תכנון מערכות תסיסה במצב מוצק לייצור אנזימים חוץ-תאיים פולימריים הידרוליטיים על ידי פטריות חוטיות

Summary

פרוטוקול זה משתמש בסובין חיטה במערכת תסיסה סיבובית במצב מוצק כדי לשפר את ייצור האנזימים. המצע, בתוספת חומרים משרים כגון כיטין, תומך בצמיחת פטריות בתנאים מבוקרים. התוצאות מדגימות כי תפוקות האנזים גבוהות פי 4-6 בהשוואה לתסיסה שקועה, מה שמציג את יכולת ההסתגלות והיעילות של השיטה ליישומים ביוטכנולוגיים מגוונים.

Abstract

תסיסה במצב מוצק (SSF) היא תהליך המרה ביולוגית המשתמש במצע מוצק שאינו מתמוסס במדיום מימי. מיקרואורגניזמים גדלים על פני המצע וחודרים למטריצה המוצקה שלו כדי לחלץ חומרים מזינים חיוניים להתפתחותם. SSF מאופיין במים חופשיים מינימליים, עם תכולת לחות מצע שנשמרת מעל 70%, וכולל שלושה שלבים מחוברים זה לזה - גזי, נוזלי ומוצק. פרוטוקול זה מתאר את השימוש בסובין חיטה, תוצר לוואי אגרו-תעשייתי, כמצע הבסיס לייצור אנזימים במערכת סיבובית. המצע מתווסף עם משרה, כגון כיטין, צ'יטוזן, עמילן או תאית, כדי לקדם את הסינתזה של חלבונים הידרוליטיים. המערכת ניתנת להתאמה גבוהה, ומאפשרת שימוש בצורות פטרייתיות שונות, כולל תפטיר, נבגים או כדורים. במתודולוגיה המתוארת, המשרה והמצע מעורבבים ביחס של 1:100 (w/w), מעוקרים באמצעות חיטוי ומותאמים לרמת הלחות הרצויה עם מים סטריליים. לאחר מכן מוסיפים את החיסון הפטרייתי, והמערכת הסיבובית פועלת ב-10 סל"ד כדי להבטיח ערבוב וחמצון נאותים. המערכת מודגרת במשך 6-8 ימים בתנאי גידול אופטימליים לפטריות מזופיליות או תרמופיליות/תרמוטולנטיות, מה שמשפר את הרבגוניות שלה. לאחר הדגירה, האנזים מופק בקלות באמצעות חוצץ קר מתאים (למשל, אצטט, ציטראט או פוספט), בהתאם לסוג האנזים. התמצית מובהרת באמצעות צנטריפוגה וסינון לקבלת סופרנטנט נטול תאים. לאחר מכן ניתן לרכז או לטהר את האנזים לפי הצורך. התוצאות הראו עלייה של פי 4-6 בפעילות האנזים בהשוואה לתסיסה שקועה (SmF), מה שהדגיש את יעילות המערכת. יכולת ההסתגלות שלו למצעים, משרים ומיני פטריות שונים הופכת אותו לכלי רב ערך עבור יישומים ביוטכנולוגיים שונים.

Introduction

תסיסה במצב מוצק (SSF) התגלתה כטכנולוגיית המרה ביולוגית מבטיחה ובת קיימא לייצור אנזימים בעלי ערך גבוה, תרכובות ביו-אקטיביות ומטבוליטים משניים. טכניקה זו כוללת גידול של מיקרואורגניזמים על מצעים מוצקים עם מינימום מים חופשיים, המדמה את סביבתם הטבעית ומאפשרת פעילות מטבולית יעילה¹. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה היא לייעל את ייצור האנזים באמצעות מערכת SSF סיבובית המבטיחה ניצול משופר של המצע, דיפוזיה של חמצן ומדרגיות תהליכים. שימוש בסובין חיטה, תוצר לוואי אגרו-תעשייתי בשפע, כמצע הבסיס, תורם להערכת שאריות חקלאיות ומקדם שיטות ביו-כלכלה מעגליות².

