Conception de systèmes de fermentation à l’état solide pour la production d’enzymes extracellulaires hydrolytiques de polymères par des champignons filamenteux

Résumé

Ce protocole utilise le son de blé dans un système de fermentation rotatif à l’état solide pour améliorer la production d’enzymes. Le substrat, complété par des inducteurs tels que la chitine, favorise la croissance fongique dans des conditions contrôlées. Les résultats démontrent des rendements enzymatiques 4 à 6 fois plus élevés que ceux de la fermentation submergée, ce qui démontre l’adaptabilité et l’efficacité de la méthode pour diverses applications biotechnologiques.

Résumé

La fermentation à l’état solide (SSF) est un processus de bioconversion qui utilise un substrat solide qui ne se dissout pas dans un milieu aqueux. Les micro-organismes se développent à la surface du substrat et pénètrent dans sa matrice solide pour en extraire les nutriments essentiels à leur développement. Les SSF se caractérisent par un minimum d’eau libre, avec une teneur en humidité du substrat maintenue au-dessus de 70 %, et impliquent trois phases interconnectées : gazeuse, liquide et solide. Ce protocole décrit l’utilisation du son de blé, un sous-produit agro-industriel, comme substrat de base pour la production d’enzymes dans un système rotatif. Le substrat est complété par un inducteur, tel que la chitine, le chitosane, l’amidon ou la cellulose, pour favoriser la synthèse des protéines hydrolytiques. Le système est hautement adaptable, permettant l’utilisation de différentes formes fongiques, notamment le mycélium, les spores ou les granulés. Dans la méthodologie décrite, l’inducteur et le substrat sont mélangés dans un rapport de 1:100 (p/p), stérilisés par autoclave et ajustés au niveau d’humidité souhaité avec de l’eau stérile. L’inoculum fongique est ensuite ajouté et le système rotatif fonctionne à 10 tr/min pour assurer un mélange et une oxygénation adéquats. Le système est incubé pendant 6 à 8 jours dans des conditions de croissance optimales pour les champignons mésophiles ou thermophiles/thermotolérants, ce qui améliore sa polyvalence. Après l’incubation, l’enzyme est facilement extraite à l’aide d’un tampon froid approprié (par exemple, acétate, citrate ou phosphate), selon le type d’enzyme. L’extrait est clarifié par centrifugation et filtration pour obtenir un surnageant acellulaire. L’enzyme peut ensuite être concentrée ou purifiée selon les besoins. Les résultats ont démontré une augmentation de 4 à 6 fois de l’activité enzymatique par rapport à la fermentation submergée (SmF), soulignant l’efficacité du système. Son adaptabilité à différents substrats, inducteurs et espèces fongiques en fait un outil précieux pour diverses applications biotechnologiques.

Introduction

La fermentation à l’état solide (SSF) est devenue une technologie de bioconversion prometteuse et durable pour produire des enzymes de grande valeur, des composés bioactifs et des métabolites secondaires. Cette technique implique la croissance de micro-organismes sur des substrats solides avec un minimum d’eau libre, simulant leur environnement naturel et permettant une activité métabolique efficace¹. L’objectif principal de ce protocole est d’optimiser la production d’enzymes grâce à un système SSF rotatif qui garantit une meilleure utilisation du substrat, une diffusion d’oxygène et une évolutivité du processus. L’utilisation du son de blé, un sous-produit agro-industriel abondant, comme substrat de base, contribue à la valorisation des résidus agricoles et favorise les pratiques de bioéconomie circulaire².

La SSF présente des avantages significatifs par rapport à la fermentation submergée (SmF), notamment une consommation d’énergie et d’eau plus faible, une concentration de produit plus élevée et une compatibilité avec une large gamme de résidus agricoles peu coûteux tels que le son de blé, les balles de riz et la bagasse de canne à sucre³. Contrairement à la SmF, qui nécessite de grands volumes d’eau et des milieux nutritifs coûteux, les systèmes SSF exploitent des matrices solides qui servent non seulement de surfaces de croissance microbienne, mais fournissent également des nutriments essentiels à l’activité microbienne. De plus, l’eau libre limitée dans les SSF minimise les risques de contamination, ce qui en fait une option plus robuste pour la production d’enzymes dans les environnements industriels⁴. En plus de ses avantages opérationnels, la SSF présente des avantages environnementaux et économiques importants par rapport à la fermentation submergée (SmF). Des études ont montré que les SSF réduisent la consommation d’eau de 50 à 70 % et les coûts énergétiques de plus de 30 % en raison de l’absence de grands volumes d’eau nécessitant une agitation et une aération constantes. De plus, l’utilisation de résidus agro-industriels comme substrats minimise les coûts des matières premières et favorise les pratiques d’économie circulaire en réutilisant les sous-produits agricoles ^2,4.

