Projeto de Sistemas de Fermentação em Estado Sólido para Produção de Enzimas Extracelulares Hidrolíticas Poliméricas por Fungos Filamentosos

Resumo

Este protocolo utiliza farelo de trigo em um sistema rotativo de fermentação em estado sólido para aumentar a produção de enzimas. O substrato, complementado com indutores como a quitina, suporta o crescimento de fungos sob condições controladas. Os resultados demonstram rendimentos enzimáticos 4-6 vezes maiores em comparação com a fermentação submersa, mostrando a adaptabilidade e eficácia do método para diversas aplicações biotecnológicas.

Resumo

A fermentação em estado sólido (SSF) é um processo de bioconversão que utiliza um substrato sólido que não se dissolve em meio aquoso. Os microrganismos crescem na superfície do substrato e penetram em sua matriz sólida para extrair nutrientes essenciais para o seu desenvolvimento. A FES é caracterizada por um mínimo de água livre, com um teor de umidade do substrato mantido acima de 70%, e envolve três fases interconectadas - gasosa, líquida e sólida. Este protocolo descreve o uso do farelo de trigo, um subproduto agroindustrial, como substrato base para a produção de enzimas em um sistema rotativo. O substrato é suplementado com um indutor, como quitina, quitosana, amido ou celulose, para promover a síntese de proteínas hidrolíticas. O sistema é altamente adaptável, permitindo o uso de diferentes formas de fungos, incluindo micélio, esporos ou pellets. Na metodologia descrita, o indutor e o substrato são misturados na proporção de 1:100 (m/m), esterilizados em autoclavagem e ajustados ao nível de umidade desejado com água estéril. O inóculo fúngico é então adicionado e o sistema rotativo opera a 10 rpm para garantir mistura e oxigenação adequadas. O sistema é incubado por 6-8 dias em condições ideais de crescimento para fungos mesófilos ou termofílicos/termotolerantes, aumentando sua versatilidade. Após a incubação, a enzima é facilmente extraída usando um tampão frio apropriado (por exemplo, acetato, citrato ou fosfato), dependendo do tipo de enzima. O extrato é clarificado por centrifugação e filtração para obter um sobrenadante livre de células. A enzima pode então ser ainda mais concentrada ou purificada conforme necessário. Os resultados demonstraram um aumento de 4 a 6 vezes na atividade enzimática em comparação com a fermentação submersa (SmF), destacando a eficácia do sistema. Sua adaptabilidade a diferentes substratos, indutores e espécies de fungos o torna uma ferramenta valiosa para várias aplicações biotecnológicas.

Introdução

A fermentação em estado sólido (SSF) surgiu como uma tecnologia de bioconversão promissora e sustentável para a produção de enzimas de alto valor, compostos bioativos e metabólitos secundários. Essa técnica envolve o crescimento de microrganismos em substratos sólidos com o mínimo de água livre, simulando seu ambiente natural e permitindo uma atividade metabólica eficiente¹. O principal objetivo deste protocolo é otimizar a produção de enzimas por meio de um sistema SSF rotativo que garante maior utilização do substrato, difusão de oxigênio e escalabilidade do processo. O emprego do farelo de trigo, um subproduto agroindustrial abundante, como substrato base, contribui para a valorização dos resíduos agrícolas e promove práticas de bioeconomia circular².