ל-SSF יתרונות משמעותיים על פני תסיסה שקועה (SmF), כולל צריכת אנרגיה ומים נמוכה יותר, ריכוז מוצרים גבוה יותר ותאימות למגוון רחב של שאריות חקלאיות זולות כגון סובין חיטה, קליפות אורז ובגאס קנה סוכר³. בניגוד ל-SmF, הדורש כמויות גדולות של מים וחומרי הזנה יקרים, מערכות SSF ממנפות מטריצות מוצקות המשמשות לא רק כמשטחי גידול מיקרוביאליים אלא גם מספקות חומרים מזינים החיוניים לפעילות מיקרוביאלית. בנוסף, המים החופשיים המוגבלים ב-SSF ממזערים את סיכוני הזיהום, מה שהופך אותם לאופציה חזקה יותר לייצור אנזימים במסגרות תעשייתיות⁴. בנוסף ליתרונותיו התפעוליים, SSF מציג יתרונות סביבתיים וכלכליים משמעותיים בהשוואה לתסיסה שקועה (SmF). מחקרים דיווחו כי SSF מפחית את צריכת המים ב-50%-70% ומוריד את עלויות האנרגיה ביותר מ-30% בשל היעדר כמויות מים גדולות הדורשות ערבול ואוורור מתמידים. יתרה מכך, השימוש בשאריות אגרו-תעשייתיות כמצעים ממזער את עלויות חומרי הגלם ומקדם שיטות כלכלה מעגלית על ידי ייעוד מחדש של תוצרי לוואי חקלאיים ^2,4.

SSF אומת בהרחבה על היעילות והמדרגיות שלו. לדוגמה, מחקרים דיווחו על עלייה של פי 4-6 בפעילות האנזים באמצעות SSF בהשוואה ל-SmF, מה שמדגיש את היתרונות הכלכליים והסביבתיים של טכניקה זו ^2,5. בנוסף, התהליך במורד הזרם מפושט, שכן מיצוי אנזימים דורש בדרך כלל פחות מים ופחות שלבי טיהור. זה הופך את SSF לאטרקטיבי במיוחד עבור תעשיות שמטרתן להפחית את עלויות התפעול וההשפעה הסביבתית⁶.

מערכת ה-SSF הסיבובית המתוארת בפרוטוקול זה מציעה מספר שיפורים על פני שיטות SSF סטטיות מסורתיות. בעוד שמערכות סטטיות מתמודדות לעתים קרובות עם אתגרים כגון התיישבות מצע לא אחידה והגבלת חמצן, התצורה הסיבובית מבטיחה ערבוב ואוורור יסודיים, ומקדמת צמיחה מיקרוביאלית אחידה ^7,8,9. לדוגמה, מערכת זו שימשה בהצלחה לייצור אנזימים הידרוליטיים כגון כיטינאזות, עמילאזות ופרוטאזות באמצעות מיני פטריות כמו אספרגילוס וטריכודרמה².

מאפיין מרכזי של מערכת SSF זו הוא יכולת ההסתגלות שלה. השימוש בסובין חיטה כמצע בסיס מדגים את הפוטנציאל של שאריות אגרו-תעשייתיות להמרה ביולוגית חסכונית³. יתר על כן, תוספת הסובסטרט עם משרה כגון כיטין, צ'יטוזן ועמילן משפרת עוד יותר את סינתזת האנזים על ידי גירוי מסלולים מטבוליים ספציפיים ^2,10. המערכת תואמת גם לצורות פטרייתיות שונות, כולל נבגים, תפטיר וכדורים, ומאפשרת למשתמשים להתאים את התהליך לדרישות הספציפיות שלהם².

SSF מציע פוטנציאל רחב ליישום בתחומים שונים כגון ביוטכנולוגיה של מזון, ייצור דלק ביולוגי ושיקום סביבתי¹¹. השילוב של מצעים חסכוניים, תפוקות אנזימים יוצאות דופן וגמישות גבוהה בתהליך מבסס את SSF כגישה חיונית לחידושים ביוטכנולוגיים בקנה מידה תעשייתי.

