تصميم أنظمة التخمير في الحالة الصلبة لإنتاج إنزيم البوليمر المائي خارج الخلية بواسطة الفطريات الخيطية

Summary

يستخدم هذا البروتوكول نخالة القمح في نظام تخمير دوار للحالة الصلبة لتعزيز إنتاج الإنزيم. تدعم الركيزة ، المكملة بمحفزات مثل الكيتين ، نمو الفطريات في ظل ظروف خاضعة للرقابة. تظهر النتائج أن إنتاجية الإنزيم أعلى من 4-6 مرات مقارنة بالتخمير المغمور ، مما يدل على قدرة الطريقة على التكيف وفعاليتها لتطبيقات التكنولوجيا الحيوية المتنوعة.

Abstract

تخمير الحالة الصلبة (SSF) هو عملية تحويل حيوي تستخدم ركيزة صلبة لا تذوب في وسط مائي. تنمو الكائنات الحية الدقيقة على سطح الركيزة وتخترق مصفوفة صلبة لاستخراج العناصر الغذائية الأساسية لنموها. يتميز SSF بالحد الأدنى من الماء الحر ، مع الحفاظ على محتوى رطوبة الركيزة فوق 70٪ ، ويتضمن ثلاث مراحل مترابطة - غازية وسائلة وصلبة. يصف هذا البروتوكول استخدام نخالة القمح ، وهي منتج ثانوي صناعي زراعي ، كركيزة أساسية لإنتاج الإنزيم في نظام دوار. يتم استكمال الركيزة بمحفز ، مثل الكيتين أو الشيتوزان أو النشا أو السليلوز ، لتعزيز تخليق البروتينات المحللة للهيدراء. النظام قابل للتكيف بدرجة كبيرة ، مما يسمح باستخدام أشكال فطرية مختلفة ، بما في ذلك الفطريات أو الجراثيم أو الكريات. في المنهجية الموصوفة ، يتم خلط المحفز والركيزة بنسبة 1: 100 (وزن / وزن) ، ويتم تعقيمهما عن طريق التعقيم ، وتعديلهما على مستوى الرطوبة المطلوب بالماء المعقم. ثم يضاف اللقاح الفطري ، ويعمل النظام الدوار عند 10 دورات في الدقيقة لضمان الخلط والأكسجين الكافيين. يتم تحضين النظام لمدة 6-8 أيام في ظل ظروف النمو المثلى للفطريات المتوسطة أو المحبة للحرارة / المتحملة للحرارة ، مما يعزز تعدد استخداماته. بعد الحضانة ، يتم استخراج الإنزيم بسهولة باستخدام مخزن بارد مناسب (على سبيل المثال ، الأسيتات أو السترات أو الفوسفات) ، اعتمادا على نوع الإنزيم. يتم توضيح المستخلص من خلال الطرد المركزي والترشيح للحصول على مادة طافية خالية من الخلايا. يمكن بعد ذلك تركيز الإنزيم أو تنقيته حسب الحاجة. أظهرت النتائج زيادة بنسبة 4-6 أضعاف في نشاط الإنزيم مقارنة بالتخمير المغمور (SmF) ، مما يسلط الضوء على فعالية النظام. إن قدرته على التكيف مع الركائز والمحفزات والأنواع الفطرية المختلفة تجعله أداة قيمة لمختلف تطبيقات التكنولوجيا الحيوية.

Introduction

برز تخمير الحالة الصلبة (SSF) كتقنية تحويل حيوي واعدة ومستدامة لإنتاج إنزيمات عالية القيمة ومركبات نشطة بيولوجيا ومستقلبات ثانوية. تتضمن هذه التقنية نمو الكائنات الحية الدقيقة على ركائز صلبة مع الحد الأدنى من الماء الحر ، ومحاكاة بيئتها الطبيعية وتمكين النشاط الأيضي الفعال¹. الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو تحسين إنتاج الإنزيم من خلال نظام SSF دوار يضمن الاستخدام المحسن للركيزة وانتشار الأكسجين وقابلية توسع العملية. يساهم استخدام نخالة القمح ، وهي منتج ثانوي زراعي صناعي وفير ، كركيزة أساسية ، في تثمين المخلفات الزراعية ويعزز ممارسات الاقتصاد الحيوي^{الدائري 2}.