O SSF tem vantagens significativas sobre a fermentação submersa (SmF), incluindo menor consumo de energia e água, maior concentração de produto e compatibilidade com uma ampla gama de resíduos agrícolas baratos, como farelo de trigo, casca de arroz e bagaço de cana-de-açúcar³. Ao contrário do SmF, que requer grandes volumes de água e meios nutritivos caros, os sistemas SSF utilizam matrizes sólidas que não apenas servem como superfícies de crescimento microbiano, mas também fornecem nutrientes essenciais para a atividade microbiana. Além disso, a água livre limitada em SSF minimiza os riscos de contaminação, tornando-a uma opção mais robusta para a produção de enzimas em ambientes industriais⁴. Além de suas vantagens operacionais, a FES apresenta benefícios ambientais e econômicos significativos em comparação com a fermentação submersa (SmF). Estudos relataram que o SSF reduz o consumo de água em 50% -70% e reduz os custos de energia em mais de 30% devido à ausência de grandes volumes de água que requerem agitação e aeração constantes. Além disso, o uso de resíduos agroindustriais como substratos minimiza os custos das matérias-primas e promove práticas de economia circular ao reaproveitar subprodutos agrícolas ^2,4.

O SSF foi amplamente validado por sua eficiência e escalabilidade. Por exemplo, estudos relataram um aumento de 4 a 6 vezes na atividade enzimática usando SSF em comparação com SmF, destacando as vantagens econômicas e ambientais dessa técnica ^2,5. Além disso, o processo a jusante é simplificado, pois a extração de enzimas normalmente requer menos água e menos etapas de purificação. Isso torna a pesca de pequeno e pequeno nível particularmente atraente para as indústrias que visam reduzir os custos operacionais e o impacto ambiental⁶.

O sistema SSF rotativo descrito neste protocolo oferece várias melhorias em relação aos métodos tradicionais de SSF estático. Embora os sistemas estáticos frequentemente enfrentem desafios como colonização irregular do substrato e limitação de oxigênio, a configuração rotativa garante mistura e aeração completas, promovendo o crescimento microbiano uniforme ^7,8,9. Por exemplo, este sistema tem sido empregado com sucesso para produzir enzimas hidrolíticas, como quitinases, amilases e proteases, usando espécies de fungos como Aspergillus e Trichoderma².

Uma característica fundamental deste sistema SSF é sua adaptabilidade. O uso do farelo de trigo como substrato base demonstra o potencial dos resíduos agroindustriais para bioconversão econômica³. Além disso, a suplementação do substrato com indutores como quitina, quitosana e amido aumenta ainda mais a síntese enzimática, estimulando vias metabólicas específicas ^2,10. O sistema também é compatível com diferentes formas de fungos, incluindo esporos, micélio e pellets, permitindo que os usuários adaptem o processo às suas necessidades específicas².

A pesca de pequena escala oferece um amplo potencial de aplicação em vários domínios, como a biotecnologia alimentar, a produção de biocombustíveis e a remediação ambiental¹¹. Sua integração de substratos econômicos, rendimentos excepcionais de enzimas e alta flexibilidade de processo estabelecem o SSF como uma abordagem essencial para inovações biotecnológicas em escala industrial.

Protocolo

Os reagentes e os equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação do substrato

NOTA: Use uma marca comercial de farelo de trigo para minimizar variações significativas nas características do substrato. Cada lote de farelo de trigo varia devido a vários fatores, tornando-o um material heterogêneo e difícil de padronizar, levando a flutuações em seu conteúdo constituinte. Se for necessário um material padronizado, escolha uma matriz alternativa ou faça uma análise química centesimal de cada lote de farelo de trigo para ajustá-lo de acordo com as necessidades.

1. Lave o farelo de trigo três vezes com água destilada estéril para remover resíduos de matéria orgânica, detritos e poeira. Isso também remove açúcares simples que podem interferir na fermentação.
2. Espalhe o farelo lavado em uma bandeja de alumínio e seque-o em um forno a 60 °C por 24 h.
3. Depois de seco, coloque o farelo de trigo em um tubo cônico estéril de 50 mL.

2. Preparação do inóculo

NOTA: Este protocolo descreve três métodos para preparação de inóculo: suspensão de esporos, inoculação direta com discos de micélio e suspensão celular. Estabeleça a concentração inicial de inóculo e quantifique os níveis de proteína para cálculos precisos de rendimento.