Protocol

הריאגנטים והציוד המשמשים במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת מצע

הערה: השתמש במותג מסחרי של סובין חיטה כדי למזער שינויים משמעותיים במאפייני המצע. כל אצווה של סובין חיטה משתנה עקב מספר גורמים, מה שהופך אותו לחומר הטרוגני שקשה לתקן, מה שמוביל לתנודות בתכולת המרכיבים אותו. אם נדרש חומר סטנדרטי, בחר מטריצה חלופית או בצע ניתוח כימי קרוב של כל אצווה של סובין חיטה כדי להתאים אותו בהתאם לצרכים.

1. שטפו את סובין החיטה שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים כדי להסיר שאריות חומר אורגני, פסולת ואבק. זה גם מסיר סוכרים פשוטים שעלולים להפריע לתסיסה.
2. מורחים את הסובין השטוף על מגש אלומיניום ומייבשים אותו בתנור בחום של 60 מעלות למשך 24 שעות.
3. לאחר הייבוש, הניחו את סובין החיטה בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל.

2. הכנת חיסון

הערה: פרוטוקול זה מתאר שלוש שיטות להכנת חיסון: תרחיף נבגים, חיסון ישיר עם דיסקי תפטיר ותרחיף תאי. קבע את ריכוז החיסון הראשוני וכמת את רמות החלבון לחישובי תשואה מדויקים.

1. הכנת תרחיף נבגים
   1. מעבירים דיסק אגר בקוטר 5 מ"מ רווי תפטיר לצלחת אגר דקסטרוז תפוחי אדמה טריים. דגרו את הצלחת בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך 5-7 ימים, או עד שהתפטיר רווי את המדיום. פטריות מסוימות עשויות לדרוש זמן דגירה ארוך יותר.
   2. הוסף לצלחת 5 מ"ל מים מזוקקים סטריליים ונתק מכנית את הנבגים באמצעות לולאה סטרילית.
   3. הכן דילול של 1:100 של תרחיף הנבגים. הניחו 10 מיקרוליטר במרכז תא נויבאואר וספרו נבגים תחת מיקרוסקופ. חשב את ריכוז הנבגים (נבגים/מ"ל) על סמך גורם התא והדילול.
2. גידול תפטיר במדיום נוזלי
   1. מעבירים דיסק אגר 5 מ"מ רווי בתפטיר על צלחת תפוחי אדמה-דקסטרוז-אגר טרייה ודוגרים בחום של 28 מעלות צלזיוס עד לרוויה.
   2. מכינים 25 מ"ל מרק תפוחי אדמה-דקסטרוז בבקבוק סטרילי של 125 מ"ל וחיטוי.
   3. מעבירים דיסק תפטיר 5 מ"מ מהצלחת הרוויה למרק הסטרילי.
   4. דגרו את הבקבוק על שייקר ב-125 סל"ד למשך 24-48 שעות, תלוי בזן הפטרייה. האריכו את זמן הדגירה עבור פטריות שגדלות לאט.
   5. אסוף 2 מ"ל לחיסון ו -2 מ"ל לקביעת משקל יבש.
3. חיסון ישיר של דיסקי תפטיר
   1. מניחים דיסק אגר בגודל 5 מ"מ רווי תפטיר על צלחת תפוחי אדמה-דקסטרוז-אגר טריים. יש לדגור בחום של 28 מעלות צלזיוס עד לרוויה.
   2. השתמש בדיסק תפטיר אחד כחיסון ובאחר כדי לקבוע את המשקל היבש.

3. הכנת מערכת SSF

הערה: משרים יכולים להיות טבעיים או מסחריים. עדיפים משרים מסחריים מטוהרים כדי למזער זיהומים שעלולים לשנות את יעילות התסיסה. התאם את תוספות המים כדי לשמור על לחות יחסית של לפחות 90%.