SSF a été largement validé pour son efficacité et son évolutivité. Par exemple, des études ont rapporté une augmentation de 4 à 6 fois de l’activité enzymatique utilisant la SSF par rapport à la SmF, soulignant les avantages économiques et environnementaux de cette technique ^2,5. De plus, le processus en aval est simplifié, car l’extraction enzymatique nécessite généralement moins d’eau et moins d’étapes de purification. Cela rend les SSF particulièrement attrayants pour les industries qui visent à réduire les coûts d’exploitation et l’impact environnemental⁶.

Le système SSF rotatif décrit dans ce protocole offre plusieurs améliorations par rapport aux méthodes SSF statiques traditionnelles. Alors que les systèmes statiques sont souvent confrontés à des défis tels que la colonisation inégale du substrat et la limitation de l’oxygène, la configuration rotative assure un mélange et une aération complets, favorisant une croissance microbienne uniforme ^7,8,9. Par exemple, ce système a été utilisé avec succès pour produire des enzymes hydrolytiques telles que les chitinases, les amylases et les protéases en utilisant des espèces fongiques comme Aspergillus et Trichoderma².

L’une des principales caractéristiques de ce système SSF est son adaptabilité. L’utilisation du son de blé comme substrat de base démontre le potentiel des résidus agro-industriels pour une bioconversion rentable³. De plus, la supplémentation du substrat avec des inducteurs tels que la chitine, le chitosane et l’amidon améliore encore la synthèse enzymatique en stimulant des voies métaboliques spécifiques ^2,10. Le système est également compatible avec différentes formes de champignons, notamment les spores, le mycélium et les granulés, ce qui permet aux utilisateurs d’adapter le processus à^{leurs besoins} spécifiques2.

La pêche artisanale offre un large potentiel d’application dans divers domaines tels que la biotechnologie alimentaire, la production de biocarburants et l’assainissement de l’environnement¹¹. Son intégration de substrats rentables, ses rendements enzymatiques exceptionnels et sa grande flexibilité de processus font de la SSF une approche essentielle pour les innovations biotechnologiques à l’échelle industrielle.

Protocole

Les réactifs et l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation du substrat

REMARQUE : Utiliser une marque commerciale de son de blé pour minimiser les variations importantes des caractéristiques du substrat. Chaque lot de son de blé varie en raison de multiples facteurs, ce qui en fait un matériau hétérogène difficile à standardiser, ce qui entraîne des fluctuations dans sa teneur en composants. Si un matériau standardisé est nécessaire, choisissez une matrice alternative ou effectuez une analyse chimique immédiate de chaque lot de son de blé afin de l’ajuster en fonction des besoins.

1. Lavez le son de blé trois fois avec de l’eau distillée stérile pour éliminer les résidus de matière organique, les débris et la poussière. Cela permet également d’éliminer les sucres simples qui pourraient interférer avec la fermentation.
2. Étalez le son lavé sur une plaque en aluminium et séchez-le au four à 60 °C pendant 24 h.
3. Une fois séché, placez le son de blé dans un tube conique stérile de 50 ml.

2. Préparation de l’inoculum

REMARQUE : Ce protocole décrit trois méthodes de préparation de l’inoculum : la suspension de spores, l’inoculation directe avec des disques de mycélium et la suspension cellulaire. Établissez la concentration initiale de l’inoculum et quantifiez les niveaux de protéines pour des calculs de rendement précis.