1. Preparação da suspensão de esporos
   1. Transferir um disco de ágar-ágar de 5 mm de diâmetro, saturado com micélio, para uma placa de ágar-ágar dextrose de batata fresca. Incubar a placa a 28 °C durante 5-7 dias ou até que o micélio sature o meio. Alguns fungos podem exigir um tempo de incubação mais longo.
   2. Adicione 5 mL de água destilada estéril à placa e retire mecanicamente os esporos usando uma alça estéril.
   3. Prepare uma diluição de 1:100 da suspensão de esporos. Coloque 10 μL no centro de uma câmara de Neubauer e conte os esporos ao microscópio. Calcule a concentração de esporos (esporos/mL) com base no fator e na diluição da câmara.
2. Cultivo de micélio em meio líquido
   1. Transferir um disco de ágar-ágar 5 mm saturado com micélio para uma placa de batata-dextrose-ágar fresca e incubar a 28 °C até à saturação.
   2. Prepare 25 mL de caldo de batata-dextrose em um frasco estéril de 125 mL e autoclave.
   3. Transferir um disco de micélio de 5 mm da placa saturada para o caldo estéril.
   4. Incubar o balão num shaker a 125 rpm durante 24-48 h, dependendo da estirpe do fungo. Estenda o tempo de incubação para fungos de crescimento lento.
   5. Colete 2 mL para o inóculo e 2 mL para determinação do peso seco.
3. Inoculação direta de discos de micélio
   1. Colocar um disco de ágar-ágar de 5 mm saturado com micélio numa placa de batata-dextrose-ágar fresca. Incubar a 28 °C até à saturação.
   2. Use um disco de micélio como inóculo e outro para determinar o peso seco.

3. Preparação do sistema de pesca de pequena escala

NOTA: Os indutores podem ser naturais ou comerciais. Os indutores comerciais purificados são preferidos para minimizar as impurezas que podem alterar a eficiência da fermentação. Ajuste as adições de água para manter uma umidade relativa de pelo menos 90%.

1. Combine os seguintes componentes em um tubo cônico estéril de 50 mL: 5 g de farelo de trigo seco; 0,2 g do indutor (por exemplo, quitina comercial); 5,5 mL de água (ajuste com base na capacidade de absorção de água do indutor); 5 ml de uma solução salina estéril contendo 16 g/L de fosfato de potássio monobásico, 4 g/L de sulfato de sódio, 2 g/L de cloreto de potássio, 1 g/L de cloreto de cálcio, 400 mg/L de cloreto de zinco, 60 mg/L de ácido bórico, 40 mg/L de molibdato de sódio, 150 mg/L de cloreto de magnésio, 100 mg/L de cloreto férrico e 400 mg/L de sulfato de cobre.
2. Meça a umidade relativa usando um higrômetro baseado em eletrodo, garantindo um mínimo de 90% de umidade. Insira a sonda do eletrodo diretamente no reator em profundidades variadas para obter uma medição representativa da distribuição de umidade.
   1. Siga as etapas para ajustar a umidade se estiver abaixo de 90%:
      1. Adicione gradualmente água destilada estéril em incrementos de 1 mL por 10 g de substrato. Após cada adição, misture bem para garantir uma distribuição uniforme da umidade.
      2. Deixe o substrato se equilibrar por 10-15 min. Meça novamente o nível de umidade.
      3. Repita as etapas acima até que a umidade desejada de 90% seja atingida. Evite molhar demais o substrato durante todo o processo.
   2. Siga as etapas para ajustar a umidade se estiver acima de 90%:
      1. Espalhe o substrato em uma camada fina em um ambiente estéril. Remova o excesso de umidade (1) expondo o substrato ao fluxo de ar laminar ou (2) colocando-o em uma câmara de secagem a 30 ° C por 10-15 min.
      2. Como alternativa, misture suavemente o substrato para promover uma redistribuição uniforme da umidade. Após o tratamento, reavalie o nível de umidade.
      3. Repita a etapa de secagem ou mistura conforme necessário até que a umidade atinja 90%. Prossiga com a fermentação somente quando a umidade desejada for atingida.
3. Autoclave o tubo a 15 psi por 15 min.
4. Após o resfriamento, inocule o substrato com um dos seguintes: 1 mL de suspensão de esporos (1 x 10^6-1 x 10⁷ esporos / mL), 2 mL de suspensão celular ou um disco de micélio de 5 mm.