يتمتع SSF بمزايا كبيرة مقارنة بالتخمير المغمور (SmF) ، بما في ذلك انخفاض استهلاك الطاقة والمياه ، وتركيز المنتج العالي ، والتوافق مع مجموعة واسعة من المخلفات الزراعية الرخيصة مثل نخالة القمح وقشور الأرز وتتل قصب^{السكر 3}. على عكس SmF ، الذي يتطلب كميات كبيرة من الماء ووسائط المغذيات باهظة الثمن ، تستفيد أنظمة SSF من المصفوفات الصلبة التي لا تعمل فقط كأسطح نمو ميكروبية ولكنها توفر أيضا العناصر الغذائية الأساسية للنشاط الميكروبي. بالإضافة إلى ذلك ، تقلل المياه الحرة المحدودة في SSF من مخاطر التلوث ، مما يجعلها خيارا أكثر قوة لإنتاج الإنزيم في البيئات الصناعية⁴. بالإضافة إلى مزاياها التشغيلية ، تقدم SSF فوائد بيئية واقتصادية كبيرة مقارنة بالتخمير المغمور (SmF). أفادت الدراسات أن SSF يقلل من استهلاك المياه بنسبة 50٪ -70٪ ويخفض تكاليف الطاقة بأكثر من 30٪ بسبب عدم وجود كميات كبيرة من المياه تتطلب تحريكا وتهوية مستمرة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام المخلفات الصناعية الزراعية كركائز يقلل من تكاليف المواد الخام ويعزز ممارسات الاقتصاد الدائري عن طريق إعادة استخدام المنتجات الثانوية^{الزراعية 2،4}.

تم التحقق من صحة SSF على نطاق واسع لكفاءته وقابليته للتوسع. على سبيل المثال ، أبلغت الدراسات عن زيادة 4-6 أضعاف في نشاط الإنزيم باستخدام SSF مقارنة ب SmF ، مما يسلط الضوء على المزايا الاقتصادية والبيئية لهذه التقنية^2،5. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تبسيط عملية المصب ، حيث يتطلب استخراج الإنزيم عادة كمية أقل من الماء وخطوات تنقية أقل. هذا يجعل SSF جذابا بشكل خاص للصناعات التي تهدف إلى تقليل التكاليف التشغيلية والتأثير البيئي⁶.

يوفر نظام SSF الدوار الموضح في هذا البروتوكول العديد من التحسينات على طرق SSF الثابتة التقليدية. في حين أن الأنظمة الثابتة غالبا ما تواجه تحديات مثل استعمار الركيزة غير المتكافئ والحد من الأكسجين ، فإن التكوين الدوار يضمن الخلط والتهوية الشاملين ، مما يعزز النمو الميكروبي^{المنتظم 7،8،9}. على سبيل المثال ، تم استخدام هذا النظام بنجاح لإنتاج إنزيمات تحلل مائي مثل الكيتيناز والأميليز والبروتياز باستخدام أنواع فطرية مثل الرشاشيات والترايكوديرما².

الميزة الرئيسية لنظام SSF هذا هي قدرته على التكيف. يوضح استخدام نخالة القمح كركيزة أساسية إمكانات المخلفات الصناعية الزراعية للتحويل الأحيائي الفعال من^{حيث التكلفة 3}. علاوة على ذلك ، فإن مكملات الركيزة بمحفزات مثل الكيتين والشيتوزان والنشا تعزز تخليق الإنزيم عن طريق تحفيز مسارات التمثيل الغذائي المحددة^2،10. النظام متوافق أيضا مع أشكال فطرية مختلفة ، بما في ذلك الجراثيم والفطريات والكريات ، مما يسمح للمستخدمين بتخصيص العملية وفقا لمتطلباتهم المحددة².

يوفر SSF إمكانات واسعة للتطبيق في مختلف المجالات مثل التكنولوجيا الحيوية للأغذية وإنتاج الوقود الحيوي والمعالجة^{البيئية 11}. إن تكاملها بين الركائز الفعالة من حيث التكلفة ، وعوائد الإنزيم الاستثنائية ، والمرونة العالية في العملية يؤسس SSF كنهج أساسي لابتكارات التكنولوجيا الحيوية على نطاق صناعي.