1. Préparation de la suspension de spores
   1. Transvaser un disque de gélose de 5 mm de diamètre saturé de mycélium sur une plaque de gélose fraîche au dextrose de pomme de terre. Incuber la plaque à 28 °C pendant 5 à 7 jours, ou jusqu’à ce que le mycélium sature le milieu. Certains champignons peuvent nécessiter un temps d’incubation plus long.
   2. Ajouter 5 mL d’eau distillée stérile dans la plaque et détacher mécaniquement les spores à l’aide d’une boucle stérile.
   3. Préparez une dilution de 1:100 de la suspension de spores. Placez 10 μL au centre d’une chambre Neubauer et comptez les spores au microscope. Calculez la concentration des spores (spores/mL) en fonction du facteur et de la dilution de la chambre.
2. Culture du mycélium en milieu liquide
   1. Transvaser une disquette de gélose de 5 mm saturée de mycélium sur une plaque fraîche de gélose pomme de terre-dextrose-incuber et incuber à 28 °C jusqu’à saturation.
   2. Préparez 25 ml de bouillon de pommes de terre et de dextrose dans une fiole stérile de 125 ml et un autoclave.
   3. Transférez un disque de mycélium de 5 mm de la plaque saturée dans le bouillon stérile.
   4. Incuber le ballon sur un agitateur à 125 tr/min pendant 24 à 48 h, selon la souche fongique. Prolongez le temps d’incubation pour les champignons à croissance lente.
   5. Prélever 2 mL pour l’inoculum et 2 mL pour la détermination du poids sec.
3. Inoculation directe de disques de mycélium
   1. Placez un disque de gélose de 5 mm saturé de mycélium sur une plaque fraîche de pomme de terre-dextrose-gélose. Incuber à 28 °C jusqu’à saturation.
   2. Utilisez un disque de mycélium comme inoculum et un autre pour déterminer le poids sec.

3. Préparation du système SSF

REMARQUE : Les inducteurs peuvent être naturels ou commerciaux. Les inducteurs commerciaux purifiés sont préférés pour minimiser les impuretés qui pourraient altérer l’efficacité de la fermentation. Ajustez les ajouts d’eau pour maintenir une humidité relative d’au moins 90 %.

1. Mélanger les composants suivants dans un tube conique stérile de 50 mL : 5 g de son de blé sec ; 0,2 g de l’inducteur (p. ex., chitine commerciale) ; 5,5 mL d’eau (ajuster en fonction de la capacité d’absorption d’eau de l’inducteur) ; 5 mL d’une solution saline stérile contenant 16 g/L de phosphate de potassium monobasique, 4 g/L de sulfate de sodium, 2 g/L de chlorure de potassium, 1 g/L de chlorure de calcium, 400 mg/L de chlorure de zinc, 60 mg/L d’acide borique, 40 mg/L de molybdate de sodium, 150 mg/L de chlorure de magnésium, 100 mg/L de chlorure ferrique et 400 mg/L de sulfate de cuivre.
2. Mesurez l’humidité relative à l’aide d’un hygromètre à électrodes, en veillant à ce qu’il y ait un minimum de 90 % d’humidité. Insérez la sonde d’électrode directement dans le réacteur à différentes profondeurs pour obtenir une mesure représentative de la distribution de l’humidité.
   1. Suivez les étapes pour ajuster l’humidité si elle est inférieure à 90 % :
      1. Ajouter graduellement de l’eau distillée stérile par tranches de 1 mL par 10 g de substrat. Après chaque ajout, bien mélanger pour assurer une répartition uniforme de l’humidité.
      2. Laissez le substrat s’équilibrer pendant 10 à 15 min. Remesurez le taux d’humidité.
      3. Répétez les étapes ci-dessus jusqu’à ce que l’humidité cible de 90 % soit atteinte. Évitez de trop mouiller le substrat tout au long du processus.
   2. Suivez les étapes pour ajuster l’humidité si elle est supérieure à 90 % :
      1. Étalez finement le substrat dans un environnement stérile. Éliminez l’excès d’humidité en (1) exposant le substrat à un flux d’air laminaire, ou (2) en le plaçant dans une chambre de séchage à 30 °C pendant 10 à 15 min.
      2. Vous pouvez également mélanger doucement le substrat pour favoriser une redistribution uniforme de l’humidité. Après le traitement, réévaluez le taux d’humidité.
      3. Répétez l’étape de séchage ou de mélange au besoin jusqu’à ce que l’humidité atteigne 90 %. Ne procédez à la fermentation qu’une fois que l’humidité cible est atteinte.
3. Autoclave le tube à 15 psi pendant 15 min.
4. Après refroidissement, inoculer le substrat avec l’un des éléments suivants : 1 mL de suspension de spores (1 x 10^6-1 x 10⁷ spores/mL), 2 mL de suspension cellulaire ou un disque de mycélium de 5 mm.