4. Procedimento de fermentação no estado sólido (SSF)

NOTA: Para estudos cinéticos ou avaliações de parâmetros em momentos diferentes, prepare tubos separados para cada ponto de tempo para garantir a representatividade.

1. Evite a aglomeração do substrato vortando os tubos na velocidade máxima por 5 min em ciclos de 1 min.
2. Coloque os tubos em um misturador rotativo com eixo horizontal. Certifique-se de que o substrato se move livremente dentro dos tubos. Defina o mixer para operar a 10 rpm.
3. Incube o misturador em uma incubadora na temperatura ideal de crescimento do microrganismo. Mantenha a temperatura indicada para uma atividade enzimática ideal ao usar indutores sensíveis ao calor.

5. Extração de enzimas

NOTA: Os fundamentos da extração são baseados na solubilidade e na atividade de pH máximo da enzima extracelular. Como a FES evita o meio aquoso, a enzima extracelular está envolvida na água ao redor da matriz sólida, o que significa que a concentração é maior do que na SmF. Nesse contexto, a seleção do melhor tampão de extração depende do conhecimento da atividade desejada. A otimização das extrações depende da concentração final da enzima e do tipo de tampão de extração utilizado.

1. Após o período de fermentação desejado, ressuspender o substrato em 20 mL de tampão pré-resfriado. Os exemplos incluem: tampão acetato 0,1 M, pH 5,6, para extração de quitinase; Tampão fosfato 0,02 M, pH 6,9, para extração de amilase.
2. Vortex os tubos em ciclos: 1 min na velocidade máxima, seguido de 1 min no gelo. Repita 10 vezes.
3. Filtrar a suspensão com filtros de papel e extrair mecanicamente o sobrenadante por prensagem.
4. Clarificar o sobrenadante centrifugando a 3000 x g durante 15 min a 4 °C.
5. Utilizar o extracto bruto directamente ou purificar ainda mais a enzima através de cromatografia em coluna ou filtros centrífugos. Estudos cinéticos também são recomendados para determinar a constante de Michaelis (Km) e a taxa máxima de transformação enzimática (Vmax)¹².

6. Processo de otimização

NOTA: Otimize este protocolo avaliando e ajustando a qualidade e a concentração dos indutores, bem como o tipo e a concentração do inóculo.

1. Determine o tempo ideal de fermentação e refine as etapas de extração para melhorar a eficiência.
2. Controle e ajuste as condições ambientais, incluindo temperatura, pH e aeração.
3. Teste vários tampões e condições de extração para aumentar o rendimento e a estabilidade da enzima.
4. Realize análises estatísticas, como metodologia de superfície de resposta, para identificar as variáveis mais influentes e alcançar a produção ideal de enzimas.

Resultados

A Figura 1A apresenta a representação esquemática do misturador rotativo utilizado neste sistema, que tem capacidade para seis tubos cônicos de 50 mL. A Figura 2B ilustra as mudanças que ocorrem no farelo de trigo durante o condicionamento antes de entrar no processo de fermentação em estado sólido. Como visto, não foram observadas alterações estruturais significativas.

A Figura 2 mostra a saturação do farelo de trigo após 6 dias de fermentação em estado sólido para produção de quitinase pelo fungo Trichoderma harzianum neste sistema, utilizando quitina comercial como indutor. A Figura 2A mostra o material original antes do processo de fermentação. As micrografias confirmam a utilização do substrato pelo fungo, o que também se reflete nas modificações que sofre, perdendo sua estrutura fractal devido à interação com o fungo.