Protocol

الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. إعداد الركيزة

ملاحظة: استخدم علامة تجارية لنخالة القمح لتقليل الاختلافات الكبيرة في خصائص الركيزة. تختلف كل دفعة من نخالة القمح بسبب عوامل متعددة ، مما يجعلها مادة غير متجانسة يصعب توحيدها ، مما يؤدي إلى تقلبات في محتواها المكون. إذا كانت هناك حاجة إلى مادة قياسية ، فاختر مصفوفة بديلة أو قم بإجراء تحليل كيميائي قريب لكل دفعة من نخالة القمح لتعديلها وفقا للاحتياجات.

1. اغسل نخالة القمح ثلاث مرات بالماء المقطر المعقم لإزالة بقايا المواد العضوية والحطام والغبار. هذا يزيل أيضا السكريات البسيطة التي يمكن أن تتداخل مع التخمير.
2. وزعي النخالة المغسولة على صينية من الألومنيوم وجففيها في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
3. بمجرد أن تجف ، ضع نخالة القمح في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل.

2. تحضير اللقاح

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول ثلاث طرق لتحضير اللقاح: تعليق البوغ ، والتلقيح المباشر بأقراص الفطريات ، والتعليق الخلوي. حدد تركيز اللقاح الأولي وحدد مستويات البروتين لحسابات العائد بدقة.

1. تحضير تعليق الأبواغ
   1. انقل قرص أجار بقطر 5 مم مشبع بالفطريات إلى طبق أجار بطاطس طازجة من سكر العنب. احتضن اللوحة عند 28 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام ، أو حتى تشبع الفطريات الوسط. قد تتطلب بعض الفطريات وقتا أطول للحضانة.
   2. أضف 5 مل من الماء المقطر المعقم إلى الطبق وافصل الجراثيم ميكانيكيا باستخدام حلقة معقمة.
   3. قم بإعداد تخفيف 1:100 لتعليق البوغ. ضع 10 ميكرولتر في وسط حجرة نيوباور وعد الجراثيم تحت المجهر. احسب تركيز الأبواغ (الجراثيم / مل) بناء على عامل الغرفة والتخفيف.
2. زراعة الفطريات في وسط سائل
   1. انقل قرص أجار 5 مم مشبع بالفطريات إلى طبق بطاطس طازج وسكر العنب وأجار واحتضنه عند 28 درجة مئوية حتى التشبع.
   2. تحضير 25 مل من مرق البطاطس وسكر العنب في قارورة معقمة سعة 125 مل وأوتوكلاف.
   3. انقل قرص الفطريات مقاس 5 مم من الصفيحة المشبعة إلى المرق المعقم.
   4. احتضن القارورة على شاكر عند 125 دورة في الدقيقة لمدة 24-48 ساعة ، اعتمادا على السلالة الفطرية. تمديد وقت الحضانة للفطريات بطيئة النمو.
   5. اجمع 2 مل لللقاح و 2 مل لتحديد الوزن الجاف.
3. التلقيح المباشر لأقراص الفطريات
   1. ضع قرص أجار مقاس 5 مم مشبع بالفطريات على طبق بطاطس طازجة وسكر العنب وأجار. احتضن عند 28 درجة مئوية حتى التشبع.
   2. استخدم قرصا فطريا واحدا كلقاح وآخر لتحديد الوزن الجاف.

3. إعداد نظام SSF

ملاحظة: يمكن أن تكون المحفزات طبيعية أو تجارية. يفضل المحفزات التجارية المنقاة لتقليل الشوائب التي يمكن أن تغير كفاءة التخمير. اضبط إضافات المياه للحفاظ على رطوبة نسبية لا تقل عن 90٪.