4. Procédure de fermentation à l’état solide (SSF)

REMARQUE : Pour les études cinétiques ou les évaluations de paramètres à différents moments, préparez des tubes distincts pour chaque point temporel afin d’assurer la représentativité.

1. Évitez l’agglutination du substrat en faisant tourbillonner les tubes à vitesse maximale pendant 5 min par cycles de 1 min.
2. Placez les tubes dans un mélangeur rotatif à axe horizontal. Assurez-vous que le substrat se déplace librement à l’intérieur des tubes. Réglez le mélangeur pour qu’il fonctionne à 10 tr/min.
3. Incuber le mélangeur dans un incubateur à la température de croissance optimale du micro-organisme. Maintenez la température signalée pour une activité enzymatique optimale lors de l’utilisation d’inducteurs sensibles à la chaleur.

5. Extraction des enzymes

REMARQUE : Les principes fondamentaux de l’extraction sont basés sur la solubilité et l’activité au pH maximal de l’enzyme extracellulaire. Comme la SSF évite le milieu aqueux, l’enzyme extracellulaire est impliquée dans l’eau entourant la matrice solide, ce qui signifie que la concentration est plus élevée que dans la SmF. Dans ce contexte, la sélection du meilleur tampon d’extraction dépend de la connaissance de l’activité souhaitée. L’optimisation des extractions dépend de la concentration enzymatique finale et du type de tampon d’extraction utilisé.

1. Après la période de fermentation souhaitée, remettre le substrat en suspension dans 20 mL de tampon pré-refroidi. Exemples : tampon d’acétate 0,1 M, pH 5,6, pour l’extraction de la chitinase ; Tampon phosphate 0,02 M, pH 6,9, pour l’extraction de l’amylase.
2. Vortex les tubes par cycles : 1 min à vitesse maximale, suivi de 1 min sur glace. Répétez 10 fois.
3. Filtrer la suspension à l’aide de filtres en papier et extraire mécaniquement le surnageant par pression.
4. Clarifier le surnageant par centrifugation à 3000 x g pendant 15 min à 4 °C.
5. Utilisez l’extrait brut directement ou purifiez davantage l’enzyme via la chromatographie sur colonne ou des filtres centrifuges. Des études cinétiques sont également recommandées pour déterminer la constante de Michaelis (Km) et le taux maximal de transformation enzymatique (Vmax)¹².

6. Processus d’optimisation

REMARQUE : Optimisez ce protocole en évaluant et en ajustant la qualité et la concentration des inducteurs, ainsi que le type et la concentration de l’inoculum.

1. Déterminez le temps de fermentation idéal et affinez les étapes d’extraction pour améliorer l’efficacité.
2. Contrôlez et ajustez avec précision les conditions environnementales, y compris la température, le pH et l’aération.
3. Testez divers tampons et conditions d’extraction pour améliorer le rendement et la stabilité de l’enzyme.
4. Effectuer des analyses statistiques, telles que la méthodologie de surface de réponse, pour identifier les variables les plus influentes et obtenir une production enzymatique optimale.

Résultats

La figure 1A présente la représentation schématique du mélangeur rotatif utilisé dans ce système, qui a une capacité de six tubes coniques de 50 ml. La figure 2B illustre les changements qui se produisent dans le son de blé pendant le conditionnement avant d’entrer dans le processus de fermentation à l’état solide. Comme nous l’avons vu, aucun changement structurel significatif n’a été observé.