1. שלב את הרכיבים הבאים בצינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל: 5 גרם סובין חיטה יבש; 0.2 גרם של המשרה (למשל, כיטין מסחרי); 5.5 מ"ל מים (התאם על סמך יכולת ספיגת המים של המשרא); 5 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית המכילה 16 גרם/ליטר אשלגן פוספט חד-בסיסי, 4 גרם/ליטר נתרן גופרתי, 2 גרם/ליטר אשלגן כלורי, 1 גרם/ליטר סידן כלורי, 400 מ"ג/ליטר אבץ כלורי, 60 מ"ג/ליטר חומצה בורית, 40 מ"ג/ליטר נתרן מוליבדט, 150 מ"ג/ליטר מגנזיום כלוריד, 100 מ"ג/ליטר ברזל כלוריד ו-400 מ"ג/ליטר נחושת גופרתית.
2. מדוד את הלחות היחסית באמצעות מד לחות מבוסס אלקטרודה, המבטיח מינימום של 90% לחות. הכנס את בדיקת האלקטרודה ישירות לתוך הכור בעומקים משתנים כדי לקבל מדידה מייצגת של חלוקת הלחות.
   1. בצע את השלבים להתאמת הלחות אם מתחת ל-90%:
      1. מוסיפים בהדרגה מים מזוקקים סטריליים במרווחים של 1 מ"ל לכל 10 גרם מצע. לאחר כל הוספה יש לערבב היטב כדי להבטיח פיזור אחיד של לחות.
      2. אפשר למצע להתייצב למשך 10-15 דקות. מדוד מחדש את רמת הלחות.
      3. חזור על השלבים לעיל עד שתגיע ללחות היעד של 90%. הימנע מהרטבת יתר של המצע לאורך כל התהליך.
   2. בצע את השלבים להתאמת הלחות אם מעל 90%:
      1. מורחים את המצע דק בסביבה סטרילית. הסר עודף לחות על ידי (1) חשיפת המצע לזרימת אוויר למינרית, או (2) הנחתו בתא ייבוש בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך 10-15 דקות.
      2. לחלופין, ערבבו בעדינות את המצע כדי לקדם פיזור לחות אחיד. לאחר הטיפול יש להעריך מחדש את רמת הלחות.
      3. חזור על שלב הייבוש או הערבוב לפי הצורך עד שהלחות מגיעה ל-90%. המשך בתסיסה רק לאחר השגת לחות היעד.
3. חיטוי הצינור ב-15 psi למשך 15 דקות.
4. לאחר הקירור, יש לחסן את המצע באחד מהבאים: 1 מ"ל של תרחיף נבגים (1 x 10^6-1 x 10⁷ נבגים/מ"ל), 2 מ"ל של תרחיף סלולרי, או דיסק תפטיר אחד של 5 מ"מ.

4. הליך תסיסה במצב מוצק (SSF).

הערה: למחקרים קינטיים או הערכות פרמטרים בזמנים שונים, הכינו צינורות נפרדים לכל נקודת זמן כדי להבטיח ייצוגיות.

1. הימנע מגוש מצע על ידי מערבולת הצינורות במהירות מקסימלית למשך 5 דקות במחזורים של דקה.
2. מניחים את הצינורות במיקסר סיבובי עם ציר אופקי. ודא שהמצע נע בחופשיות בתוך הצינורות. הגדר את המיקסר לפעול ב-10 סל"ד.
3. דגרו את המיקסר בחממה בטמפרטורת הגידול האופטימלית של המיקרואורגניזם. שמרו על הטמפרטורה המדווחת לפעילות אנזימטית מיטבית בעת שימוש בחומרים מעוררים רגישים לחום.

5. מיצוי אנזימים

הערה: יסודות המיצוי מבוססים על המסיסות והפעילות המקסימלית של האנזים החוץ-תאי. מכיוון ש-SSF נמנע ממדיום המים, האנזים החוץ-תאי מעורב במים המקיפים את המטריצה המוצקה, מה שאומר שהריכוז גבוה יותר מאשר ב-SmF. בהקשר זה, בחירת מאגר המיצוי הטוב ביותר תלויה בידע על הפעילות הרצויה. אופטימיזציה של המיצויים תלויה בריכוז האנזים הסופי ובסוג מאגר המיצוי בו נעשה שימוש.