1. اجمع المكونات التالية في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل: 5 جم من نخالة القمح الجاف ؛ 0.2 غرام من المحفز (على سبيل المثال ، الكيتين التجاري) ؛ 5.5 مل من الماء (اضبط بناء على قدرة امتصاص الماء للمحفز) ؛ 5 مل من محلول ملح معقم يحتوي على 16 جم / لتر فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة ، 4 جم / لتر كبريتات الصوديوم ، 2 جم / لتر كلوريد البوتاسيوم ، 1 جم / لتر كلوريد الكالسيوم ، 400 مجم / لتر كلوريد الزنك ، 60 مجم / لتر حمض البوريك ، 40 مجم / لتر موليبدات الصوديوم ، 150 مجم / لتر كلوريد المغنيسيوم ، 100 مجم / لتر كلوريد الحديديك ، و 400 مجم / لتر كبريتات النحاس.
2. قم بقياس الرطوبة النسبية باستخدام مقياس رطوبة قائم على قطب كهربائي ، مما يضمن رطوبة لا تقل عن 90٪. أدخل مسبار القطب مباشرة في المفاعل على أعماق متفاوتة للحصول على قياس تمثيلي لتوزيع الرطوبة.
   1. اتبع الخطوات لضبط الرطوبة إذا كانت أقل من 90٪:
      1. أضف الماء المقطر المعقم تدريجيا بزيادات 1 مل لكل 10 جم من الركيزة. بعد كل إضافة ، اخلطي جيدا لضمان التوزيع المنتظم للرطوبة.
      2. اترك الركيزة تتوازن لمدة 10-15 دقيقة. أعد قياس مستوى الرطوبة.
      3. كرر الخطوات المذكورة أعلاه حتى يتم الوصول إلى الرطوبة المستهدفة البالغة 90٪. تجنب الإفراط في ترطيب الركيزة طوال العملية.
   2. اتبع الخطوات لضبط الرطوبة إذا كانت أعلى من 90٪:
      1. انشر الركيزة بشكل رقيق في بيئة معقمة. قم بإزالة الرطوبة الزائدة عن طريق (1) تعريض الركيزة لتدفق الهواء الرقائقي ، أو (2) وضعها في غرفة تجفيف عند 30 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة.
      2. بدلا من ذلك ، قم بخلط الركيزة برفق لتعزيز إعادة توزيع الرطوبة بشكل متساو. بعد العلاج ، أعد تقييم مستوى الرطوبة.
      3. كرر خطوة التجفيف أو الخلط حسب الحاجة حتى تصل الرطوبة إلى 90٪. استمر في التخمير فقط بمجرد تحقيق الرطوبة المستهدفة.
3. قم بتعقيم الأنبوب عند 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 15 دقيقة.
4. بعد التبريد ، قم بتلقيح الركيزة بواحد مما يلي: 1 مل من تعليق الأبواغ (1 × 10^6-1 × 10⁷ جراثيم / مل) ، 2 مل من التعليق الخلوي ، أو قرص فطريات واحد 5 مم.

4. إجراء تخمير الحالة الصلبة (SSF)

ملاحظة: للدراسات الحركية أو تقييمات المعلمات في أوقات مختلفة ، قم بإعداد أنابيب منفصلة لكل نقطة زمنية لضمان التمثيل.

1. تجنب تكتل الركيزة عن طريق دوامة الأنابيب بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق في دورات مدتها دقيقة واحدة.
2. ضع الأنابيب في خلاط دوار بمحور أفقي. تأكد من أن الركيزة تتحرك بحرية داخل الأنابيب. اضبط الخلاط على العمل عند 10 دورات في الدقيقة.
3. احتضان الخلاط في حاضنة عند درجة حرارة النمو المثلى للكائن الحي الدقيق. الحفاظ على درجة الحرارة المبلغ عنها للحصول على النشاط الأنزيمي الأمثل عند استخدام المحفزات الحساسة للحرارة.

5. استخراج الإنزيمات

ملاحظة: تعتمد أساسيات الاستخراج على الذوبان والنشاط الأقصى لدرجة الحموضة للإنزيم خارج الخلية. نظرا لأن SSF يتجنب وسط الماء ، فإن الإنزيم خارج الخلية يشارك في الماء المحيط بالمصفوفة الصلبة ، مما يعني أن التركيز أعلى منه في SmF. في هذا السياق ، يعتمد اختيار أفضل مخزن مؤقت للاستخراج على معرفة النشاط المطلوب. يعتمد تحسين عمليات الاستخراج على تركيز الإنزيم النهائي ونوع المخزن المؤقت للاستخراج المستخدم.