La figure 2 montre la saturation du son de blé après 6 jours de fermentation à l’état solide pour la production de chitinase par le champignon Trichoderma harzianum dans ce système, en utilisant la chitine commerciale comme inducteur. La figure 2A montre le matériau d’origine avant le processus de fermentation. Les micrographies confirment l’utilisation du substrat par le champignon, ce qui se reflète également dans les modifications qu’il subit, perdant sa structure fractale en raison de l’interaction avec le champignon.

Les résultats de la figure 3 montrent une augmentation significative de l’activité de la chitinase (figure 3A) et de l’activité de l’amylase (figure 3B) obtenues chez T. harzianum et Aspergillus lentulus, respectivement, lorsque l’on compare les systèmes de fermentation à l’état solide (SSF) et de fermentation submergée (SmF). Les données ont été validées par une ANOVA à un facteur et un test de Tukey avec p < 0,05 à l’aide du logiciel SigmaPlot. Dans ce contexte, on observe que ce système est applicable à différentes activités enzymatiques et champignons. A. lentulus a été caractérisé comme un champignon thermotolérant, incubé à 40 °C, montrant une augmentation significative de son activité amylase. Les résultats de l’activité de la chitinase de T. harzianum dans la fermentation liquide et solide ont déjà été rapportés séparément par notre groupe de recherche ^2,5, ces travaux confirmant et comparant une augmentation significative de la SSF par rapport à la SmF, similaire à l’activité de l’amylase. Notre groupe a travaillé avec plus de 50 souches fongiques pour la production de protéases et d’amylases dans des conditions mésophiles et thermophiles, et les résultats sont cohérents.

Les résultats confirment le succès du protocole en démontrant des augmentations significatives de l’activité enzymatique, la fermentation à l’état solide donnant des rendements plus élevés par rapport à la fermentation submergée. Cela indique l’efficacité de la SSF dans l’amélioration de la production de chitinase et d’amylase. Les figurines précédemment publiées ont été réutilisées avec l’autorisation de réimpression appropriée.

Figure 1 : Vue d’ensemble du système de fermentation à l’état solide rotatif (SSF) et du processus de prétraitement du son de blé. (A) Représentation schématique du système SSF rotatif. (B) Modifications du processus de prétraitement du son de blé : (I) Matière première initiale, (II) Son de blé humide après l’étape de lavage, (III) Son de blé séché. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Saturation du substrat par Trichoderma harzianum. (A) Substrat avant SSF. (B, C) Substrat saturé de mycélium fongique à différents grossissements. Barres d’échelle : (A), 50 μm ; (B), 200 μm ; (C), 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Activité enzymatique dans la SSF et la fermentation submergée (SmF) par T. harzianum et A. lentulus. Comparaison de (A) la formation de glucosamine par l’hydrolyse du chitosane par les enzymes produites par Trichoderma harzianum dans SSF et SmF, et (B) l’activité amylase d’Aspergillus lentulus obtenue dans SSF et SmF. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de trois répétitions. Les astérisques (*) indiquent une différence statistiquement significative entre les données. Il convient de noter que la variation statistique est spécifique à chaque type d’enzyme et ne s’applique pas aux comparaisons entre (A) et (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Cette étude décrit un protocole pertinent pour optimiser la production d’enzymes par des systèmes de fermentation à l’état solide (SSF), spécifiquement conçus pour les champignons filamenteux. Ci-dessous, les aspects critiques de la méthodologie sont discutés, ainsi que son importance, ses limites et ses applications potentielles.

Le succès du protocole dépend fortement d’étapes clés telles que la préparation du substrat et de l’inoculum. Un lavage et un séchage appropriés du son de blé sont essentiels pour éliminer les impuretés qui peuvent interférer avec la croissance fongique ou la production d’enzymes. De plus, l’ajustement minutieux de l’humidité du substrat pour maintenir l’humidité relative au-dessus de 90 % assure une colonisation et une activité fongiques optimales¹³. Le fonctionnement du système rotatif à 10 tr/min est un autre paramètre crucial, car il favorise un mélange et une oxygénation uniformes, empêchant l’agglutination du substrat et assurant une croissance fongique uniforme¹⁴.

