדלילה. ייצב את אזור התצפית של ראש העכבר עם כיסוי ראש משולש המאובטח על ידי דבק רקמות^22,23.
   3. יש לתת 0.025 מ"ל של 5% (w/v) TRITC-dextan בווריד אינפרא-אורביטלי כדי לסמן את כלי הדם²².
   4. בצע מיקרוסקופיה דו-פוטונית דרך חלונות ההדמיה ושחזר את המרחב הפטומנינגיאלי (איור 4). זיהוי העצם על ידי פלואורסצנציה הרמונית שנייה בפליטה של 450 ננומטר עם עירור של 900 ננומטר²⁴. דמיין תאי גידול המסומנים ב-GFP וכלי דם מסומנים בדקסטרן על ידי איסוף אותות פלואורסצנטיים בפליטה של 507 ננומטר ו-572 ננומטר עם עירור של 900 ננומטר ו-1000 ננומטר, בהתאמה.
4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאו
   1. הסר את מוח העכבר והנח אותו מתחת לסטריאומיקרוסקופ. דמיינו תאים עם תווית GFP באמצעות ערכת מסננים ספציפית ל-GFP (איור 5).

תוצאות

איור 1 ממחיש את מיקום העכבר להזרקה ואת אתר הניקוב ממבט רוחבי וקדמי. איור 2 מציג תמונות ביולומינסנציה מייצגות in vivo של בעלי חיים שנבדקו ליצירת LM באמצעות גישות שונות. תאי LLC1 המסומנים ב-GFP-luciferase הוזרקו לבעלי החיים בדרכים שונות, וא...

Discussion

LM הוא מצב אגרסיבי וקטלני. ברגע שתאי הגידול שולחים גרורות לחלל המלא בנוזל השדרה, הם מתפשטים במהירות בכל מערכת העצבים המרכזית²⁵. תאים אלה מתיישבים ופולשים לעצבי המוח, חוט השדרה, הגולגולת ועמוד השדרה, מה שמוביל בסופו של דבר להידרדרות נוירולוגית מהירה ובסופו של ד...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5ml Eppendorf tubes	Biosharp	BS-15-M-S
15ml centrifuge tube	LABSELECT	CT-002-15A
31G x 8mm insulin syringe(0.3ml)	Promisemed	/
Abrasive drill	GLOBALEBIO	GEGZ-AM1
Animal heat mat	woggee	/
Cryomold	Supin	SP-AB-7 x 7 x 5
Depilatory creams	Nair	1.00023E+11
D-Luciferin	Gold Biology	LUCK-1G
DMEM	Gibco	C11995500CP
FBS	Gibco	10270-106
IVIS Spectrum	Caliper	/
Optimal Cutting Temperature	Sakura	4583-1
Paraformaldehyde	SCR	80096618
PBS	Servicebio	G4202-500ML
Pen/Strep Amphotericin B	Gibco	15140122
Shaver	Hipidog	2103CGMJ3373-GQ22N526
Stereo fluorescence microscope	Olympus	/
Straight forceps	Beyotime	FS019	Need to be autoclaved
Surgical scissors	Beyotime	FS001	Need to be autoclaved
Triangular mouse fixation head piece	Transcend vivoscope	TVS-FDM-027
Tribromoethanol	Macklin	C14432922
TRITC-dextran, MW 70000	MedChemExpress	HY-158082C
Trypsin/EDTA solution	Gibco	25200056
Two-photon laser scanning microscopy	Olympus	/
Vetbond Tissue Adhesives	3M	1469SB