1. بعد فترة التخمير المرغوبة ، أعد تعليق الركيزة في 20 مل من المخزن المؤقت المبرد مسبقا. تشمل الأمثلة: 0.1 M أسيتات عازلة ، درجة الحموضة 5.6 ، لاستخراج الكيتيناز. 0.02 M مخزن الفوسفات ، درجة الحموضة 6.9 ، لاستخراج الأميليز.
2. دوامة الأنابيب في دورات: 1 دقيقة بأقصى سرعة ، تليها دقيقة واحدة على الجليد. كرر 10 مرات.
3. قم بتصفية المعلق باستخدام المرشحات الورقية واستخرج المادة الطافية ميكانيكيا عن طريق الضغط.
4. قم بتوضيح المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
5. استخدم المستخلص الخام مباشرة أو قم بتنقية الإنزيم بشكل أكبر عن طريق كروماتوغرافيا العمود أو مرشحات الطرد المركزي. يوصى أيضا بالدراسات الحركية لتحديد ثابت ميكايليس (Km) والحد الأقصى لمعدل التحول الأنزيمي (Vmax) ¹².

6. عملية التحسين

ملاحظة: قم بتحسين هذا البروتوكول من خلال تقييم وتعديل جودة وتركيز المحفزات ، بالإضافة إلى نوع وتركيز اللقاح.

1. تحديد وقت التخمير المثالي وتحسين خطوات الاستخراج لتحسين الكفاءة.
2. التحكم في الظروف البيئية وضبطها ، بما في ذلك درجة الحرارة ودرجة الحموضة والتهوية.
3. اختبر المخازن المؤقتة وظروف الاستخراج المختلفة لتعزيز إنتاجية الإنزيم واستقراره.
4. إجراء التحليلات الإحصائية ، مثل منهجية سطح الاستجابة ، لتحديد المتغيرات الأكثر تأثيرا وتحقيق الإنتاج الأمثل للإنزيم.

النتائج

يعرض الشكل 1 أ التمثيل التخطيطي للخلاط الدوار المستخدم في هذا النظام ، والذي يتسع لستة أنابيب مخروطية سعة 50 مل. يوضح الشكل 2 ب التغييرات التي تحدث في نخالة القمح أثناء التكييف قبل الدخول في عملية التخمير في الحالة الصلبة. كما رأينا ، لم يلاحظ أي تغييرات هيكلية كبيرة.

يوضح الشكل 2 تشبع نخالة القمح بعد 6 أيام من التخمير في الحالة الصلبة لإنتاج الكيتيناز بواسطة فطر Trichoderma harzianum في هذا النظام ، باستخدام الكيتين التجاري كمحفز. يوضح الشكل 2 أ المادة الأصلية قبل عملية التخمير. تؤكد الصور المجهرية استخدام الفطريات للركيزة ، وهو ما ينعكس أيضا في التعديلات التي تخضع لها ، حيث تفقد هيكلها الشبيه بالفركتل بسبب التفاعل مع الفطريات.

تظهر النتائج الواردة في الشكل 3 زيادة كبيرة في نشاط الكيتيناز (الشكل 3 أ) ونشاط الأميليز (الشكل 3 ب) الذي تم الحصول عليه من T. harzianum و Aspergillus lentulus ، على التوالي ، عند مقارنة أنظمة تخمير الحالة الصلبة (SSF) والتخمير المغمور (SmF). تم التحقق من صحة البيانات عن طريق ANOVA أحادي الاتجاه واختبار Tukey مع p < 0.05 باستخدام برنامج SigmaPlot. في هذا السياق ، لوحظ أن هذا النظام قابل للتطبيق على الأنشطة الأنزيمية والفطريات المختلفة. A. lentulus تم وصفه بأنه فطر مقاوم للحرارة ، يتم تحضنه عند 40 درجة مئوية ، مما يدل على زيادة كبيرة في نشاط الأميليز. نتائج نشاط الكيتيناز من T. harzianum في كل من التخمير السائل والصلب تم الإبلاغ عنها مسبقا بشكل منفصل من قبل مجموعتنا البحثية^2،5 ، مع تأكيد هذا العمل ومقارنة زيادة كبيرة في SSF مقارنة ب SmF ، على غرار نشاط الأميليز. عملت مجموعتنا مع أكثر من 50 سلالة فطرية لإنتاج البروتياز والأميليز في ظل ظروف الميزوفيليك والحرارة ، وكانت النتائج متسقة.

تؤكد النتائج نجاح البروتوكول من خلال إظهار زيادات كبيرة في نشاط الإنزيم ، حيث ينتج عن تخمير الحالة الصلبة مخرجات أعلى مقارنة بالتخمير المغمور. يشير هذا إلى فعالية SSF في تعزيز إنتاج كل من الكيتيناز والأميليز. تمت إعادة استخدام الأرقام المنشورة سابقا مع إذن إعادة الطباعة المناسب.