L’adaptabilité de ce protocole réside dans sa compatibilité avec diverses espèces fongiques et inducteurs. Par exemple, alors que la chitine et l’amidon commerciaux ont été utilisés comme inducteurs dans cette étude, d’autres substrats, tels que la lignine, la cellulose ou le chitosane, pourraient être substitués en fonction de l’enzyme cible. Le dépannage des problèmes courants, tels que la colonisation inégale du substrat, implique d’affiner les paramètres de mélange ou d’ajuster la concentration d’inoculum². En outre, il est essentiel d’assurer la stérilité lors de la préparation et de l’inoculation du substrat pour prévenir la contamination, en particulier dans les applications à l’échelle industrielle¹⁵.

Bien que la SSF offre plusieurs avantages par rapport à la fermentation submergée (SmF), elle n’est pas sans limites¹⁶. L’un des principaux défis consiste à mettre à l’échelle le système SSF rotatif sans compromettre le mélange du substrat, la diffusion de l’oxygène ou la détermination précise de la biomasse, un autre problème courant dans les SSF^17,18. De plus, le fait que le protocole s’appuie sur des résidus agro-industriels tels que le son de blé peut introduire une variabilité dans les résultats en raison des différences de composition du substrat entre les lots. Ces limitations mettent en évidence la nécessité d’une optimisation supplémentaire lors de la transition vers la production à grande échelle^19,20.

Le système SSF rotatif décrit présente des avantages significatifs par rapport aux méthodes statiques traditionnelles SSF et SmF. Par rapport à la SSF statique, le système rotatif assure une croissance microbienne plus uniforme, réduisant ainsi les problèmes liés aux limitations en oxygène. De plus, l’adaptabilité du système permet son application à diverses formes fongiques et types d’enzymes, ce qui le rend très polyvalent¹⁸. Les systèmes SSF peuvent avoir diverses configurations pour améliorer la productivité des métabolites. Chaque type de système présente des avantages et des inconvénients qui doivent être analysés en profondeur pour déterminer la meilleure configuration. Le système SSF rotatif offre plusieurs avantages par rapport aux SSF et SmF statiques traditionnels ; cependant, il est confronté à des défis par rapport à d’autres systèmes SSF, tels que les bioréacteurs à plateaux et à lit garni. Les bioréacteurs à plateaux, couramment utilisés pour les SSF à grande échelle, offrent simplicité et faible consommation d’énergie, mais sont confrontés à des défis liés au transfert d’oxygène limité et à la distribution de l’humidité, entraînant une croissance microbienne inégale et des rendements enzymatiques réduits. Les bioréacteurs à lit garni, en revanche, améliorent l’aération grâce à un flux d’air forcé, mais peuvent rencontrer des problèmes de chute de pression et de distribution inégale de la température, en particulier dans les grandes colonnes. En revanche, le système SSF rotatif favorise un mélange continu et des conditions homogènes, réduisant les zones anaérobies et améliorant la productivité enzymatique. Néanmoins, la consommation d’énergie et l’usure mécanique dues à la rotation continue peuvent augmenter les coûts d’exploitation²¹.

Les systèmes de fermentation statique à l’état solide, tels que les bioréacteurs à plateau, sont limités par un transfert de chaleur et de masse limité, ce qui entraîne souvent des gradients de température internes de plus de 30 °C, ce qui entraîne des performances microbiennes sous-optimales. Ces systèmes fonctionnent généralement à de petits volumes (0,15-0,25 m³) et souffrent d’une colonisation microbienne hétérogène, des études indiquant que seulement environ 34 % des pores du substrat sont utilisés efficacement. En revanche, les bioréacteurs rotatifs offrent une agitation mécanique qui améliore la distribution d’oxygène et l’homogénéité du substrat, tout en supportant des volumes opérationnels plus importants allant jusqu’à 13 m³ et des charges de substrat atteignant 40 % (p/v). Un exemple notable concerne la production de cellulase par Thermoascus aurantiacus, où un réacteur SSF rotatif maintenu à 49 °C et ventilé à 5 L/min·kg a produit 14 098 UI/g d’activité enzymatique, soit plus de trois fois plus que les 4 212 UI/g obtenus dans des conditions statiques²².