Os resultados da Figura 3 mostram um aumento significativo na atividade da quitinase (Figura 3A) e da atividade da amilase (Figura 3B) obtidas de T. harzianum e Aspergillus lentulus, respectivamente, quando comparados os sistemas de fermentação em estado sólido (SSF) e fermentação submersa (SmF). Os dados foram validados por ANOVA one-way e teste de Tukey com p < 0,05 usando o software SigmaPlot. Nesse contexto, observa-se que esse sistema é aplicável a diferentes atividades enzimáticas e fungos. A. lentulus foi caracterizado como um fungo termotolerante, incubado a 40 °C, apresentando um aumento significativo em sua atividade amilase. Os resultados da atividade da quitinase de T. harzianum em fermentação líquida e sólida foram previamente relatados separadamente por nosso grupo de pesquisa ^2,5, com este trabalho confirmando e comparando um aumento significativo na FES em comparação com a SmF, semelhante à atividade da amilase. Nosso grupo trabalhou com mais de 50 cepas de fungos para a produção de proteases e amilases em condições mesófilas e termofílicas, e os resultados são consistentes.

Os resultados confirmam o sucesso do protocolo, demonstrando aumentos significativos na atividade enzimática, com a fermentação em estado sólido produzindo maiores resultados em comparação com a fermentação submersa. Isso indica a eficácia do SSF no aumento da produção de quitinase e amilase. As figuras publicadas anteriormente foram reutilizadas com a devida permissão de reimpressão.

Figura 1: Visão geral do sistema rotativo de fermentação em estado sólido (SSF) e do processo de pré-tratamento do farelo de trigo. (A) Representação esquemática do sistema rotativo SSF. (B) Modificações no processo de pré-tratamento do farelo de trigo: (I) Matéria-prima inicial, (II) Farelo de trigo úmido após a etapa de lavagem, (III) Farelo de trigo seco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Saturação do substrato por Trichoderma harzianum. (A) Substrato antes do SSF. (B, C) Substrato saturado com micélio fúngico em diferentes ampliações. Barras de escala: (A), 50 μm; (B), 200 μm; (C), 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Atividade enzimática em SSF e fermentação submersa (SmF) por T. harzianum e A. lentulus. Comparação de (A) formação de glucosamina através da hidrólise de quitosana por enzimas produzidas por Trichoderma harzianum em SSF e SmF, e (B) atividade de amilase de Aspergillus lentulus obtida em SSF e SmF. As barras de erro representam o desvio padrão de três repetições. Asteriscos (*) indicam uma diferença estatisticamente significativa entre os dados. Observe que a variação estatística é específica para cada tipo de enzima e não se aplica a comparações entre (A) e (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Este estudo descreve um protocolo relevante para otimizar a produção de enzimas por meio de sistemas de fermentação em estado sólido (SSF), projetados especificamente para fungos filamentosos. Abaixo, são discutidos aspectos críticos da metodologia, juntamente com seu significado, limitações e possíveis aplicações.

O sucesso do protocolo é altamente dependente de etapas importantes, como a preparação do substrato e do inóculo. A lavagem e secagem adequadas do farelo de trigo são essenciais para eliminar impurezas que podem interferir no crescimento de fungos ou na produção de enzimas. Além disso, o ajuste cuidadoso da umidade do substrato para manter a umidade relativa acima de 90% garante a colonização e a atividade fúngica ideais¹³. A operação do sistema rotativo a 10 rpm é outro parâmetro crucial, pois promove mistura e oxigenação uniformes, evitando a aglomeração do substrato e garantindo o crescimento uniforme dos fungos¹⁴.