الشكل 1: نظرة عامة على نظام التخمير الدوار للحالة الصلبة (SSF) وعملية المعالجة المسبقة لنخالة القمح. (أ) التمثيل التخطيطي لنظام SSF الدوار. (ب) التعديلات في عملية المعالجة المسبقة لنخالة القمح: (I) المواد الخام الأولية ، (II) نخالة القمح الرطبة بعد خطوة الغسيل ، (III) نخالة القمح المجففة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تشبع الركيزة بواسطة Trichoderma harzianum. (أ) الركيزة قبل SSF. (ب ، ج) الركيزة المشبعة بالفطريات الفطرية بتكبيرات مختلفة. أشرطة المقياس: (أ) ، 50 ميكرومتر ؛ (ب)، 200 ميكرومتر؛ (C)، 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: النشاط الأنزيمي في SSF والتخمير المغمور (SmF) بواسطة T. harzianum و A. lentulus. مقارنة بين (أ) تكوين الجلوكوزامين من خلال التحلل المائي للكيتوزان بواسطة الإنزيمات التي تنتجها Trichoderma harzianum في SSF و SmF ، و (ب) نشاط الأميليز ل Aspergillus lentulus الذي تم الحصول عليه في SSF و SmF. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري لثلاثة مكررات. تشير العلامات النجمية (*) إلى اختلاف ذي دلالة إحصائية بين البيانات. لاحظ أن التباين الإحصائي خاص بكل نوع من أنواع الإنزيمات ولا ينطبق على المقارنات بين (أ) و (ب). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

تحدد هذه الدراسة بروتوكولا ذا صلة لتحسين إنتاج الإنزيم من خلال أنظمة تخمير الحالة الصلبة (SSF) ، المصممة خصيصا للفطريات الخيطية. أدناه ، تتم مناقشة الجوانب الحاسمة للمنهجية ، إلى جانب أهميتها وقيودها وتطبيقاتها المحتملة.

يعتمد نجاح البروتوكول بشكل كبير على الخطوات الرئيسية مثل تحضير الركيزة واللقاح. يعد الغسيل والتجفيف المناسبان لنخالة القمح ضروريين للتخلص من الشوائب التي قد تتداخل مع نمو الفطريات أو إنتاج الإنزيم. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الضبط الدقيق لرطوبة الركيزة للحفاظ على الرطوبة النسبية أعلى من 90٪ يضمن الاستعمار والنشاط الفطري الأمثل¹³. يعد تشغيل النظام الدوار عند 10 دورات في الدقيقة معلمة حاسمة أخرى ، لأنه يعزز الخلط والأكسجين المتساوي ، ويمنع تكتل الركيزة ويضمن نموا فطريا^{موحدا 14}.

تكمن قدرة هذا البروتوكول على التكيف في توافقه مع الأنواع الفطرية والمحفزات المتنوعة. على سبيل المثال ، بينما تم استخدام الكيتين والنشا التجاري كمحفزات في هذه الدراسة ، يمكن استبدال ركائز أخرى ، مثل اللجنين أو السليلوز أو الشيتوزان ، اعتمادا على الإنزيم المستهدف. تتضمن استكشاف الأخطاء وإصلاحها الشائعة ، مثل استعمار الركيزة غير المتكافئ ، تحسين معلمات الخلط أو ضبط تركيز اللقاح². علاوة على ذلك ، يعد ضمان العقم أثناء تحضير الركيزة والتلقيح أمرا بالغ الأهمية لمنع التلوث ، خاصة في التطبيقات على نطاق^{صناعي 15}.

بينما يوفر SSF العديد من المزايا مقارنة بالتخمير المغمور (SmF) ، إلا أنه لا يخلو من القيود¹⁶. يتمثل أحد التحديات الرئيسية في توسيع نطاق نظام SSF الدوار دون المساس بخلط الركيزة أو انتشار الأكسجين أو التحديد الدقيق للكتلة الحيوية ، وهي مشكلة شائعة أخرى في SSF^17،18. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي اعتماد البروتوكول على المخلفات الصناعية الزراعية مثل نخالة القمح إلى تباين في النتائج بسبب الاختلافات في تكوين الركيزة عبر الدفعات. تسلط هذه القيود الضوء على الحاجة إلى مزيد من التحسين عند الانتقال إلى الإنتاج على نطاق واسع ^19,20.