1. לאחר תקופת התסיסה הרצויה, השעו מחדש את המצע ב-20 מ"ל של מאגר מקורר מראש. דוגמאות כוללות: 0.1 M מאגר אצטט, pH 5.6, למיצוי כיטינאז; 0.02 M מאגר פוספט, pH 6.9, למיצוי עמילאז.
2. מערבולת הצינורות במחזורים: דקה אחת במהירות מרבית, ואחריה דקה על קרח. חזור על הפעולה 10 פעמים.
3. סנן את המתלים באמצעות מסנני נייר וחלץ מכנית את הסופרנטנט על ידי לחיצה.
4. הבהירו את הסופרנטנט על ידי צנטריפוגה ב-3000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
5. השתמש בתמצית הגולמית ישירות או טהר עוד יותר את האנזים באמצעות כרומטוגרפיה של עמודות או מסננים צנטריפוגליים. מחקרים קינטיים מומלצים גם כדי לקבוע את קבוע מיכאליס (Km) ואת הקצב המרבי של טרנספורמציה אנזימטית (Vmax)¹².

6. תהליך אופטימיזציה

הערה: בצע אופטימיזציה של פרוטוקול זה על ידי הערכה והתאמת האיכות והריכוז של המשרים, כמו גם סוג וריכוז החיסון.

1. קבע את זמן התסיסה האידיאלי וחדד את שלבי המיצוי כדי לשפר את היעילות.
2. שליטה וכוונון עדין של תנאי הסביבה, כולל טמפרטורה, pH ואוורור.
3. בדוק מאגרים ותנאי מיצוי שונים כדי לשפר את תפוקת האנזים ויציבותם.
4. לבצע ניתוחים סטטיסטיים, כגון מתודולוגיית משטח תגובה, כדי לזהות את המשתנים המשפיעים ביותר ולהשיג ייצור אנזימים אופטימלי.

תוצאות

איור 1A מציג את הייצוג הסכמטי של המיקסר הסיבובי המשמש במערכת זו, בעל קיבולת לשישה צינורות חרוטיים של 50 מ"ל. איור 2B ממחיש את השינויים המתרחשים בסובין החיטה במהלך ההתניה לפני הכניסה לתהליך התסיסה במצב מוצק. כפי שראינו, לא נצפו שינויים מבניים משמעותיים.

איור 2 מראה את הרוויה של סובין חיטה לאחר 6 ימים של תסיסה במצב מוצק לייצור כיטינאז על ידי פטריית Trichoderma harzianum במערכת זו, תוך שימוש בכיטין מסחרי כמשרה. איור 2A מציג את החומר המקורי לפני תהליך התסיסה. המיקרוגרפים מאשרים את ניצול המצע על ידי הפטרייה, מה שבא לידי ביטוי גם בשינויים שהיא עוברת, ומאבדת את המבנה הפרקטלי שלה עקב אינטראקציה עם הפטרייה.

התוצאות באיור 3 מראות עלייה משמעותית בפעילות כיטינאז (איור 3A) ובפעילות העמילאז (איור 3B) שהתקבלו מ-T. harzianum ו-Aspergillus lentulus, בהתאמה, כאשר משווים בין מערכות התסיסה במצב מוצק (SSF) והתסיסה השקועה (SmF). הנתונים אומתו על ידי מבחן ANOVA ו-Tukey חד כיווני עם p < 0.05 באמצעות תוכנת SigmaPlot. בהקשר זה, נצפה כי מערכת זו ישימה לפעילויות אנזימטיות ופטריות שונות. A. lentulus אופיינה כפטרייה סובלנית תרמית, שהודגרה בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס, והראתה עלייה משמעותית בפעילות העמילאז שלה. תוצאות פעילות הכיטינאז מ-T. harzianum בתסיסה נוזלית ומוצקה דווחו בעבר בנפרד על ידי קבוצת המחקר שלנו ^2,5, כאשר עבודה זו מאשרת ומשווה עלייה משמעותית ב-SSF בהשוואה ל-SmF, בדומה לפעילות העמילאז. הקבוצה שלנו עבדה עם יותר מ-50 זנים פטרייתיים לייצור פרוטאזות ועמילאזות בתנאים מזופיליים ותרמופיליים, והתוצאות עקביות.

התוצאות מאשרות את הצלחת הפרוטוקול על ידי הדגמת עלייה משמעותית בפעילות האנזים, כאשר תסיסה במצב מוצק מניבה תפוקות גבוהות יותר בהשוואה לתסיסה שקועה. זה מצביע על היעילות של SSF בשיפור ייצור הכיטינאז והעמילאז. דמויות שפורסמו בעבר נעשה שימוש חוזר עם הרשאה מתאימה להדפסה חוזרת.