A adaptabilidade deste protocolo reside em sua compatibilidade com diversas espécies de fungos e indutores. Por exemplo, enquanto quitina e amido comerciais foram usados como indutores neste estudo, outros substratos, como lignina, celulose ou quitosana, podem ser substituídos dependendo da enzima alvo. A solução de problemas comuns, como a colonização irregular do substrato, envolve o refinamento dos parâmetros de mistura ou o ajuste da concentração de inóculo². Além disso, garantir a esterilidade durante a preparação e inoculação do substrato é fundamental para evitar a contaminação, especialmente em aplicações em escala industrial¹⁵.

Embora o SSF ofereça várias vantagens sobre a fermentação submersa (SmF), ele não é isento de limitações¹⁶. Um grande desafio é aumentar a escala do sistema rotativo de SSF sem comprometer a mistura de substratos, a difusão de oxigênio ou a determinação precisa da biomassa, outro problema comum no SSF^17,18. Além disso, a dependência do protocolo de resíduos agroindustriais, como farelo de trigo, pode introduzir variabilidade nos resultados devido a diferenças na composição do substrato entre os lotes. Essas limitações destacam a necessidade de maior otimização na transição para a produção em larga escala ^19,20.

O sistema SSF rotativo descrito demonstra vantagens significativas sobre os métodos tradicionais de SSF estático e SmF. Em comparação com o SSF estático, o sistema rotativo garante um crescimento microbiano mais uniforme, reduzindo os problemas relacionados às limitações de oxigênio. Além disso, a adaptabilidade do sistema permite sua aplicação a várias formas fúngicas e tipos de enzimas, tornando-o altamente versátil¹⁸. Os sistemas SSF podem ter várias configurações para aumentar a produtividade dos metabólitos. Cada tipo de sistema tem vantagens e desvantagens que devem ser analisadas em profundidade para determinar a melhor configuração. O sistema rotativo SSF oferece várias vantagens sobre o SSF e o SmF estáticos tradicionais; no entanto, enfrenta desafios quando comparado a outros sistemas SSF, como biorreatores de bandeja e leito compactado. Os biorreatores de bandeja, comumente usados para SSF em larga escala, oferecem simplicidade e baixo consumo de energia, mas enfrentam desafios relacionados à transferência limitada de oxigênio e distribuição de umidade, levando a um crescimento microbiano desigual e redução do rendimento enzimático. Os biorreatores de leito compactado, por outro lado, melhoram a aeração por meio do fluxo de ar forçado, mas podem encontrar problemas com quedas de pressão e distribuição desigual de temperatura, principalmente em colunas altas. Em contraste, o sistema SSF rotativo promove mistura contínua e condições homogêneas, reduzindo as zonas anaeróbicas e aumentando a produtividade enzimática. No entanto, o consumo de energia e o desgaste mecânico devido à rotação contínua podem aumentar os custos operacionais²¹.

Os sistemas estáticos de fermentação em estado sólido, como biorreatores de bandeja, são limitados pela transferência limitada de calor e massa, muitas vezes levando a gradientes de temperatura interna de mais de 30 °C, resultando em desempenho microbiano abaixo do ideal. Esses sistemas geralmente operam em pequenos volumes (0,15-0,25 m³) e sofrem de colonização microbiana heterogênea, com estudos indicando que apenas cerca de 34% dos poros do substrato são efetivamente utilizados. Em contraste, os biorreatores rotativos oferecem agitação mecânica que melhora a distribuição de oxigênio e a homogeneidade do substrato, ao mesmo tempo em que suportam volumes operacionais maiores de até 13 m³ e cargas de substrato que chegam a 40% (p/v). Um exemplo notável envolve a produção de celulase por Thermoascus aurantiacus, onde um reator SSF rotativo mantido a 49 ° C e ventilado a 5 L / min · kg produziu 14.098 UI / g de atividade enzimática - mais de três vezes maior do que as 4.212 UI / g obtidas em condições estáticas²².