يوضح نظام SSF الدوار الموصوف مزايا كبيرة مقارنة بطرق SSF و SmF الثابتة التقليدية. بالمقارنة مع SSF الثابت ، يضمن النظام الدوار نموا ميكروبيا أكثر اتساقا ، مما يقلل من المشكلات المتعلقة بقيود الأكسجين. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح قدرة النظام على التكيف بتطبيقه على مختلف الأشكال الفطرية وأنواع الإنزيمات ، مما يجعله متعدد الاستخدامات¹⁸. يمكن أن تحتوي أنظمة SSF على تكوينات مختلفة لتعزيز إنتاجية المستقلب. كل نوع من أنواع الأنظمة له مزايا وعيوب يجب تحليلها بعمق لتحديد أفضل تكوين. يوفر نظام SSF الدوار العديد من المزايا مقارنة ب SSF و SmF الثابت التقليدي. ومع ذلك ، فإنه يواجه تحديات عند مقارنته بأنظمة SSF الأخرى ، مثل المفاعلات الحيوية ذات الطبقات الحيوية المعبأة. توفر المفاعلات الحيوية ذات الصواني، التي يشيع استخدامها في SSF على نطاق واسع، البساطة واستهلاكا منخفضا للطاقة ولكنها تواجه تحديات تتعلق بنقل الأكسجين المحدود وتوزيع الرطوبة، مما يؤدي إلى نمو ميكروبي غير متكافئ وانخفاض غلة الإنزيم. من ناحية أخرى ، تعمل المفاعلات الحيوية ذات الطبقة المعبأة على تحسين التهوية من خلال تدفق الهواء القسري ولكنها قد تواجه مشكلات في انخفاض الضغط والتوزيع غير المتكافئ لدرجة الحرارة ، خاصة في الأعمدة الطويلة. في المقابل ، يعزز نظام SSF الدوار الخلط المستمر والظروف المتجانسة ، مما يقلل من المناطق اللاهوائية ويعزز إنتاجية الإنزيم. ومع ذلك ، فإن استهلاك الطاقة والتآكل الميكانيكي بسبب الدوران المستمر قد يزيد من تكاليف التشغيل²¹.

أنظمة التخمير الثابتة ذات الحالة الصلبة ، مثل المفاعلات الحيوية ذات الصينية ، مقيدة بنقل محدود للحرارة والكتلة ، مما يؤدي غالبا إلى تدرجات درجة حرارة داخلية تزيد عن 30 درجة مئوية ، مما يؤدي إلى أداء ميكروبي دون المستوى الأمثل. تعمل هذه الأنظمة عادة بأحجام صغيرة (0.15-0.25 متر مكعب) وتعاني من استعمار ميكروبي غير متجانس ، حيث تشير الدراسات إلى أن حوالي 34٪ فقط من مسام الركيزة تستخدم بشكل فعال. في المقابل ، توفر المفاعلات الحيوية الدوارة تحريكا ميكانيكيا يعزز توزيع الأكسجين وتجانس الركيزة ، مع دعم أحجام تشغيلية أكبر تصل إلى 13 مترا مكعبا وأحمال الركيزة التي تصل إلى 40٪ (وزن / حجم). ومن الأمثلة البارزة على ذلك إنتاج السليلوز بواسطة Thermoascus aurantiacus ، حيث تم الحفاظ على مفاعل SSF دوار عند 49 درجة مئوية ويتم تهويته عند 5 لتر / دقيقة · كجم ينتج 14،098 وحدة دولية / غرام من نشاط الإنزيم - أكثر بثلاث مرات من 4،212 وحدة دولية / غرام التي تم الحصول عليها في ظل ظروف^{ثابتة 22}.