איור 1: סקירה כללית של מערכת התסיסה הסיבובית במצב מוצק (SSF) ותהליך הטיפול המקדים בסובין חיטה. (A) ייצוג סכמטי של מערכת ה-SSF הסיבובית. (ב) שינויים בתהליך הטיפול המקדים בסובין חיטה: (I) חומר גלם ראשוני, (II) סובין חיטה לח לאחר שלב הכביסה, (III) סובין חיטה מיובש. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: רוויית מצע על ידי Trichoderma harzianum. (א) מצע לפני SSF. (ב,ג) מצע רווי בתפטיר פטרייתי בהגדלות שונות. פסי קנה מידה: (A), 50 מיקרומטר; (B), 200 מיקרומטר; (C), 100 מיקרומטר. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: פעילות אנזימטית ב-SSF ותסיסה שקועה (SmF) על ידי T. harzianum ו-A. lentulus. השוואה של (A) היווצרות גלוקוזאמין באמצעות הידרוליזה של צ'יטוזן על ידי אנזימים המיוצרים על ידי Trichoderma harzianum ב-SSF ו-SmF, ו-(B) פעילות עמילאז של Aspergillus lentulus המתקבלת ב-SSF ו-SmF. פסי שגיאה מייצגים את סטיית התקן של שלושה שכפולים. כוכביות (*) מציינות הבדל מובהק סטטיסטית בין הנתונים. שימו לב שהשונות הסטטיסטית היא ספציפית לכל סוג של אנזים ואינה חלה על השוואות בין (A) ל-(B). אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מחקר זה מתאר פרוטוקול רלוונטי לאופטימיזציה של ייצור אנזימים באמצעות מערכות תסיסה במצב מוצק (SSF), שתוכננו במיוחד עבור פטריות חוטיות. להלן נדונים היבטים קריטיים של המתודולוגיה, לצד משמעותה, מגבלותיה ויישומיה הפוטנציאליים.

הצלחת הפרוטוקול תלויה מאוד בשלבים מרכזיים כגון הכנת הסובסטרט והחיסון. שטיפה וייבוש נכונים של סובין החיטה חיוניים לסילוק זיהומים שעלולים להפריע לצמיחת פטריות או לייצור אנזימים. בנוסף, ההתאמה הקפדנית של לחות המצע לשמירה על לחות יחסית מעל 90% מבטיחה התיישבות ופעילות פטרייתית אופטימלית¹³. פעולת המערכת הסיבובית ב-10 סל"ד היא פרמטר מכריע נוסף, שכן היא מקדמת ערבוב וחמצון אחידים, מונעת גושי מצע ומבטיחה צמיחה פטרייתית אחידה¹⁴.

יכולת ההסתגלות של פרוטוקול זה טמונה בתאימותו למיני פטריות ומשרים מגוונים. לדוגמה, בעוד שכיטין ועמילן מסחריים שימשו כמשרים במחקר זה, ניתן להחליף סובסטרטים אחרים, כגון ליגנין, תאית או צ'יטוזן, בהתאם לאנזים המטרה. פתרון בעיות באתגרים נפוצים, כגון קולוניזציה לא אחידה של מצע, כרוך בחידוד פרמטרי הערבוב או התאמת ריכוז החיסון². יתר על כן, הבטחת סטריליות במהלך הכנת המצע והחיסון היא קריטית למניעת זיהום, במיוחד ביישומים בקנה מידה תעשייתי¹⁵.

בעוד ש-SSF מציע מספר יתרונות על פני תסיסה שקועה (SmF), הוא אינו חף ממגבלות¹⁶. אתגר מרכזי אחד הוא הרחבת מערכת ה-SSF הסיבובית מבלי להתפשר על ערבוב מצעים, פיזור חמצן או קביעת ביומסה מדויקת, בעיה נפוצה נוספת ב-SSF^17,18. בנוסף, הסתמכות הפרוטוקול על שאריות אגרו-תעשייתיות כגון סובין חיטה עשויה להציג שונות בתוצאות עקב הבדלים בהרכב המצע בין אצוות. מגבלות אלו מדגישות את הצורך באופטימיזציה נוספת בעת מעבר לייצור בקנה מידה גדול^19,20.