La mise à l’échelle de la fermentation à l’état solide nécessite un équilibre délicat entre le maintien de la cinétique microbienne et la garantie d’un transfert de masse et de chaleur efficace dans des systèmes de plus en plus grands. L’approche traditionnelle par étapes comprend des étapes de laboratoire (5 à 20 kg), pilotes (50 à 5 000 kg) et industrielles (25 à 1 000 tonnes). L’un des principaux défis lors de la mise à l’échelle est la dissipation de la chaleur métabolique, qui peut atteindre jusqu’à 3 200 kcal/kg de matière sèche, ce qui est particulièrement problématique dans les systèmes statiques ou mal ventilés. Pour résoudre ce problème, les stratégies de mise à l’échelle reposent souvent sur le contrôle de paramètres de conception sans dimension et l’application d’approches de modélisation mathématique, y compris des équations de bilan de masse et d’énergie, afin de préserver des variables clés telles que la disponibilité de l’oxygène et la rétention d’humidité du substrat à différentes échelles. Les systèmes à l’échelle pilote (par exemple, 150 L et 6 m³) ont réussi à intégrer des caractéristiques d’ingénierie telles que des chemises d’eau, des lames d’agitation incurvées et une humidité contrôlée pour améliorer la reproductibilité du processus et garantir des rendements de produit constants 18,21,22.

Le protocole présenté a démontré son efficacité pour la production d’enzymes à petite échelle en laboratoire. Cependant, la mise à l’échelle du processus pour les applications industrielles pose des défis importants, principalement liés au maintien d’un mélange et d’une aération efficaces dans de plus grands volumes. Une approche prometteuse pour remédier à ces limites est l’utilisation d’un réacteur à vis continue, qui imite la fonction d’un mélangeur vertical en favorisant un mélange continu et une meilleure oxygénation dans tout le substrat solide. Cette conception réduit la formation de zones anaérobies et améliore le transfert de masse, qui sont des facteurs critiques pour le succès de la fermentation à l’état solide à l’échelle industrielle ^2,15. Néanmoins, les défis potentiels comprennent le maintien de l’intégrité structurelle de la matrice solide et la prévention de la formation de gradients de température le long du réacteur. D’autres études devraient se concentrer sur l’optimisation des paramètres opérationnels et la validation des rendements enzymatiques dans des conditions de mise à l’échelle afin de garantir la faisabilité et l’efficacité du procédé.

Les applications potentielles de ce protocole s’étendent à de multiples secteurs, notamment la biotechnologie alimentaire, la bioénergie et l’assainissement de l’environnement. Par exemple, la production accrue d’enzymes hydrolytiques comme les chitinases et les amylases peut soutenir les processus de bioconversion dans l’agriculture et l’industrie. De plus, l’utilisation de sous-produits agro-industriels tels que le son de blé s’aligne sur des pratiques durables, favorisant la valorisation des déchets et contribuant à une bioéconomie circulaire²⁰.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 mL Erlenmeyer flask	Sigma-Aldrich	CLS431684	For culturing mycelium in liquid medium.
50 mL conical tube	Sigma-Aldrich	CLS430921	For storing and preparing substrates and inoculum.
Acetate buffer, pH 5.6	Sigma-Aldrich	320866	For chitinase extraction.
Centricon filters	Millipore	UFC905024	For further purification of enzymes.
Counting cells chamber	Sigma-Aldrich	Z359629	Used to count spores under a microscope.
Filter paper	Whatman	1001-110	For filtering the enzyme extract.
Hygrometer	Todomicro	-	To measure relative humidity of the substrate.
Inducer (e.g., commercial chitin)	Sigma-Aldrich	C9752	Used to enhance enzyme production during fermentation.
Phosphate buffer, pH 6.9	Sigma-Aldrich	P5379	For amylase extraction.
Potato-dextrose agar	Sigma-Aldrich	P2182	Culture medium for growing fungal mycelium.
Potato-dextrose broth	Sigma-Aldrich	P6685	Liquid culture medium for growing fungal mycelium.
Rotary mixer	Thermo-Fisher Scientific	88-861-051	To keep substrate moving during fermentation.
Salt solution components (e.g., KH2PO4, Na2SO4, KCl, etc.)	Sigma-Aldrich	Multiple	For preparing sterile salt solution, see detailed recipe in the protocol.
Wheat bran	Comercial market	-	Substrate for solid-state fermentation.