يتطلب توسيع نطاق تخمير الحالة الصلبة توازنا دقيقا بين الحفاظ على الحركية الميكروبية وضمان نقل الكتلة والحرارة بشكل فعال في الأنظمة الأكبر تدريجيا. يشمل النهج التدريجي التقليدي مراحل المختبر (5-20 كجم) ، والتجريبي (50-5,000 كجم) ، والصناعية (25-1,000 طن). يتمثل أحد التحديات الرئيسية أثناء التوسع في تبديد الحرارة الأيضية ، والتي يمكن أن تصل إلى 3,200 كيلو كالوري / كجم من المواد الجافة ، وهو ما يمثل مشكلة خاصة في الأنظمة الثابتة أو سيئة التهوية. لمعالجة هذا الأمر ، غالبا ما تعتمد استراتيجيات التوسع على التحكم في معلمات التصميم عديمة الأبعاد وتطبيق مناهج النمذجة الرياضية ، بما في ذلك معادلات توازن الكتلة والطاقة ، للحفاظ على المتغيرات الرئيسية مثل توافر الأكسجين والاحتفاظ برطوبة الركيزة عبر مقاييس مختلفة. نجحت الأنظمة التجريبية (على سبيل المثال ، 150 لترا و 6 متر مكعب) في دمج ميزات هندسية مثل السترات المائية ، وشفرات التحريك المنحنية ، والرطوبة المتحكم فيها لتحسين قابلية تكرار العملية وضمان إنتاجية متسقة^{للمنتج 18،21،22}.

أظهر البروتوكول فعالية لإنتاج الإنزيم على نطاق مختبري صغير. ومع ذلك ، فإن توسيع نطاق العملية للتطبيقات الصناعية يطرح تحديات كبيرة ، تتعلق في المقام الأول بالحفاظ على كفاءة الخلط والتهوية بكميات أكبر. أحد الأساليب الواعدة لمعالجة هذه القيود هو استخدام مفاعل لولبي مستمر ، والذي يحاكي وظيفة الخلاط الرأسي من خلال تعزيز الخلط المستمر وتحسين الأكسجين في جميع أنحاء الركيزة الصلبة. يقلل هذا التصميم من تكوين المناطق اللاهوائية ويعزز نقل الكتلة ، وهي عوامل حاسمة لنجاح تخمير الحالة الصلبة على نطاق صناعي^2،15. ومع ذلك ، تشمل التحديات المحتملة الحفاظ على السلامة الهيكلية للمصفوفة الصلبة ومنع تكوين تدرجات درجة الحرارة على طول المفاعل. يجب أن تركز الدراسات الإضافية على تحسين المعلمات التشغيلية والتحقق من صحة إنتاجية الإنزيم في ظل ظروف موسعة لضمان جدوى العملية وكفاءتها.

تمتد التطبيقات المحتملة لهذا البروتوكول إلى قطاعات متعددة ، بما في ذلك التكنولوجيا الحيوية الغذائية والطاقة الحيوية والمعالجة البيئية. على سبيل المثال ، يمكن أن يدعم الإنتاج المعزز للإنزيمات المحللة المائية مثل الكيتيناز والأميليز عمليات التحويل الحيوي في الزراعة والصناعة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام المنتجات الثانوية الصناعية الزراعية مثل نخالة القمح يتماشى مع الممارسات المستدامة ، مما يعزز تثمين النفايات ويساهم في الاقتصاد الحيوي^{الدائري 20}.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL Erlenmeyer flask	Sigma-Aldrich	CLS431684	For culturing mycelium in liquid medium.
50 mL conical tube	Sigma-Aldrich	CLS430921	For storing and preparing substrates and inoculum.
Acetate buffer, pH 5.6	Sigma-Aldrich	320866	For chitinase extraction.
Centricon filters	Millipore	UFC905024	For further purification of enzymes.
Counting cells chamber	Sigma-Aldrich	Z359629	Used to count spores under a microscope.
Filter paper	Whatman	1001-110	For filtering the enzyme extract.
Hygrometer	Todomicro	-	To measure relative humidity of the substrate.
Inducer (e.g., commercial chitin)	Sigma-Aldrich	C9752	Used to enhance enzyme production during fermentation.
Phosphate buffer, pH 6.9	Sigma-Aldrich	P5379	For amylase extraction.
Potato-dextrose agar	Sigma-Aldrich	P2182	Culture medium for growing fungal mycelium.
Potato-dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685	Liquid culture medium for growing fungal mycelium.
Rotary mixer	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	To keep substrate moving during fermentation.
Salt solution components (e.g., KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Multiple	For preparing sterile salt solution, see detailed recipe in the protocol.
Wheat bran	Comercial market	-	Substrate for solid-state fermentation.