מערכת ה-SSF הסיבובית המתוארת מדגימה יתרונות משמעותיים על פני שיטות SSF ו-SmF סטטיות מסורתיות. בהשוואה ל-SSF סטטי, המערכת הסיבובית מבטיחה צמיחה מיקרוביאלית אחידה יותר, ומפחיתה בעיות הקשורות למגבלות חמצן. בנוסף, יכולת ההסתגלות של המערכת מאפשרת ליישם אותה על צורות פטרייתיות וסוגי אנזימים שונים, מה שהופך אותה לרב-תכליתית ביותר¹⁸. למערכות SSF יכולות להיות תצורות שונות כדי לשפר את פרודוקטיביות המטבוליטים. לכל סוג מערכת יתרונות וחסרונות שיש לנתח לעומק כדי לקבוע את התצורה הטובה ביותר. מערכת ה-SSF הסיבובית מציעה מספר יתרונות על פני SSF ו-SmF סטטיים מסורתיים; עם זאת, הוא מתמודד עם אתגרים בהשוואה למערכות SSF אחרות, כגון ביו-ריאקטורים עם מגש ומיטה ארוזה. ביו-ריאקטורים במגש, המשמשים בדרך כלל ל-SSF בקנה מידה גדול, מציעים פשטות וצריכת אנרגיה נמוכה אך מתמודדים עם אתגרים הקשורים להעברת חמצן מוגבלת ופיזור לחות, מה שמוביל לצמיחה לא אחידה של חיידקים ולהפחתת תפוקת האנזימים. ביו-ריאקטורים ארוזים, לעומת זאת, משפרים את האוורור באמצעות זרימת אוויר מאולצת אך עלולים להיתקל בבעיות עם ירידות לחץ וחלוקת טמפרטורה לא אחידה, במיוחד בעמודים גבוהים. לעומת זאת, מערכת ה-SSF הסיבובית מקדמת ערבוב מתמשך ותנאים הומוגניים, מפחיתה אזורים אנאירוביים ומשפרת את תפוקת האנזימים. עם זאת, צריכת אנרגיה ובלאי מכני עקב סיבוב מתמשך עלולים להגדיל את עלויות התפעול²¹.

מערכות תסיסה סטטיות במצב מוצק, כגון ביו-ריאקטורים במגשים, מוגבלות על ידי העברת חום ומסה מוגבלת, מה שמוביל לעתים קרובות לשיפועי טמפרטורה פנימיים של מעל 30 מעלות צלזיוס, וכתוצאה מכך ביצועים מיקרוביאליים לא אופטימליים. מערכות אלו פועלות בדרך כלל בנפחים קטנים (0.15-0.25 מ"ק) וסובלות מהתיישבות מיקרוביאלית הטרוגנית, כאשר מחקרים מצביעים על כך שרק כ-34% מנקבוביות הסובסטרט מנוצלות ביעילות. לעומת זאת, ביו-ריאקטורים מסתובבים מציעים תסיסה מכנית המשפרת את פיזור החמצן וההומוגניות של המצע, תוך תמיכה בנפחים תפעוליים גדולים יותר של עד 13 m³ ועומסי מצע המגיעים ל-40% (w/v). דוגמה בולטת היא ייצור צלולאז על ידי Thermoascus aurantiacus, שבו כור SSF מסתובב שנשמר ב-49 מעלות צלזיוס ומאוורר ב-5 ליטר לדקה ק"ג הניב 14,098 IU/g של פעילות אנזימים - יותר מפי שלושה מ-4,212 IU/g שהושגו בתנאים סטטיים²².