A ampliação da fermentação em estado sólido requer um equilíbrio delicado entre manter a cinética microbiana e garantir a transferência eficaz de massa e calor em sistemas progressivamente maiores. A abordagem tradicional em etapas inclui estágios laboratoriais (5-20 kg), piloto (50-5.000 kg) e industriais (25-1.000 toneladas). Um dos principais desafios durante o escalonamento é a dissipação do calor metabólico, que pode chegar a até 3.200 kcal/kg de material seco, o que é particularmente problemático em sistemas estáticos ou mal ventilados. Para resolver isso, as estratégias de aumento de escala geralmente dependem do controle de parâmetros de projeto adimensionais e da aplicação de abordagens de modelagem matemática, incluindo equações de balanço de massa e energia, para preservar variáveis-chave, como disponibilidade de oxigênio e retenção de umidade do substrato em diferentes escalas. Os sistemas em escala piloto (por exemplo, 150 L e 6 m³) incorporaram com sucesso recursos de engenharia, como camisas de água, lâminas de agitação curvas e umidade controlada para melhorar a reprodutibilidade do processo e garantir rendimentos consistentes do produto 18,21,22.

O protocolo apresentado demonstrou eficácia para a produção de enzimas em pequena escala laboratorial. No entanto, a ampliação do processo para aplicações industriais apresenta desafios significativos, principalmente relacionados à manutenção de mistura e aeração eficientes em volumes maiores. Uma abordagem promissora para lidar com essas limitações é o uso de um reator de parafuso contínuo, que imita a função de um misturador vertical, promovendo mistura contínua e oxigenação aprimorada em todo o substrato sólido. Este projeto reduz a formação de zonas anaeróbicas e aumenta a transferência de massa, que são fatores críticos para o sucesso da fermentação em estado sólido em escala industrial ^2,15. No entanto, os desafios potenciais incluem manter a integridade estrutural da matriz sólida e evitar a formação de gradientes de temperatura ao longo do reator. Estudos futuros devem se concentrar na otimização dos parâmetros operacionais e na validação dos rendimentos enzimáticos em condições de aumento de escala para garantir a viabilidade e eficiência do processo.

As aplicações potenciais deste protocolo se estendem a vários setores, incluindo biotecnologia de alimentos, bioenergia e remediação ambiental. Por exemplo, a produção aprimorada de enzimas hidrolíticas como quitinases e amilases pode apoiar processos de bioconversão na agricultura e na indústria. Além disso, o uso de subprodutos agroindustriais, como o farelo de trigo, se alinha a práticas sustentáveis, promovendo a valorização de resíduos e contribuindo para uma bioeconomia circular²⁰.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL Erlenmeyer flask	Sigma-Aldrich	CLS431684	For culturing mycelium in liquid medium.
50 mL conical tube	Sigma-Aldrich	CLS430921	For storing and preparing substrates and inoculum.
Acetate buffer, pH 5.6	Sigma-Aldrich	320866	For chitinase extraction.
Centricon filters	Millipore	UFC905024	For further purification of enzymes.
Counting cells chamber	Sigma-Aldrich	Z359629	Used to count spores under a microscope.
Filter paper	Whatman	1001-110	For filtering the enzyme extract.
Hygrometer	Todomicro	-	To measure relative humidity of the substrate.
Inducer (e.g., commercial chitin)	Sigma-Aldrich	C9752	Used to enhance enzyme production during fermentation.
Phosphate buffer, pH 6.9	Sigma-Aldrich	P5379	For amylase extraction.
Potato-dextrose agar	Sigma-Aldrich	P2182	Culture medium for growing fungal mycelium.
Potato-dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685	Liquid culture medium for growing fungal mycelium.
Rotary mixer	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	To keep substrate moving during fermentation.
Salt solution components (e.g., KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Multiple	For preparing sterile salt solution, see detailed recipe in the protocol.
Wheat bran	Comercial market	-	Substrate for solid-state fermentation.