הרחבת התסיסה במצב מוצק דורשת איזון עדין בין שמירה על קינטיקה מיקרוביאלית לבין הבטחת העברת מסה וחום יעילה במערכות גדולות יותר ויותר. הגישה המדורגת המסורתית כוללת שלבי מעבדה (5-20 ק"ג), פיילוט (50-5,000 ק"ג) ותעשייתי (25-1,000 טון). אחד האתגרים העיקריים במהלך ההגדלה הוא פיזור החום המטבולי, שיכול להגיע עד 3,200 קק"ל/ק"ג של חומר יבש, שהוא בעייתי במיוחד במערכות סטטיות או מאווררות גרוע. כדי לטפל בכך, אסטרטגיות הגדלה מסתמכות לעתים קרובות על שליטה בפרמטרים עיצוביים חסרי מימד ויישום גישות מודלים מתמטיות, כולל משוואות איזון מסה ואנרגיה, כדי לשמר משתני מפתח כגון זמינות חמצן ושימור לחות המצע בקני מידה שונים. מערכות בקנה מידה פיילוט (למשל, 150 ליטר ו-6 מ"ק) שילבו בהצלחה תכונות הנדסיות כגון מעילי מים, להבי ערבוב מעוקלים ולחות מבוקרת כדי לשפר את יכולת השחזור של התהליך ולהבטיח תפוקות מוצר עקביות 18,21,22.

הפרוטוקול הציג יעילות מוכחת לייצור אנזימים בקנה מידה מעבדתי קטן. עם זאת, הרחבת התהליך ליישומים תעשייתיים מציבה אתגרים משמעותיים, הקשורים בעיקר לשמירה על ערבוב ואוורור יעילים בנפחים גדולים יותר. גישה מבטיחה אחת לטיפול במגבלות אלו היא השימוש בכור בורג רציף, המחקה את תפקודו של מערבל אנכי על ידי קידום ערבוב רציף וחמצון משופר בכל המצע המוצק. תכנון זה מפחית את היווצרותם של אזורים אנאירוביים ומשפר את העברת המסה, שהם גורמים קריטיים להצלחת תסיסה במצב מוצק בקנה מידה תעשייתי ^2,15. עם זאת, אתגרים פוטנציאליים כוללים שמירה על השלמות המבנית של המטריצה המוצקה ומניעת היווצרות שיפועי טמפרטורה לאורך הכור. מחקרים נוספים צריכים להתמקד באופטימיזציה של פרמטרים תפעוליים ואימות תפוקות אנזימים בתנאים מוגדלים כדי להבטיח את היתכנות ויעילות התהליך.

היישומים הפוטנציאליים של פרוטוקול זה משתרעים על מגזרים מרובים, כולל ביוטכנולוגיה של מזון, ביו-אנרגיה ושיקום סביבתי. לדוגמה, ייצור מוגבר של אנזימים הידרוליטיים כמו כיטינאזות ועמילאזים יכול לתמוך בתהליכי המרה ביולוגית בחקלאות ובתעשייה. יתר על כן, השימוש בתוצרי לוואי אגרו-תעשייתיים כגון סובין חיטה מתיישב עם פרקטיקות בנות קיימא, מקדם את הערכת הפסולת ותורם לביו-כלכלה מעגלית²⁰.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL Erlenmeyer flask	Sigma-Aldrich	CLS431684	For culturing mycelium in liquid medium.
50 mL conical tube	Sigma-Aldrich	CLS430921	For storing and preparing substrates and inoculum.
Acetate buffer, pH 5.6	Sigma-Aldrich	320866	For chitinase extraction.
Centricon filters	Millipore	UFC905024	For further purification of enzymes.
Counting cells chamber	Sigma-Aldrich	Z359629	Used to count spores under a microscope.
Filter paper	Whatman	1001-110	For filtering the enzyme extract.
Hygrometer	Todomicro	-	To measure relative humidity of the substrate.
Inducer (e.g., commercial chitin)	Sigma-Aldrich	C9752	Used to enhance enzyme production during fermentation.
Phosphate buffer, pH 6.9	Sigma-Aldrich	P5379	For amylase extraction.
Potato-dextrose agar	Sigma-Aldrich	P2182	Culture medium for growing fungal mycelium.
Potato-dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685	Liquid culture medium for growing fungal mycelium.
Rotary mixer	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	To keep substrate moving during fermentation.
Salt solution components (e.g., KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Multiple	For preparing sterile salt solution, see detailed recipe in the protocol.
Wheat bran	Comercial market	-	Substrate for solid-state fermentation.